감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

요약

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1^-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

초록

Guillain-바레 증후군을 선도 하 고 고환을 손상 Zika 바이러스 (ZIKV) immunoprivileged (예를 들어, 뇌와 고환), 장기에 염증을 일으킬 수 있습니다. ZIKV 감염, 동안 면역 세포 조직에 침투 하기 위해 표시 되었습니다. 그러나, ZIKV 감염 시 보호 및 이러한 면역 세포의 immunopathogenesis를 정의 하는 셀룰러 메커니즘 여전히 크게 불명 하다. 여기, 우리는 ZIKV에 감염 된 쥐의이 immunoprivileged 장기에서 바이러스 전용 T 세포 기능을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 포함 한) ZIKV 감염 및 Ifnar1^/- 생쥐에서 백신 접종 b) histopathology, 면역 형광 검사, 및 뇌, 고환, 비장;에서 바이러스 감염과 염증 감지 immunohistochemistry 분석 실험 c)의 ZIKV에서 파생 된 T-세포 epitopes; tetramer의 준비 뇌, 고환, 비장에서 분리 하는 monocytes에 ZIKV 전용 T 세포의 d) 검색. Immunoprivileged 기관으로 침투 하는 항 원 특정 T 세포를 감지 하 고 감염 기간 동안이 T 세포의 기능을 평가 하는 이러한 방법을 사용 하 여,: 잠재적인 면역 보호를 통해 바이러스 정리 및 염증을 악화 또는 immunopathogenesis. 이러한 연구 결과 또한 ZIKV에 대 한 예방 접종에 의해 유도 된 T 세포의 기여를 명확히 하는 데 도움이 있습니다.

서문

ZIKV 이다 모기 부담 flavivirus는 먼저 격리 하 1947 년에 우간다에 열 병 붉은 털 원숭이. 최근에 ZIKV 공중 보건 비상 사태를, 아메리카 및 그것의 예기치 않은 링크 microcephaly Guillain-바레 증후군^1,2,3를 그것의 급속 한 보급으로 인해 되고있다. 역학 자료에서 ZIKV는 약 4, 000 당 1에 Guillain-바레 증후군의 원인을 감염 성인⁴의심 되었습니다. 또한, ZIKV 및 testes 감염/피해 마우스 모델 사이의 상관 관계 입증 되었습니다, ZIKV 감염의 특정 상황에서 혈액 고환 방 벽을 무시 하 고 결국 남성 불 임 증^{5 이어질 수 제안} . 이러한 연구 결과 ZIKV 감염 시 보호 또는 pathologic 면역 반응의 유도 완전히 이해의 중요성을 강조 표시 합니다.

많이 ZIKV에 대 한 세포 면역 응답에 대해 배울 수 있다. CD4⁺ 와 CD8⁺ T 세포 응답 capsid, 봉투, 및 nonstructural 단백질 1 (NS1) ZIKV에 감염 된 원숭이 인간^6,7,8에서 관찰 되었습니다. 여러 연구에서 쥐, 표명 그 CD8⁺ T 세포 제어 ZIKV 복제^9,,1011에 보호 역할. 중요 한 것은, 후라도 그 외 여러분 ZIKV 감염의 혈액-뇌 장벽 붕괴에 CD8의 혈관 주위 침투 결과 시연⁺ Ifnar1^/- 생쥐 고환 내에서 효과 기 T 세포. 또한, 그들이 보여주는 CD8⁺ T 셀 ZIKV 관련 마비를 선동 하 고 신생아 뇌 immunopathology에서 역할을 표시. 이전 연구에서 우리는 ZIKV-E_294-302 tetramer 준비 하 고 보여 그 ZIKV 전용 CD8⁺ T 세포는 두뇌 및 디자인에 대 한 중요 한 의미를 가질 수 있는 ZIKV 감염 Ifnar1^/- 생쥐의 척수에 존재 그리고 ZIKV 백신¹⁰의 개발입니다.

ZIKV 감염을 방지 하기 위해 예방 접종에 대 한 긴급 한 필요에 대응, 여러 백신의 개발, RNA 재조합 벡터 기반 백신, 백신, 순화 된 단백질 소 단위 백신을 포함 하 여 전 임상 단계에 있습니다. 플라스 미드 DNA 백신은 단계 1 임상 시험¹²입니다. 안전 평가 및 ZIKV 백신의 효능은, 그러므로, 중요 하다. 백신의 장점 중 하나는 ZIKV에 대 한 보호에 대 한 중요 한 될 수 있는 특정 T 세포 응답을 유도 하는 능력입니다. ZIKV에서 파생 된 T-세포 epitope 관련 tetramers를 사용 하 여 아 데 노 바이러스 벡터 기반 ZIKV 백신에 의해 유도 된 T 세포 immunoreactivity 면역된 생쥐에서 검출 될 수 및 M과 E glycoproteins 강력한 항 원 특정 CD8 유도 표시 했다⁺ T-셀 immunoreactivity¹³.

바이러스 감염 시의 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 분자 T 세포 수용 체 (TCR)를 제시한 펩 티 드 항 원 인식 호스트¹⁴를 보호 하기 위한 중요 한 T 세포 중재 하는 메커니즘입니다. 이 이론에 따라, tetramer 기술은 항 원 특정 T 세포 면역 반응¹⁵규제에서 재생 하는 역할을 명료 하 게 하는 독특한 도구입니다. 이 프로토콜 tetramer 기술을 사용 하 여 비장, 뇌, 그리고 쥐의 고환에 반응 T 세포의 탐지 그리고 ZIKV 감염, Ifnar1^-/- 마우스 모델의 설립을 설명 합니다. 또한, 우리는 감지 하 고 면역된 생쥐의 ZIKV 백신 (AdC7-M/E)에 의해 유도 된 T 세포 immunoreactivity를 평가 ZIKV-E_294-302 tetramer를 사용. 이 연구 조사 기관 immunoprivileged에서에서 T 세포 응답에 대 한 지침을 제공 하 고 태 반 이나 태아 두뇌에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 참조를 제공 합니다.

프로토콜

동물 실험은 바이러스 성 질병 관리 및 예방, 중국 CDC 기관 동물 관리 및 사용 위원회 국립 연구소에 의해 승인 되었다. 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 승인 동물 프로토콜을 수행 했다.

1. 바이러스 감염

1. 계속 성인 (6 8 주 오래 된) 표준 특별 한 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 Ifnar1^-/- (남성 50%와 50% 여성) 쥐 그리고 그들에 게 음식과 물에 대 한 일반적인 접근을 허용.
2. ZIKV을 통해 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 하는 버퍼 1 x 10⁴ 초점 형성 단위 (FFUs) 바이러스의에 ZIKV의 100 µ L의 복고풍-궤도 접종으로 Ifnar1^/- 생쥐를 감염. 마찬가지로 PBS의 동일한 볼륨 컨트롤 마우스를 제공 합니다.
   주의: ABSL2 조건에서 쥐를 감염 하 고 biosafety 내각에서 바이러스에 감염 된 쥐와 함께이 절차를 수행.
3. 15 일 동안 무게와 쥐의 임상 증상 (떨림, 비틀 거리 며 3 월, 양국 이완 된 뒷 다리) 매일 모니터링 합니다.

2입니다. ZIKV 백신과 예방 접종

1. 나이의 6 그리고 8 주 사이 Ifnar1^-/- (남성 50%와 50% 여성) 마우스를 사용 합니다. 음식과 물에 18-29 ° C와 액세스와 12 h 명암 주기 표준 SPF 상태에서 생쥐를 유지.
2. ZIKV 백신 Ifnar1^/- 생쥐를 면역: AdC7-M/E의 100 µ L를 주사 [4 x 10¹⁰ (바이러스 입자)] PBS에 23-G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 근육 주사 (인스턴트 메신저 경로)를 통해 버퍼.
3. 마찬가지로 PBS의 동일한 볼륨 컨트롤 마우스 주사.

3. 비장에서 Monocytes의 격리

참고: 비장에서 monocytes의 격리는¹⁶에서 설명한 대로 설명 되어 있습니다.

1. (1 L/min의 유량)과 5% isoflurane concentrationin 100% 산소를 사용 하 여 면역 및 ZIKV 감염 쥐 7 d 후 접종 anesthetize 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 다음, 즉시 75% 에탄올으로 전체 마우스를 찍어.
   주의: 앞으로이 단계에서 모든 실험 절차에서에서 수행 되어야 합니다 aseptically biosafety 내각.
2. 바늘을 사용 하 여 해결할 (안락사, 이전 감염 접종) 쥐의 사지 거품 접시에 향하도록 복 부.
3. 복 부 정중 선 따라 피부 살 균 메스와 흉부에,가 위로 잘라 복 부 근육, 복 부 구멍을 노출 잘라내어 간 제거.
   참고: 복 부의 왼쪽에 긴, 다크 레드 기관은 비장 이다.
4. 비장을 제거, 그것을 씻어 모든 혈액을 제거 하 여 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI)의 1.5 mL에 PBS에 3 배. 얼음에 비장을 유지.
5. 비장에서 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 organ(s) 50 mL 튜브 위에 불 임 40 µ m-메쉬 셀 여과기에 놓고 얼음 처럼 차가운 RPMI 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)의 2 개 mL를 추가 합니다. 5 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 기계적으로 매 시는 organ(s) 하 고 때까지 기관 완전히 메시를 통해 지상 매체를 추가 합니다.
6. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 600 x g 4 ° c.에 5 분에서 그것을 원심합니다 제거는 상쾌한.
7. Resuspend 셀 (NH₄Cl, 나₂EDTA, 및 KHCO₃; 테이블의 자료를 참조) 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 5 mL을 품 어 5-6 분 동안 실내 온도에 세포의 용 해 반응 하 고.
8. 얼음 처럼 차가운 RPMI/FBS 매체의 10 mL와 RBC 세포를 중지 하 고 원심 관 600 x g 4 ° c.에 5 분에서 제거는 상쾌한.
9. 완전 한 RPMI 매체 (10 %vol / vol FBS와 RPMI 100 U/mL 페니실린-스) 10 mL와 셀 resuspend 작은 튜브에 세포 현 탁 액의 10 µ L를 전송, 0.4 %wt / 집 trypan 파랑의 10 µ L를 혼합 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산.

4. 두뇌와 고환에서 Monocytes의 격리

1. (1 L/min의 유량)과 5% isofluranein 100% 산소를 사용 하 여 ZIKV에 감염 된 남성 쥐 7 d 후 접종 anesthetize 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사. 다음, 즉시 75% 에탄올으로 전체 마우스를 찍어.
   주의:이 단계 이후,에서 모든 실험 절차 수행 되어야 합니다 aseptically biosafety 내각에서. 두뇌와 고환에서 monocytes의¹⁷에서 설명한 대로 설명 되어 있습니다.
2. (안락사, 이전 감염) 남성 마우스 마에서 발생 하기 쉬운 위치에 고정
3. 직선 1 x 2 이빨 집게와 두 피를 보호 하 고 노출 두개골을 두 피에 중간 절 개를 아이리스가 위를 사용 하 여.
4. 날카로운 핀셋으로 궤도의 두 측면을 클램프 및 두뇌를 수정. 구멍 매그넘 에 날카로운가 위를 홍 채의 1 개의 끝을 놓고 옆으로 두개골에 잘라. 다른 측면에 대 한이 단계를 반복 합니다.
5. 사용을 신중 하 게 동일한 구멍을 코 쪽으로 중간에서 잘라 아이리스가 위 날카로운. 뇌 부상 방지 가능한 표면가 위의 끝을 유지 하려고 합니다.
6. 집게와 두뇌를 들어올린 날카로운 아이리스가 위를 사용 하 여 신중 하 게 두개골 신경 섬유를 해 부. 집게와 두뇌를 제거 하 고 차가운 RPMI/10% FBS 매체의 5 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에.
7. 집게와 복 부 피부를 잡아 하 고 날카로운 아이리스가 위를 사용 하 여 외피와 복 벽을 통해 세로 절 개를 누르시면 부분의 복 부를 노출. 절 개까지 testes를 밀어. 부드럽게 핀셋으로 지방 레이어를 당겨 하 고 양쪽에 구형 고환 노출.
8. 사용 날카로운 아이리스가 신중 하 게 지방 층 및 epididymis 해 부를 위. 집게와 얼음 RPMI/10% FBS 매체의 5 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 testes를 놓습니다.
9. 뇌 또는 testes에서 단일 세포 현 탁 액을 생성, 50 mL 튜브 위에 100 µ m 메쉬 멸 균 셀 여과기에 기관 놓고 차가운 RPMI/10% FBS 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 5 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 장기를 매 시 고 때까지 기관 완전히 메시를 통해 지상 매체를 추가 합니다.
10. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 600 x g 4 ° c.에 5 분에서 그것을 원심합니다 제거는 상쾌한.
11. Resuspend 30% 밀도 그라데이션 중간의 5 mL와 함께 셀을, 다음, 매우 느리게 15 mL 튜브에서 70% 밀도 그라데이션 중간의 2 개 mL를 추가 합니다.
12. 브레이크 해제 스위치와 원심 800 x g 30 분 받기에 4 ° C에서 튜브 중간 계층에서 림프 톨.
13. 신선한 15 mL 튜브에 interphase 전송, 찬 RPMI/10% FBS 매체의 10 mL을 추가 하 고 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 관을 원심 제거는 상쾌한.
14. 얼음 처럼 차가운 RPMI/FBS 매체의 10 mL와 함께 셀 resuspend 및 4 ° c.에서 5 분 동안 600 x g 에서 원심 제거는 상쾌한.
15. Resuspend 완전 한 RPMI 매체의 10 mL와 함께 셀과 단계 3.9 에서처럼 셀 수 있습니다.

5. tetramer 준비

1. NdeI 및 XohI 제한 사이트¹⁸pET28a 벡터를 사용 하 여 α3 도메인 및 β₂m C-말단에 biotinylated 사이트 태그와 H-2D^b 의 세포 외 도메인을 표현 하는 플라스 미드를 생성 합니다.
2. 익스프레스 고 H-2D^b 와 β₂m 앞에서 설명한²⁰의 포함 시체를 준비 합니다.
3. Renature 정화는 MHC/펩 티 드 복잡 한 2D H^b-E_294-302.
   1. [100 mM Tris HCl (pH 8.0), 400 m m L-아르기닌, 2 mM EDTA-나, 5mm GSG, 그리고 0.5 m m GSSG] refolding 솔루션 200ml를 준비 합니다. 프로 테아 제 억제제를 추가: phenylmethylsulphonyl 불 소 (PMSF, 재고 100 m m), 100 µ L의 pepstatin (재고 2 mg/mL), 및 leupeptin (재고 2 mg/mL)의 100 µ L의 2 mL. 멋진 30 분 동안 4 ° C에서 버퍼.
   2. Β₂m^bH-2D, 펩 티 드 refolding 솔루션에 추가 합니다.
      1. 500 µ L 주사기를 사용 하 여 guanidine 솔루션 (주식 30 mg/mL)에 녹 β₂m의 주사. 이 위해 5 mL 주사기 23 G 바늘을 사용 하 고 refolding 솔루션에 의해 드롭 β₂m 주입. 지속적으로 하 고 천천히 4 ° c.에서 150 rpm에서 감동 하는 솔루션을 유지
      2. Refolding 솔루션에서 β₂m를 해산 후 DMSO의 200 µ L에서 E_294-302 펩 티 드의 2 밀리 그램을 해결 하 고 신속 하 게 refolding 솔루션을 피 펫을 사용 하 여 그것을 주입. 천천히 15 분 동안 4 ° C에서 150 rpm에서 솔루션을 저 어.
      3. H-2D^b guanidine 솔루션에 용 해의 1.5 mL를 주사. H-2D^b 8-10 h 4 ° C에서 refolding 위해 150 rpm에서 저 어 바 회전 유지.
         참고: 솔루션 추운 방에 닫힌된 상자에 배치 했다.
   3. 10 kDa 막으로 가압된 챔버에 refolded 단백질을 집중 한다. 실로 버퍼 [20 mM Tris HCl (pH8.0), 50 mM NaCl]를 교환 하 고 30-50 mL의 최종 볼륨을 집중.
   4. 원심 분리기 튜브 refolding 솔루션 전송 및 4 ° c.에 15 분 동안 2500 x g 에서 회전
   5. 조심 스럽게 10 kDa 원심 필터에는 상쾌한을 전송 하 고 2500 x g 30 분 동안에 500 µ L의 최종 볼륨에 더 집중.
   6. 신선한 튜브는 상쾌한 전송 하 고 S200과 단백질에서 12000 x g 15 분 Purify 스핀 10/300 GL 젤 filtration 착 색 인쇄기.
   7. MHC 복잡 한 피크를 수집 하 고 350 µ L의 최종 볼륨을 집중.
4. Biotinylation에 대 한 500 µ L 반응 볼륨을 생성 하려면 다음과 같은 순서로 regents 추가: 솔루션의 100 µ L [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µ L 솔루션 B의 (100 m m ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ biotin), 추가 d-비오 틴 (biotin 500 µΜ)의 100 µ L BirA 효소 (60 µ g)의 20 µ L, 0.5 µ L의 pepstatin (2 mg/mL), 및 leupeptin (2 mg/mL)의 0.5 µ L. 4 ° c.에 하룻밤 반응 관을 품 어
   주의: biotinylating 반응에 어떤 EDTA를 추가 하지 마십시오.
5. MHC는 S200를 사용 하 여 정화 10/300 GL 젤 여과 열 제거 어떤 여분의 biotin을.
6. Streptavidin 시프트 분석 결과¹⁸와 biotinylating 효율성을 결정 합니다.
   1. 3 샘플, A, B, 및 C, 30 분 동안 얼음에 준비 합니다. 분석 결과 10 %SDS 페이지. Biotinylated MHC 분자의 8 µ L 및 exchange 버퍼, biotinylated MHC 분자의 8 µ L의 샘플 B와 streptavidin (20 mg/mL), 및 streptavidin (20 mg/mL)의 2 µ L의 샘플 C 8 µ L 교환 버퍼 2 µ L의 2 µ L 샘플 A에 의하여 이루어져 있다.
      주의: 샘플 끓여 야 하지 않습니다.
7. Multimers biotinylated MHC 분자의 형성.
   1. 모든 biotinylated MHC 분자의 완전 한 바인딩 되도록 1: 5의 몰 비율로 streptavidin phycoerythrin 표시는 biotinylated E_294-302 펩 티 드 H₂D^b 복잡 한 혼합 하 여 tetramer를 생성 합니다.
   2. Streptavidin 공액 tetramerization에 필요한 금액을 계산 합니다.
      1. MHC/펩 티 드 복합물 단백질 농도 어 금 니 무게에 대 한 회계의 두더지를 결정 (예: 1.8 mg 총 단백질의 40 nmol =).
      2. 5 MHC/펩 티 드의 두더지를 분할 하 여 필요한 streptavidin 켤레의 두더지를 계산 (예: 40/5 = 8 nmol streptavidin 켤레의).
      3. (µ G)에서 필요로 하는 streptavidin의 양을 계산 streptavidin 켤레에 따라 (예: streptavidin-PE [300000 g/M] → 8 nmol 필요 = 2400 g).
   3. 10 샘플 streptavidin phycoerythrin 나눕니다. Biotinylated E_294-302 펩 티 드 H₂D^b 복잡 한, 20 분의 간격을 포함 하는 관을 각 샘플을 추가 합니다. 마지막 샘플 로딩 후 어둠 속에서 하룻밤 4 ° C에서 반응 관을 품 어.
8. Multimerized 시 약 100 kDa 스핀 관으로 적용 하 고 그것의 볼륨에 4 ° C에서 2000 x g 에서 원심 분리 하 여 집중 < 100 µ L.
9. 4 ml PBS (pH 8.0)를 사용 하 여 스핀 튜브에 샘플을 희석 하 고 그것을 다시 집중 < 100 µ L.
10. PBS (pH 8.0)에서 버퍼 교환 단계 반복 4 배.
11. 총 볼륨 500 다시 채워 µ L PBS (pH 8.0)를 사용 하 여. 4 ° c.에 2000 x g 에 2-2.5 mg/mL의 추정된 농도에 샘플을 집중 4 ° c.에 어둠 속에서 샘플을 저장

6. Cytometry

1. 어떤 불특정 바인딩 방지 하기 위해 10 분, 20 µ L (희석 비율 1: 200) 당 반대로 murine CD16/CD32 Fc 수용 체 차단 약의 0.1 µ L와 4 ° C에서 (에서 3.9 단계 또는 단계 4.15) 셀 정지를 품 어.
2. 4 ° c.에 적어도 15 분 동안 20000 x g 에서 tetramer 튜브 원심
3. 96 잘 platecontaining 1 x 10⁶ 세포에 세포 현 탁 액의 20 µ L를 각각 잘 추가 합니다.
4. 모든 실험 관 얼룩 E_294-302 tetramer 믹스의 충분 한 볼륨을 준비 합니다. 계정에이 혼합의 총 볼륨의 15% 초과 pipetting 오류에 대 한 준비. FACS 버퍼에서 E_294-302 tetramers (2 mg/mL, 1 µ L/테스트) 희석 (PBS, 0.5 %FBS)를 20 µ L E_294-302 tetramer 믹스의 각 테스트에 추가 됩니다.
5. 96 잘 접시를 20 µ L E_294-302 tetramer 믹스를 추가 합니다. 이 단계 말까지 각 잘에서 최종 볼륨 40 µL.Incubate 30 분 방 온도에서 어둠 속에서 판 이어야 한다.
6. 세포 현 탁 액에 1 µ L/테스트에서 1 차 항 체 (FITC 활용 또는 APC 활용 된 안티-CD3 (0.2 mg/mL), PerCP 활용 된 안티-CD8 (0.2 mg/mL))를 추가 하 고, 다음, 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
7. 2 세포를 씻어 FACS 버퍼 및 원심 분리기 600 x g 5 분 대에 그들 신중 하 게는 상쾌한 발음 및 resuspend FACS 버퍼의 200 µ L로 세포의 2 개 mL x.
8. 흐름 cytometric 분석까지 어둠 속에서 4 ° C에서 일시적으로 샘플을 저장 합니다.
9. 흐름 cytometric 분석에 대 한 다음과 같은 제어 전략을 사용 합니다.
   1. 앞으로 분산형 (FSC) 측면 살포 (SSC) 지역 대 를 그려서 대각선 클러스터 된 singlets에는 게이트를 만듭니다.
   2. 다음, CD3에 게이트 옆 살포 (SSC) 대 CD3;에 의해 세포가⁺ 다음, CD3에 게이트⁺ CD8⁺ 세포; 마지막으로, CD8 개요^{+ +} tetramer 셀¹⁹.

7. histopathology, 면역 형광 검사, 및 Immunohistochemistry 분석 결과

1. Histopathology 분석 결과
   1. ZIKV 감염 Ifnar1^/- 생쥐 7 d 후 접종의 두뇌와 고환 조직 수집 하 고 4% 중립 버퍼링 포름알데히드에 그들을 수정.
      주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오.
   2. 파라핀에 조직을 포함 합니다.
   3. 섹션 5 m m는 vibratome를 사용 하 여 조직.
   4. 얼룩 hematoxylin와 오신 (H & E) 조직.
2. Immunohistochemistry 분석 결과
   1. Deparaffinize, rehydrate, 및 항 원 검색 조직의 절차에 따라 섹션²¹설명한.
   2. 10 분 동안 PBS (pH 7.6)에 3% H₂O₂ 와 조직 단면도 취급 하 고 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 10 분 동안 그들을 차단.
   3. 쥐 반대로 마우스 CD3 항 체와 조직 단면도 품 어 (희석: 1/1000) 실내 온도에 8 h에 대 한 그리고, 다음, 품 어 그들 4 ° C에서 하룻밤.
   4. PBS 가진 조직 헹 구 고, biotinylated 이차 항 체의 3 드랍 스와 다음, 그들을 품 어 (희석: 1/1000) 실 온에서 2 h, 다음 avidin 비타민 b 복합체 과산화 효소 3 방울 (희석: 1/200) 30 분 동안 실내 온도에.
   5. 30, 3 방울과 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride 바인딩 (희석: 1/1000), 앞에서 설명한²².
   6. 메이어의 hematoxylin와 조직 단면도 counterstain
3. 면역 형광 분석 결과
   1. 실 온에서 10 분 동안 냉동된 고환 섹션 (6 m m) 건조
   2. 10 분 동안 차가운 아세톤으로 그들을 수정.
   3. 3 x PBS와 섹션을 세척 하 고 블로킹 버퍼와 그들을 차단 (1 %BSA, 0.3% 트리톤, 1 x PBS) 30 분 동안 37 ° C에서.
   4. 1 차적인 항 체 (z 6)와 조직 단면도 품 어 (20 µ g/mL) 4 ° C에서 하룻밤.
   5. PBS 가진 조직 린스 하 고 이차 항 체를 적용 (희석 비율: 1/200) 37 ° c.에 1 시간에 대 한
   6. PBS 가진 조직 단면도 세척 하 고 사용 하 여 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵에 대 한 counterstain (희석 비율: 1/1000), 제조업체의 지침에 따라.

결과

이러한 방법에 따라 우리는 ZIKV 감염 murine 모델을 개발 했습니다. 나이의 6-8 주에 Ifnar1^/- 생쥐 1 x 10⁴ 초점 형성 단위 (: FFU)는 ZIKV의 retroorbital 주입 하 여 감염 되었습니다. 병 적인 증상 및 징후 (그림 1A), 뿐만 아니라 체중 변화 (그림 1B), Ifnar1^/- 생쥐에는 ZIKV와 감염 후 관찰 되었다. Murine 두뇌 보였다 명백한 부 종과 충 (그림 1C). Testes 점차적으로 긴축 하는 한편, (그림 1D). 또한, 병 적인 변화와 조직의 파괴는 두뇌와 고환 (그림 2A)에서 발견 됐다. 우리 뇌와 고환 (그림 2B)에 ZIKV를 감지 하는 면역 형광 분석 결과 수행. 높은 바이러스 부하는 immunostaining (그림 2B)에 의해 두뇌와 고환에 감지 했다. Immunohistochemistry CD3의 강력한 침투 했다⁺ T ZIKV (그림 2C) 감염 후 생쥐 뇌 세포.

감지 하 고 평가 하는 ZIKV 전용 T 세포 응답, 우리는 마우스 MHC 준비-나 H-2D^b-E_294-302 tetramer. 펩 티 드 전자_294-302 H-2D^b renature를 제대로 도울 수와 녹는 MHC의 높은 금액을 얻을-나 (그림 3A). 교대 분석 실험에서 biotinylation에 높은 효율 (그림 3B) 관찰 될 수 있었다. 그 후, 3 개의 streptavidin 형광 (APC, PE 및 BV421)-pMHC 태그-난 tetramers ZIKV 전용 T 세포 (그림 3C) 감지 생산. PE 라는 tetramer 했다 특정 CD8 감지 하는 높은 효능⁺ 비록 차이 통계적으로 중요 한 APC 및 BV421 표시 된 tetramers에 비해 T 세포.

우리 cytometry ZIKV (3.49 ± 0.45%)의 7 일 후 접종에 의해 감염 된 마우스의 비장에 ZIKV 관련 T 림프 톨을 감지 전자_294-302 tetramer를 사용 하 여. 또한, AdC7-M/E 백신의 4 주 후 예방 접종과 함께이 프로토콜의 섹션 3에서에서 설명 하는 방법을 유사한, ZIKV 관련 T 림프 톨에에서 검색 된 비장 (6.89 ± 1.36%) (그림 4)입니다.

또한, 우리는 ZIKV 감염 후 뇌와 고환, immunoprivileged 기관으로 침투 하는 세포를 감지. 문 CD3 선택으로 설정 된⁺CD8⁺ T 세포는 두뇌와 고환의 총 림프 톨. E_294-302 tetramer 전용 T 세포의 높은 비율 두뇌에서 검출 될 수 (CD3에서 42.2%⁺CD8⁺ T 세포)는 고환과 (c d 3에서 26.4%⁺CD8⁺ T 세포) 세포 (그림 5).

그림 1 : Ifnar1^/- 생쥐에서 ZIKV 감염의. 나이의 6-8 주에 Ifnar1^/- 생쥐에 감염 되었습니다 10⁴ 초점 형성 단위 (: FFU)는 ZIKV의 retroorbital 주입, 그리고 PBS를 주입 하는 쥐 감염 되지 않은 컨트롤으로 사용 되었다. 형태학 (A) 및 (B) 감염된 Ifnar1^/- 생쥐의 체중 변화 감시 되었다. 빨간색 화살표는 Ifnar1^/- 생쥐는 감염 후 myeloparalysis와 모터 paraparesis 제시를 나타냅니다. 7 d 후 접종에서 (C) 두뇌와 0, 7, 14, 그리고 30 일 후 접종 (D) testes 수확 했다. 두뇌와 쥐에서 고환의 대표 이미지 크기를 표시 하는 눈금자 함께 표시 됩니다. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. n = 실험 당 그룹당 10 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : ZIKV 두뇌 및 ZIKV 감염 Ifnar1^/- 생쥐 고환 세포의 검출. 두뇌와 7 d 후 접종에 부정적인 컨트롤에 비해 ZIKV에 감염 된 쥐에서 고환의 (A)이이 패널 쇼 histopathological 변화. 눈금 막대 = 25 µ m (왼쪽된 패널) 및 50 µ m (오른쪽 패널). (B)는 면역 형광 분석 결과 안티 ZIKV z 6 항 체 (녹색)으로 수행 되었다. 모든 조직 샘플 7 d 후 접종에서 ZIKV에 감염 된 생쥐에서 수집 되었다. 핵 (파란색)와 DAPI 스테인드 했다. 눈금 막대 CD3의 강력한 침투 50 µ m. (C) Immunohistochemistry 쇼 =⁺ T 세포는 두뇌와 고환에. 눈금 막대 = 25 µ m (왼쪽된 패널) 및 50 µ m (오른쪽 패널). 보라색 되며, 브라운 CD3 항 체를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : ZIKV 특정 pMHC의 준비-난 tetramers. (A) E H-2D^b _294-302 의 바인딩은 생체 외에서 refolding 의해 해명. 블루 H-2D^b-E_294-302 단백질을 나타냅니다. 오렌지는 펩 티 드 없이 부정적인 컨트롤을 나타냅니다. (B)이이 패널 H-2D^b-E_294-302 변화 분석 결과를 보여 줍니다. (C) mock PBS 컨트롤을 나타냅니다. 3 streptavidin 형광 (APC, PE 및 BV421)-pMHC 태그-난 tetramers ZIKV 전용 T 세포를 감지 하는 데 사용 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 바이러스 관련 CD8의 cytometric 분석 흐름 ⁺ 및 ZIKV 감염 백신 접종 생쥐의 비장에 T 세포. 나이의 6-8 주에 Ifnar1^/- 생쥐 10⁴ 초점 형성 단위 (: FFU) ZIKV의 감염 중 하나 되었습니다 또는 단일-AdC7-M/E 또는 부정적인 컨트롤로 PBS의 4 x 10¹⁰ 바이러스 성 입자의 복용량을 받았다. 감염 된 후 7 일 후 4 주 후 예방 접종, 마우스 splenocytes 수확 되었고 cytometry에 의해 분석. 으로 평균 ± sd. 통계 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행한 데이터 표시 됩니다 (중요 하지: P > 0.05; *P < 0.05; * *P < 0.01; * * *P < 0.001; * * *P < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

그림 5 : 두뇌와 ZIKV에 감염 된 쥐의 고환에⁺ T 세포 바이러스 관련 CD8의 전략 및 대표 결과 게이팅. 대표 작은 두뇌와 (B)는 고환 (A)에 침투 림프 톨에 대 한 표시 됩니다. 게이츠의 승계 림프 분산형⁺ 와 CD3 선택 설정⁺ 이벤트. 이들의 CD8⁺ 이벤트 epitope 전용 T 세포의 분석에 대 한 문이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

토론

면역성 T-셀 epitope 병원 체²³에 대 한 세포 면역에 중요 한 역할을 한다. 따라서, immunoprivileged 장기에서 ZIKV 전용 T 세포의 검출은 자연 ZIKV 감염에 대 한 T 세포 응답을 이해 하는 중요 한 방법론 이다. 한편, T 세포 응답 감지 바이러스 백신의 효능을 조사 하는 훌륭한 도구입니다. 여기, 우리는 비장, 뇌, 그리고 ZIKV에 감염 된 마우스, immunodominant epitope E_294-302 tetramer의 준비의 testes에서 림프 톨의 격리를 포함 하는 실험을 시각화 하는 포괄적인 프로토콜 표시와 ZIKV 전용 CD8의 인식⁺ T immunoprivileged ZIKV에 감염 된 쥐의 장기에서 세포.

이전 학문은 보여주었다 라이브 ZIKV 또는 그것의 RNA는 ZIKV 수 있습니다 혈액 고환 방 벽을 무시 하 고 생식²⁴에서 자체 복제를 나타내는 남성 환자의 정액에서 검출 될 수 있다. 이전에, 우리도 ZIKV testes 손상 될 수 있고 쥐²⁵에서 남성 불 임으로 이어질 보였다. ZIKV 감염으로 이어질 수 있는 붉은 털 원숭이에 니와 내장 기관 뿐만 아니라 중앙 신경 시스템 (CNS), 바이러스 성 RNA를 검출 될 수 있다. Immunohistochemistry는 CNS와 여러 주변 장기²⁶ZIKV 특정 항 원 제시 했다 밝혔다. Murine 모델의 ZIKV 감염 강력한 항 바이러스 CD8을 일으킬 수 있다 또한,⁺ 비장에 CNS²⁶T 세포 응답.

이전 작품에 비해,이 연구 ZIKV 전용 CD8 감지 체계적인 방법을 설정⁺ T-세포 두뇌와 고환, immunoprivileged 사이트에 응답. 그것은 ZIKV에 감염 된 쥐의 immunoprivileged 장기에서 바이러스 관련 T 세포의 기능을 평가 하는 것이 중요입니다. ZIKV 전용 CD8 감지 하는 tetramers의 사용⁺ T-셀 immunoprivileged 기관에 응답 ZIKV 감염 및 그들의 호스트 면역 반응에 대 한 우리의 이해를 크게 향상 시킬 것 이다. E_294-302 tetramer 사용 하 여, 뇌와 고환에 바이러스 관련 T 세포 수 고립 될 cytometry에 의해 ZIKV 감염 시 보호와 immunopathogenesis의 세포 메커니즘을 조사. 한편, 연구자는 CD8 기능 추가 조사에 대 한 도움이 됩니다⁺ T 세포 제어 ZIKV, 또는 ZIKV 감염 시 이러한 기관에서 immunopathogenesis를 강화.

항 원 특정 murine CD8 분석⁺ T 세포 응답 immunoprivileged 장기에 우리는 H-2D^b-E_294-302 tetramer 준비 하 고는 CD8 감지 cytometry에 의해⁺ T 세포. Tetramers은 항 원 특정 T 세포를 감지 하는 강력한 도구입니다. 여기, 형광 색소 활용 된 streptavidin (APC, PE 및 BV421)의 세 가지 유형 생성 했다. APC-, BV421-고 항 원 특정 T 세포, PE 표시 된 pMHC을 탐지 하기 위한 tetramers PE 표시에 통계적으로 유의 한 차이가 있지만-내가 tetramers 최고의 결과 굴복. 따라서, PE 라는 tetramer이이 연구에 걸쳐 사용 되었다. 흥미롭게도, 우리 뇌와 고환에 혈액에서 바이러스 관련 T 세포의 마이그레이션 능력을 나타내는 항 원 특정 T 세포의 높은 비율을 감지 PE 표시 H-2D^b-E_294-302 tetramer을 바탕으로, immunoprivileged 기관입니다.

그러나, 프로토콜에 몇 가지 제한이 있습니다. H-2D^b-E_294-302 tetramer tetramer 탐지는 MHC 제한에 의존 하기 때문에 인간 T 세포 검출, 유용 하지 않습니다. Immunodominant HLA 제한 펩 티 드의 심사는 여전히 필요 합니다. 게다가, 역 궤도 감염 ZIKV 감염에 효과적입니다 하지만 일부 조사에 대 한 편리한 작업 수 있습니다. 따라서, 감염, 복 막, 피하, 또는 정 맥를 포함 하 여 다른 경로 또한 것이 좋습니다.

여기에 설명 된 프로토콜에서 중요 한 단계는 두뇌와 고환에서 monocytes의 격리입니다. 높은-품질 림프 톨; 취득 하는 것이 중요 하다 따라서, 예를 들어 원심 속도, 연 삭 조직의 힘과 두뇌와 고환 조직의 해 부에 관심을 지불 하는 것이 중요 하다. 게다가, tetramer 준비에 대 한 protease 억제제 (PMSF, pepstatin, leupeptin)는 도움이 타락에서 단백질을 보호 하는 경우. 따라서, 그것을 추가 하는 프로 테아 제 억제제 refolding 버퍼 고 tetramer 준비의 과정에서 버퍼를 교환 의미가 있습니다.

결론적으로, 우리는 ZIKV 감염에 대 한 Ifnar1^-/- 마우스 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 검출 하는 방법 제시. 이 플랫폼 신흥 고 다시 신흥 혈액 및 immunoprivileged 기관 사이의 장벽을 우회할 수 있는 바이러스의 면역 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 또한,이 연구 후보 백신과 immunotherapies의 미래 발전에 대 한 방법을 포장 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z6	our lab		Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated	CWBIO	CW0115
FITC anti-mouse CD3	Biolegend	17A2
APC anti-mouse CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-mouse CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides	Scilight-peptide		Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Must be stored at 4 °C
DMSO	MP	219605590	Store at room temperature.
APC-Streptadivin	BD	554067	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin	BD	554061	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Must be stored at 4 °C
Cell Strainers	BF	BF10-5040	Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	Store at room temperature.
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific
FACS Cantol			Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
red blood cell lysis buffer	Solarbio	R1010	Store at 4 °C.