Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

Resumo

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1^{- / -} modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Resumo

O vírus Zika (ZIKV) podem induzir inflamação nos órgãos de immunoprivileged (por exemplo, o cérebro e os testículos), levando à síndrome de Guillain-Barré e danificar os testículos. Durante uma infecção com a ZIKV, as células imunes foram mostradas para se infiltrar nos tecidos. No entanto, os mecanismos celulares que definem a proteção e/ou imunopatogênese dessas células imunes durante uma infecção ZIKV ainda são em grande parte desconhecidos. Aqui, descrevemos os métodos para avaliar a funcionalidade de células T do vírus específicos nesses órgãos immunoprivileged de camundongos infectados com ZIKV. Estes métodos incluem um) uma infecção ZIKV e inoculação da vacina em Ifnar1^{- / -} ratos; b) histopatologia, imunofluorescência e ensaios de imuno-histoquímica para detectar o vírus infecção e inflamação no cérebro, testículos e baço; c) a preparação de um tetrâmero de epitopos de célula T ZIKV-derivado; d) a detecção de células T ZIKV específicos nos monócitos isoladas do cérebro, baço e testículos. Usando essas abordagens, é possível detectar as células T antígeno-específicas que infiltraram-se os órgãos immunoprivileged e avaliar as funções destas células T durante a infecção: potencial proteção imune através de vírus apuramento e / ou imunopatogênese para exacerbar a inflamação. Esses achados também podem ajudar a esclarecer a contribuição das células T induzida pela imunização contra ZIKV.

Introdução

O ZIKV é um flavivirus transmitidas por mosquitos que foi primeiramente isolado em 1947 em Uganda de um macaco rhesus febril. Recentemente, o ZIKV tornou-se uma emergência de saúde pública, devido à sua rápida disseminação nas Américas e sua ligação inesperada com microcefalia e síndrome de Guillain-Barré a^1,2,3. De dados epidemiológicos, o ZIKV tem sido suspeita ser a causa da síndrome de Guillain-Barré em cerca de 1 por 4.000 infectados adultos⁴. Além disso, uma correlação entre a infecção e danos ZIKV e testículos no modelo do rato foi demonstrada, sugerindo que a infecção de ZIKV, em determinadas circunstâncias, pode ultrapassar a barreira de sangue-testículo e eventualmente levar à infertilidade masculina⁵ . Estas descobertas destacam a importância de compreender completamente a indução de proteção ou patológicas respostas imunes durante uma infecção ZIKV.

Há ainda muito para ser aprendido sobre as respostas imunológicas celulares para o ZIKV. CD4⁺ e CD8⁺ T-cell responses to o capsídeo, envelope e proteínas nonstructural 1 (NS1) têm sido observadas em infectados ZIKV macacos e humanos^6,7,8. Em camundongos, vários estudos têm indicado que CD8⁺ T células desempenham um papel protetor no controle do ZIKV replicação^9,10,11. Importante, o Jurado et al demonstraram que uma infecção ZIKV resulta na degradação da barreira hemato - encefálica e infiltração perivascular de CD8⁺ células efetoras T dentro os testículos de Ifnar1^{- / -} ratos. Além disso, eles mostraram que CD8⁺ T células instigar paralisia associada ZIKV e parecem desempenhar um papel na Imunopatologia cérebro neonatal. Em um estudo anterior, temos preparado o tetrâmero de_294-302 ZIKV-E e mostrou aquele CD8 específicas ZIKV⁺ T existem células no cérebro e espinais de ZIKV infectados Ifnar1^{- / -} ratos, que podem ter implicações importantes para o design e desenvolvimento de vacinas ZIKV¹⁰.

Em resposta à necessidade urgente de vacinação prevenir a infecção ZIKV, várias vacinas estão em fase pré-clínica de desenvolvimento, incluindo o RNA vacinas, vacinas recombinantes baseadas em vetor e vacinas de subunidade de proteína purificada. A vacina de DNA plasmídeo está em fase de ensaios clínicos 1¹². A avaliação da segurança e eficácia das vacinas ZIKV é, portanto, importantes. Uma vantagem das vacinas é sua capacidade de eliciar respostas de células T específicas, que podem ser importantes para a proteção contra o ZIKV. Usando tetrâmeros de epítopo-relacionados ZIKV-derivado de célula T, a imunorreatividade de células T induzida por uma vacina ZIKV baseado em vetor de adenovírus poderia ser detectada em camundongos imunizados, e M e E glicoproteínas foram mostradas para induzir robusto antígeno-específicos CD8⁺ Células T imunorreatividade¹³.

Durante uma infecção de vírus, o reconhecimento de antígenos de peptídeo apresentado por moléculas de histocompatibilidade (MHC) complexas do receptor de células T (TCR) é um importante mecanismo de mediada por células-T, para proteger o hospedeiro de¹⁴. Com base nesta teoria, o tetrâmero tecnologia é uma ferramenta única para elucidar as funções que as células T antígeno-específicas jogam na regulação das respostas imunes¹⁵. Este protocolo descreve a criação do Ifnar1^{- / -} rato modelo para infecções ZIKV e a detecção de células T reativas o baço, cérebro e testículos dos ratos usando tecnologia tetrâmero. Além disso, usamos o tetrâmero de_294-302 ZIKV-E para detectar e avaliar imunorreatividade de células T induzida por uma vacina ZIKV (AdC7-M/E) em camundongos imunizados. Este estudo fornece orientação para investigar respostas de células T em órgãos immunoprivileged e fornece uma referência para as aplicações potenciais na placenta ou no cérebro fetal.

Protocolo

Experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado de Animal institucional e Comissão do Instituto Nacional de uso para Viral Disease Control and Prevention, China CDC. Todos os experimentos foram realizados seguindo os protocolos de animal aprovado Comissão de uso e cuidado institucional do Animal.

1. vírus infecção

1. Mantenha adulto (6 a 8 semanas de idade) Ifnar1 ratos^{- / -} (50% masculino e 50% do sexo feminino) no padrão isentos de agentes patogénicos (SPF) condições especiais e permitir-lhes o acesso regular a alimentos e água.
2. Infectar os Ifnar1^{- / -} ratos com o ZIKV através de uma inoculação retrô-orbital de 100 µ l de ZIKV em um buffer de (PBS) salino tampão fosfato contendo 1 x 10⁴ foco-formando unidades (FFUs) do vírus. Da mesma forma, fornecem controle de ratos com um volume igual de PBS.
   Cuidado: Infectar os ratos sob condições ABSL2 e executar estes procedimentos com camundongos infectados por vírus no armário a biossegurança.
3. Monitore o peso e sinais clínicos (tremores, março escalonado, bilateral membro flácido do posterior) dos ratos diariamente por 15 dias.

2. a imunização com a vacina ZIKV

1. Use Ifnar1 ratos^{- / -} (50% masculino e 50% feminino) entre 6 e 8 semanas de idade. Manter os ratos em condições padrão do SPF de 18 – 29 ° C e um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso à comida e água.
2. Imunizar os Ifnar1^{- / -} ratos com a vacina ZIKV: injetar 100 µ l de AdC7-M/E [4x10¹⁰ (partículas de vírus)] em PBS de buffer através de uma injeção intramuscular (via i.m.), utilizando uma seringa de 1 mL com agulha 23-G.
3. Da mesma forma, injete o controle de ratos com um volume igual de PBS.

3. isolamento dos monócitos do baço

Nota: O isolamento dos monócitos do baço é descrito como mencionado anteriormente,¹⁶.

1. Anestesia a post-inoculação de 7D ratos imunizados e ZIKV infectadas, usando um concentrationin de isoflurano 5% oxigênio 100% (com uma taxa de fluxo de 1 L/min). Eutanásia em ratos por deslocamento cervical. Então, imediatamente mergulhe o mouse todo 75% de etanol.
   PRECAUÇÃO: desta etapa em diante, todos os procedimentos experimentais devem ser realizados em condições assépticas em uma armário de biossegurança.
2. Usando agulhas, correção dos membros dos ratos (eutanásia, previamente imunizados/infectados) na placa de espuma com o abdômen voltado para cima.
3. Cortar a pele ao longo da linha média abdominal para o tórax com um bisturi estéril, corte os músculos abdominais com uma tesoura, expor a cavidade abdominal e remova cuidadosamente o fígado.
   Nota: O órgão longo, vermelho-escuro à esquerda do estômago é o baço.
4. Remover o baço, enxaguá-lo 3x em PBS para remover qualquer sangue e colocá-lo em 1,5 mL de meio de Roswell Park Memorial Institute gelado (RPMI). Manter o baço no gelo.
5. Para gerar uma suspensão de célula única do baço, coloque os órgãos (com) em um filtro de célula de estéril 40 µm-malha em cima de um tubo de 50 mL e adicionar 2 mL de gelado RPMI médio contendo 10% fetal de soro bovino (FBS). Usando o êmbolo de uma seringa de 5 mL, mecanicamente amasse os órgãos (com) e adicionar médio até que o órgão foi totalmente moído através da malha.
6. Transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifuga-lo a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
7. Ressuspender as células com 5 mL de um número de glóbulos vermelhos (RBC) lise (NH₄Cl, Na₂EDTA e KHCO₃; consulte a Tabela de materiais) e incubar a reação de Lise em temperatura ambiente por 5-6 min.
8. Parar a Lise RBC com 10 mL de meio RPMI/FBS gelado e centrifugar o tubo a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
9. Ressuspender as células com 10 mL de meio RPMI completo (RPMI com 10% vol/vol FBS e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina). Transferência de 10 µ l de suspensão de células para um tubo pequeno, misturá-lo com 10 µ l de 0,4% wt/vol trypan azul e contar o número de células usando um hemocytometer.

4. isolamento de monócitos do cérebro e os testículos

1. Anestesia a post-inoculação de 7D camundongos machos infectados ZIKV, usando 5% isofluranein 100% oxigênio (com uma taxa de fluxo de 1 L/min). Eutanásia em ratos por deslocamento cervical. Então, imediatamente mergulhe o mouse todo 75% de etanol.
   Cuidado: Desta etapa em diante, todos os procedimentos experimentais devem ser efectuados assepticamente em uma armário de biossegurança. O isolamento de monócitos do cérebro e testículos é descrito como mencionado anteriormente,¹⁷.
2. Imobilize um rato masculino (eutanásia, anteriormente infectado) na posição de bruços sobre uma placa de corte.
3. Proteger o couro cabeludo com um fórceps de 1x2 dentes reta e use tesoura de Iris para fazer uma incisão no couro cabeludo para expor o crânio.
4. Prenda os dois lados das órbitas com Pinças afiadas e consertar o cérebro. Colocar uma ponta afiada tesoura de Iris no foramen magnum e cortar lateralmente no crânio. Repita este passo para o outro lado.
5. Uso em ponto Iris tesouras para cortar cuidadosamente da cavidade mesma, acima da linha mediana, em direção ao nariz. Tente manter a ponta da tesoura tão superficial quanto possível para evitar ferir o cérebro.
6. Levante o cérebro com fórceps e usar tesouras afiadas de Iris para dissecar cuidadosamente as fibras de nervos cranianos. Remover o cérebro com pinça e colocá-lo em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio de RPMI/10% FBS gelado.
7. Pegue a pele abdominal com fórceps e usar tesoura afiada de Iris para fazer uma incisão longitudinal através do tegumento e a parede abdominal e expor a parte inferior do abdômen. Empurre os testículos até a incisão. Suavemente, puxe a camada de gordura com uma pinça e expor um testículo globular em ambos os lados.
8. Uso Iris afiada tesoura para dissecar cuidadosamente a camada de gordura e epidídimo. Coloque os testículos em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio de RPMI/10% FBS gelado com fórceps.
9. Para gerar uma suspensão de célula única do cérebro ou testículos, coloque o órgão em um coador de célula estéril com uma malha de 100 µm em cima de um tubo de 50 mL e adicionar 2 mL do meio de RPMI/10% FBS gelado. Usando o êmbolo de uma seringa de 5 mL, amasse o órgão e adicionar médio até que o órgão foi totalmente moído através da malha.
10. Transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifuga-lo a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
11. Ressuspender as células com 5 mL de meio gradiente de densidade de 30% e, em seguida, adicioná-los muito lentamente a 2 mL de 70% médio gradiente de densidade em um tubo de 15 mL.
12. Desligue o freio e centrifugar os tubos a 4 ° C a 800 x g durante 30 min. obter os linfócitos da camada média.
13. Transfira a interfase para um tubo de 15 mL a fresco, adicionar 10 mL de meio frio RPMI/10% FBS e centrifugar o tubo a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
14. Ressuspender as células com 10 mL de meio RPMI/FBS gelado e centrifugá-los a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
15. Ressuspender as células com 10 mL de meio RPMI completo e contar o número de células como no passo 3.9.

5. tetrâmero preparação

1. Construa o plasmídeo expressando os domínios extracelulares do H-2D^b com uma marca de site biotinilado no C-terminal do domínio α3 e a β₂m usando o vetor de pET28a com um NdeI e XohI restrição local¹⁸.
2. Express e preparar os corpos de inclusão de_{H-2D^b e β 2m conforme descrito anteriormente,²⁰}.
3. Renaturalização e purificar o peptídeo/MHC complexo H-2D^b-E_294-302.
   1. Prepare 200 mL de uma solução redobramento [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginina, 2 mM de EDTA-Na, GSG de 5 mM e 0,5 mM GSSG]. Adicionar inibidores de protease: 2 mL de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF, estoque 100 mM), 100 µ l de pepstatin (estoque 2 mg/mL) e 100 µ l de leupeptin (estoque 2 mg/mL). Legal o buffer a 4 ° C por 30 min.
   2. Adicione o peptídeo, β₂m e^bH-2D para a solução de redobramento.
      1. Injete 500 µ l de β₂m dissolvido em uma solução de guanidina (estoque de 30 mg/mL), utilizando uma seringa. Para isso, use uma agulha 23G com uma seringa de 5 mL e injectar a solução redobramento gota a gota o β₂m. Manter a solução constantemente e lentamente mexendo a 150 rpm a 4 ° C.
      2. Depois de β₂m foi dissolvido na solução redobramento, resolver 2 mg de peptídeo de_294-302 E em 200 µ l de DMSO e injetá-lo rapidamente na solução redobramento usando uma pipeta. Lentamente, mexa a solução a 150 rpm a 4 ° C por 15 min.
      3. Injecte 1,5 mL de H-2D^b dissolvido em uma solução de guanidina. Mantenha o giro de bar agitação a 150 rpm para o dobrar do H-2D^b a 4 ° C para 8 – 10 h.
         Nota: A solução foi colocada em uma caixa fechada em uma sala fria.
   3. Concentre a proteína reaberta em uma câmara pressurizada com uma membrana de kDa 10. Trocar o buffer [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mm NaCl] para a câmara e concentrá-lo até um volume final de 30-50 mL.
   4. Transferir a redobramento solução para um tubo de centrífuga e girá-lo a 2.500 x g durante 15 min a 4 ° C.
   5. Com cuidado, transfira o sobrenadante para um filtro centrífugo de kDa 10 e mais concentrá-lo até um volume final de 500 µ l a 2.500 x g durante 30 min.
   6. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e girá-lo a 12.000 x g durante 15 min. Purify a proteína com S200 10/300 GL filtration cromatografia de gel.
   7. Recolher o pico complexo MHC e concentrá-lo até um volume final de 350 µ l.
4. Para gerar um volume de reação de 500 µ l para biotinylation, adicionar os regentes na seguinte ordem: 100 µ l da solução A [0.5M bicine (pH 8,3)], 100 µ l da solução B (100mm ATP, 100 mM MgOAc, 200 biotina µΜ), 100 µ l de extra d-biotina (biotina 500 de µΜ) , 20 µ l da enzima BirA (60 µ g), 0,5 µ l de pepstatin (2 mg/mL) e 0,5 µ l de leupeptin (2 mg/mL). Incubar o tubo de reação durante a noite a 4 ° C.
   Cuidado: Não adicione qualquer EDTA para a reação de biotinylating.
5. Purificar o MHC usando um S200 coluna de filtração de gel 10/300 GL para remover qualquer biotina extra.
6. Determine a eficiência de biotinylating com um ensaio de streptavidin-turno¹⁸.
   1. Prepare-se três amostras, A, B e C, em gelo por 30 min. Em seguida, analisar os resultados em um 10% SDS-PAGE. A amostra consiste em 8 µ l de moléculas de MHC biotinilado e 2 µ l de tampão de troca, amostra B de 8 µ l de moléculas de MHC biotinilado e 2 µ l de estreptavidina (20 mg/mL) e amostra C 2 µ l de estreptavidina (20 mg/mL) e buffer de câmbio 8 µ l.
      Atenção: Não ferva a amostra.
7. Formar oriundas das moléculas de MHC de biotinilado.
   1. Produzir o tetrâmero misturando o biotinilado E_294-302 peptídeo-H₂D^b complexo com estreptavidina ficoeritrina-rotulado na proporção de 1:5 para assegurar uma ligação completa de todas as moléculas de MHC biotinilado mole.
   2. Calcule a quantidade de necessária para tetramerization streptavidin-conjugado.
      1. Determinar as toupeiras dos complexos MHC/peptídeo contabilizando o peso molar e a concentração de proteína (exemplo: 1,8 mg de proteína total = 40 nmol).
      2. Calcular as toupeiras do streptavidin-conjugado necessário dividindo as toupeiras do MHC/peptide por 5 (exemplo: 40/5 = 8 nmol de streptavidin-conjugado).
      3. Calcular a quantidade de estreptavidina necessária (em µ g) dependendo o streptavidin-conjugado (exemplo: streptavidin-PE [300.000 g/M] → 8 nmol necessário = 2.400 g).
   3. Streptavidin-ficoeritrina, divida em 10 amostras. Adicione a cada amostra para um tubo contendo o biotinilado E_294-302 peptídeo-H₂D^b complexo, com um intervalo de 20 min. Depois de carregar a última amostra, incube o tubo de reação a 4 ° C durante a noite, no escuro.
8. Aplicam-se os reagentes de multimerized em um tubo de centrifugação de 100 kDa e concentrá-la por centrifugação a 2.000 x g a 4 ° C para um volume de < 100 µ l.
9. Diluir a amostra no tubo de centrifugação de 4 mL com PBS (pH 8.0) e concentrá-la novamente para < 100 µ l.
10. Repita a troca de amortecedor passo em PBS (pH 8.0) x 4.
11. Preencher o volume total novamente a 500 µ l utilizando PBS (pH 8.0). Concentrar a amostra a uma concentração estimada de 2-2,5 mg/mL a 2.000 x g a 4 ° C. Armazenar a amostra no escuro a 4 ° C.

6. fluxo Cytometry

1. Incube as suspensões celulares (de passo 3.9 e/ou etapa 4.15) a 4 ° C, com 0,1 µ l de reagente bloqueio de anti-murino Receptor Fc-CD16/CD32 por 20 µ l (1: 200 do fator de diluição) por 10 min, para evitar qualquer ligação inespecíficas.
2. Centrifugar o tubo tetrâmero a 20.000 x g durante pelo menos 15 min a 4 ° C.
3. Adicione 20 µ l de suspensão de célula para um platecontaining de 96 poços 1 x 10⁶ células cada poço.
4. Prepare um volume suficiente de mistura E_294-302 tetrâmero manchar todos os tubos experimentais. Prepare um excesso de 15% do volume total desta mistura para conta para erros de pipetagem. Diluir os tetrâmeros_294-302 E (2 mg/mL, 1 µ l/teste) no buffer de FACS (PBS, 0,5% FBS) para que 20 µ l da mistura E_294-302 tetrâmero é adicionado para cada teste.
5. Adicione 20 µ l do mix tetrâmero_294-302 E a placa de 96 poços. No final desta etapa, o volume final em cada poço deve ser 40 µL.Incubate a placa no escuro em temperatura ambiente por 30 min.
6. Adicionar os anticorpos primários (conjugado FITC ou APC-conjugado anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-conjugado anti-CD8 (0,2 mg/mL)) em 1 µ l/teste à suspensão de células e, em seguida, ele incube a 4 ° C por 30 min no escuro.
7. Lavar as células 2 x com 2 mL de tampão de FACS e centrífuga-los a 600 x g durante 5 min. cuidadosamente Aspire o sobrenadante e ressuspender as células com 200 µ l de tampão de FACS.
8. Armazene as amostras temporariamente a 4 ° C no escuro até a análise de fluxo cytometric.
9. Use a seguinte estratégia associada para a análise do fluxo cytometric.
   1. Crie um portão no singletos diagonalmente em cluster através da representação gráfica da área de dispersão (SSC) uma dispersão para a frente (FSC) contra lateral.
   2. Em seguida, portão na CD3⁺ células pelo lado dispersão (CCD) contra CD3; em seguida, portão na CD3⁺ CD8⁺ células; Finalmente, delinear CD8^{+ +} de tetrâmero células¹⁹.

7. histopatologia, imunofluorescência e o ensaio imuno-histoquímica

1. Ensaio de histopatologia
   1. Recolher os tecidos cerebrais e testículo do Ifnar1 infectadas ZIKV^{- / -} ratos 7D pós-vacina e corrigi-los em formol neutro de buffer de 4%.
      PRECAUÇÃO: Paraformaldehyde é tóxico; Use equipamento de protecção adequado.
   2. Incorpore o tecido em parafina.
   3. Secção do tecido em 5 mm, utilizando um vibratome.
   4. Manche o tecido com hematoxilina e eosina (H & E).
2. Ensaio de imuno-histoquímica
   1. Deparaffinize, hidratar e recuperar o tecido do antígeno seções, com base em procedimentos descreveram anteriormente²¹.
   2. Tratar as seções de tecido com 3% H₂O₂ em PBS (pH 7,6) por 10 min e bloqueá-los com 1% albumina de soro bovino (BSA) por 10 min.
   3. Incubar os cortes histologicos anticorpos do rato anti-rato CD3 (diluição: 1/1.000) para 8 h à temperatura ambiente e, em seguida, incube-os a 4 ° C durante a noite.
   4. Lave os tecidos com PBS e, em seguida, incube-os com 3 gotas de anticorpo secundário biotinilado (diluição: 1/1.000) para 2 h à temperatura ambiente, seguido de 3 gotas de avidina-biotina-peroxidase (diluição: 1/200) à temperatura ambiente por 30 min.
   5. Vincular, com 3 gotas de 30, 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (diluição: 1/1.000), conforme descrito anteriormente,²².
   6. Counterstain as seções de tecido com hematoxilina de Mayer.
3. Ensaio de imunofluorescência
   1. Secar ao ar livre as seções congeladas do testículo (6 mm) por 10 min à temperatura ambiente.
   2. Corrigi-los com acetona gelada por 10 min.
   3. Lave as seções com PBS para 3x e bloqueá-los com um tampão de bloqueio (BSA 1%, 0.3% Triton, 1X PBS) a 37 ° C por 30 min.
   4. Incubar as secções de tecido com anticorpo primário (Z6) (20 µ g/mL) a 4 ° C durante a noite.
   5. Lave os tecidos com PBS e aplicar o anticorpo secundário (factor de diluição: 1/200) para 1 h a 37 ° C.
   6. Lave as seções de tecido com PBS e counterstain-los para núcleos usando 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (factor de diluição: 1/1.000), seguindo as instruções do fabricante.

Resultados

Seguindo esses métodos, nós desenvolvemos um modelo murino de infecções ZIKV. Ifnar1^{- / -} ratos em 6-8 semanas de idade foram infectados com 1 x 10⁴ unidades formadoras de foco (FFU) do ZIKV por retroorbital injeção. Sintomas patológicos e sinais (Figura 1A), bem como alterações de peso (Figura 1B), foram observadas em ratos Ifnar1^{- / -} após uma infecção com o ZIKV. O cérebro murino mostrou óbvio edema e hiperemia (Figura 1C). Enquanto isso, os testículos encolheram gradualmente (Figura 1D). Além disso, as alterações patológicas e a destruição de tecido foram encontrados no cérebro e testículos(Figura 2). Foi realizado um ensaio de imunofluorescência para detectar o ZIKV do cérebro e testículos (Figura 2B). Cargas virais elevadas foram detectadas no cérebro e no testículo por imunocoloração (Figura 2B). Imuno-histoquímica mostrou uma infiltração robusta do CD3⁺ T células no cérebro de ratos após a infecção com o ZIKV (Figura 2C).

Para detectar e avaliar as respostas de células T específicas ZIKV, preparamos um rato MHC-eu tetrâmero de_294-302 - E H-2D^b. O peptídeo E_294-302 pode ajudar a renaturalização de^b H-2D corretamente e produzir uma quantidade elevada de MHC solúvel-eu(Figura 3). No ensaio de turno, uma alta eficiência em biotinylation podia ser observada (Figura 3B). Posteriormente, três streptavidin fluorescência (APC, PE e BV421) - com a tag pMHC - eu tetrâmeros foram produzidos para detectar células T ZIKV específicos (Figura 3C). O tetrâmero PE-rotulado tinha uma maior eficácia para detectar o CD8 específicas⁺ células T em comparação com os APC - e BV421-rotulado tetrâmeros, embora a diferença não foi estatisticamente significativa.

Usando o tetrâmero de_294-302 E, detectamos linfócitos T ZIKV específicas no baço de ratos infectados por citometria de fluxo no pós-inoculação de 7D da ZIKV (3.49 ± 0,45%). Além disso, semelhante ao método descrito na seção 3 do presente protocolo, com pós-imunização 4 semanas da vacina AdC7-M/E, linfócitos T específicos ZIKV foram detectados no baço (6.89 ± 1,36%) (Figura 4).

Além disso, detectamos os linfócitos infiltrou-se em órgãos immunoprivileged, tais como o cérebro e os testículos, após a infecção ZIKV. Os portões foram definidos para selecionar para CD3⁺CD8⁺ T células em linfócitos totais do cérebro e testículos. Uma alta proporção das células T E_294-302 tetrâmero específicos pode ser detectada no cérebro (42,2% no CD3⁺CD8⁺ T células) e o testículo (26,4% no CD3⁺CD8⁺ T células) linfócitos (Figura 5).

Figura 1 : Caracterização da infecção em camundongos de Ifnar1^{- / -} ZIKV. Ifnar1^{- / -} ratos em 6-8 semanas de idade foram infectados com 10 unidades de foco-formando⁴ (FFU) do ZIKV por injeção retroorbital, e ratos injetados com PBS foram usados como controles não infectados. A morfologia do (A) e (B) as alterações de peso dos infectados Ifnar1^{- / -} ratos foram monitoradas. As setas vermelhas indicam Ifnar1^{- / -} ratos apresentados com myeloparalysis e paraparesia motor após a infecção. (C) cérebros no pós-inoculação 7D e testículos (D) em 0, 7, 14 e 30 dias pós-inoculação foram colhidos. Imagens representativas do cérebro e os testículos de ratos são mostradas com uma régua para indicar os tamanhos. As barras de erro representam a média ± SEM. n = 10 ratos por grupo por experiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Deteção dos linfócitos no cérebro e testículo de ratos de ZIKV infectados Ifnar1^{- / -} e ZIKV. (A), este painel mostra alterações histopatológicas no cérebro e os testículos de ratos infectados com ZIKV em comparação com controles negativos na pós-inoculação 7D. Barra de escala = 25 µm (painel esquerdo) e 50 µm (painel direito). (B) uma imunofluorescência ensaio foi realizado com o anticorpo de Z6 anti-ZIKV (verde). Todas as amostras de tecido foram coletadas de camundongos infectados com ZIKV na pós-inoculação 7D. Os núcleos estavam manchados com DAPI (azuis). Barra de escala = 50 µm. (C) imuno-histoquímica mostra uma infiltração robusta do CD3⁺ T células no cérebro e testículos. Barra de escala = 25 µm (painel esquerdo) e 50 µm (painel direito). Roxo indica hematoxilina, marrom representa o anticorpo CD3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Preparação de pMHC de ZIKV-específicos-eu tetrâmeros. (A), a vinculação do E_294-302 para H-2D^b é elucidado por um em vitro dobrar. Azul indica a proteína de_294-302 - E H-2D^b. Laranja representa o controle negativo sem peptídeo. (B), este painel mostra o ensaio de turno do H-2D^b-E_294-302 . (C) a simulação representa um controle de PBS. Três streptavidin fluorescência (APC, PE e BV421) - com a tag pMHC - eu tetrâmeros foram usados para detectar células T ZIKV específicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Fluxo cytometric análise de vírus específicos CD8 ⁺ Células T no baço de ratos infectados com ZIKV e vacina-imunizadas. Ifnar1^{- / -} ratos em 6-8 semanas de idade também foram infectados com 10 unidades de foco-formando⁴ (FFU) de ZIKV ou receberam uma dose única de 4 x 10¹⁰ partículas virais de AdC7-M/E ou PBS como controlo negativo. Após 7 dias pós infecção ou vacinação após 4 semanas, rato splenocytes foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo. Os dados são apresentados como média ± SD. estatística análise foi realizada utilizando ANOVA One-Way (não significativo: P > 0,05; *P < 0,05; * *P < 0,01; * * *P < 0,001; * * *P < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 5 : ⁺ T gating resultados estratégia e representante de vírus específicos CD8 as células do cérebro e os testículos de camundongos infectados com ZIKV. Parcelas representativas são mostradas para os linfócitos infiltrados no (A) o cérebro e (B), o testículo. Uma sucessão de gates é definida para selecionar linfoide-scatter⁺ e CD3⁺ eventos. Destes, CD8⁺ eventos são bloqueados para a análise de células T de epítopo específico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Discussão

Epítopo de célula T imunogênico desempenha um papel importante na imunidade celular contra patógenos²³. Assim, a detecção de células T ZIKV específicos em órgãos immunoprivileged é uma metodologia crítica para compreender as respostas de células T contra a infecção natural de ZIKV. Entretanto, a detecção de resposta de células T é uma excelente ferramenta para investigar a eficácia da vacina viral. Aqui, nós mostramos um protocolo abrangente para visualizar as experiências, que incluem o isolamento de linfócitos de baço, cérebro e testículos de ratos infectados com ZIKV, a preparação do imunodominantes epítopo E_294-302 tetrâmero e o reconhecimento de CD8 específicas ZIKV⁺ T células em órgãos immunoprivileged de camundongos infectados com ZIKV.

Um estudo anterior mostrou que um ZIKV ao vivo ou seu RNA pode ser detectado no sêmen de pacientes do sexo masculino, que indica que o ZIKV pode ultrapassar a barreira de sangue-testículo e se replicar no sistema reprodutivo de²⁴. Anteriormente, nós também mostrou que a ZIKV pode causar danos de testículos e levar à infertilidade masculina em ratos²⁵. Infecção ZIKV pode levar a virémia no macaco rhesus, e o RNA viral pode ser detectado no sistema nervoso central (SNC), bem como nos órgãos viscerais. Imuno-histoquímica revelou que antígenos específicos ZIKV foram apresentados no CNS e os vários órgãos periféricos²⁶. Também, em modelos murino, infecção ZIKV pode induzir um robusto CD8 antiviral⁺ resposta de células T no baço e no CNS²⁶.

Comparado aos trabalhos anteriores, este estudo estabelece métodos sistemáticos para detectar CD8 específicas ZIKV⁺ células T respostas do cérebro e os testículos, que são sites de immunoprivileged. É importante avaliar a funcionalidade de células T de vírus específicos nos órgãos dos ratos infectados com ZIKV immunoprivileged. O uso de tetrâmeros para detectar CD8 específicas ZIKV⁺ células T respostas em órgãos immunoprivileged iria aumentar consideravelmente a nossa compreensão de infecções ZIKV e suas respostas imunes do anfitrião. Usando o tetrâmero de_294-302 E, as células T vírus específicos no cérebro e testículo podem ser isoladas por citometria de fluxo, para investigar os mecanismos celulares de proteção e imunopatogênese durante uma infecção ZIKV. Entretanto, é útil para pesquisadores investigar mais profundamente as funções do CD8⁺ T células para controlar o ZIKV, ou para realçar a imunopatogênese nesses órgãos durante a infecção ZIKV.

Para analisar o CD8 murino antígeno-específicas⁺ células T respostas nos órgãos immunoprivileged, estamos preparados tetrâmero de_294-302 - E H-2D^be detectado o CD8⁺ T células por citometria de fluxo. Tetrâmeros são uma poderosa ferramenta para detectar as células T antígeno-específicas. Aqui, três tipos de estreptavidina conjugada com fluorocromo (APC, PE e BV421) foram gerados. Embora existam sem diferenças estatisticamente significativas na APC-, BV421-e PE-rotulado tetrâmeros para a detecção de células T antígeno-específicas pMHC PE-rotulados-eu tetrâmeros renderam os melhores resultados. Daí, o tetrâmero PE-etiquetado foi utilizado ao longo deste estudo. Curiosamente, baseia o tetrâmero de_294-302 - E H-2D PE-etiquetado^b, detectamos elevados rácios das células T antígeno-específicas no cérebro e os testículos, que indicam a capacidade de migração das células T do sangue para vírus específicos immunoprivileged órgãos.

No entanto, existem algumas limitações para o protocolo. O tetrâmero de_294-302 - E H-2D^bnão é útil para a deteção de células T humana, porque tetrâmero detecção é dependente de restrição MHC. O rastreio de peptídeos imunodominantes de HLA-restrito ainda é necessária. Além disso, infecção retrô-orbital é eficaz para uma infecção ZIKV... mas pode não ser uma operação conveniente para alguns investigadores. Assim, outras vias de infecção, incluindo peritoneal, subcutânea ou intravenosa, também são recomendadas.

O protocolo descrito aqui, um passo fundamental é o isolamento de monócitos do cérebro e testículos. É importante adquirir a qualidade de linfócitos; assim, é importante prestar atenção, por exemplo, a velocidade centrífuga, a força do tecido moagem e a dissecação do tecido cerebral e testículo. Além disso, para a preparação de tetrâmero, inibidores de protease (PMSF, pepstatin, leupeptin) são úteis quando protegendo uma proteína a ser degradada. Portanto, faz sentido adicionar um inibidor de protease para o buffer de redobramento e trocar o buffer durante o processo de preparação do tetrâmero.

Em conclusão, apresentamos os métodos de detecção de respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1^{- / -} modelo do rato para uma infecção ZIKV. Esta plataforma pode ser amplamente aplicada para investigar os mecanismos imunes de emergentes e re-emergentes vírus que podem ignorar as barreiras entre o sangue e os órgãos de immunoprivileged. Além disso, este estudo pode pavimentar o caminho para o futuro desenvolvimento de vacinas do candidato e imunoterapias.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z6	our lab		Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated	CWBIO	CW0115
FITC anti-mouse CD3	Biolegend	17A2
APC anti-mouse CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-mouse CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides	Scilight-peptide		Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Must be stored at 4 °C
DMSO	MP	219605590	Store at room temperature.
APC-Streptadivin	BD	554067	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin	BD	554061	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Must be stored at 4 °C
Cell Strainers	BF	BF10-5040	Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	Store at room temperature.
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific
FACS Cantol			Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
red blood cell lysis buffer	Solarbio	R1010	Store at 4 °C.