Determinação de subconjuntos de regulação de células T no timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço usando citometria de fluxo

Resumo

Neste documento, apresentamos um protocolo para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço para um estudo mais aprofundado destas células usando citometria de fluxo. Além disso, este protocolo foi utilizado para determinar os subconjuntos de pilhas de T reguladoras usando citometria de fluxo.

Resumo

Nosso sistema imunológico consiste de um número e variedade de células imunes, incluindo células de células (Treg) T reguladoras. Células TREG podem ser divididas em dois subconjuntos, tímicas células derivadas de Treg (tTreg) e perifericamente induzida por células Treg (pTreg). Eles estão presentes em diferentes órgãos do nosso corpo e podem ser diferenciados por marcadores específicos, tais como o Helios e Neuropilin 1. Relatou-se que as células tTreg são funcionalmente mais supressivas do que células pTreg. Portanto, é importante determinar a proporção de células tanto tTreg e pTreg na investigação de populações de células heterogêneas. Neste documento, coletamos glândulas do timo, pancreáticos drenagem de linfonodos e baço de normoglycemic não-obesos diabéticos ratos para distinguir células de tTreg de pTreg células usando citometria de fluxo. Estamos preparados manualmente suspensões única célula por estes órgãos. Conjugados a fluorocromo superfície CD4, CD8, CD25, e anticorpos Neuropilin 1 foram usados para manchar as células. Eles foram mantidos na geladeira durante a noite. No dia seguinte, as células foram coradas com anticorpos intracelulares de Foxp3 e Helios fluorocromo conjugado. Estes marcadores foram usados para caracterizar os dois subconjuntos de células Treg. Este protocolo demonstra uma maneira simples, mas prática para preparar células únicas de Timo murino, pancreático drenagem do linfonodo e baço e usá-los para análise de subsequentes fluxo cytometric.

Introdução

Pilhas de T (Treg) reguladoras são essenciais para a homeostase do sistema imune. Células TREG são definidas pela expressão de antígenos de superfície CD4 e CD25 e transcrição fator forkhead caixa P3 (Foxp3)^1,2,3. Primeiro, Sakaguchi et al mostrou que CD25 é constitutivamente expressa em células T supressor ratos⁴, que previa uma observação pioneira para a identificação de células Treg humanas. Células TREG desempenham um papel central na tolerância imunológica, exercendo uma capacidade supressora através de uma variedade de mecanismos, incluindo citólise através da secreção de granzymes para induzir apoptose, consumo de citocinas e inibição através da expressão de citotóxicos Linfócitos T antígeno 4⁵. Além disso, eles podem secretam citocinas inibidoras como transformar o fator de crescimento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) e IL-35⁵. Células TREG naturalmente podem ser derivadas de timo, caso em que eles são designados do Timo células derivadas de Treg (tTreg), ou eles podem ser induzidos nos órgãos periféricos, nesse caso são chamados perifericamente induzida por células Treg (pTreg).

Helios, um membro da família de factor de transcrição Ikaros, foi relatado para ser um marcador para distinguir entre as células tTreg células e e pTreg⁶. Mais tarde, dois outros grupos relataram que Neuropilin 1 (Nrp1), um receptor III semaphorin, poderia servir como um marcador de superfície para tTreg células sob determinadas condições de^7,8. Não obstante, Singh et al demonstraram que o Helios é um marcador melhor neste contexto em ingênuo ratos⁹.

Os subconjuntos de células Treg desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase do sistema imune e na proteção contra a infecção e autoimunidade. Portanto, é importante determinar os números e proporções dessas populações nos tecidos linfoides e não linfoides. Para conseguir isso, é preciso preparar suspensões única célula por estes órgãos. Um número de protocolos foram descrito ou utilizado em estudos anteriores. Principalmente, dissociators automáticos têm sido utilizados em relatórios publicados anteriormente^10,11. Usar o dissociators automáticos é conveniente e economia de tempo, mas é um procedimento caro. Portanto, usamos um método manual para preparar suspensões única célula de murino glândulas do timo, linfonodos pancreáticos (PDLNs) drenagem e baços de normoglycemic não-obesos diabéticos (ASSENTIMENTO) mouses e células únicas isoladas por estes órgãos. Este método tem sido utilizado em nossos estudos anteriores e descobrimos que o método manual para preparar a suspensão de célula única é tão eficiente quanto dissociador automático método^9,12,13,14. Além disso, usamos a citometria de fluxo para determinar as proporções de CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg células e subconjuntos de Treg células tTreg e pTreg. As células tTreg e pTreg foram distinguidas usando o Helios e Nrp1 como marcadores de células tTreg. Assim, nossos resultados indicam que o método manual para preparar as células única funciona eficientemente e as suspensões preparadas única célula podem ser ainda mais usadas para estudos utilizando citometria de fluxo.

Protocolo

Comitê local de ética animal na Universidade de Uppsala aprovado as experiências com animais.

1. colheita de órgãos de animais

1. Sacrifica os ratos por deslocamento cervical.
2. Coloque as glândulas do Timo e baços em frascos de 20ml cintilação ou tubos de 15ml cónico preenchidos com 5 mL de Hanks´ equilibrada solução salina (HBSS). Lugar PDLNs em micro tubos de 1,5 mL preenchidos com 1 mL de RPMI 1640. Use todo Timo e baço e todos os PDLNs.
   Nota: Os órgãos devem ser mantidos no gelo durante todo o procedimento e o investigador deve tentar ser rápido ao preparar suspensões de célula única, especialmente ao manusear o tecido tímico, desde que as células imunes do Timo podem ser rapidamente degradadas em altas temperaturas.

2. única célula isolamento do Timo e baço

1. Aperte completamente o Timo e o baço com um par de pinças para liberar as células do sistema imunológico. Descarte a restante cápsula do Timo e baço.
2. Transferi a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar 433 x g por 5 min a 4 ° C, para formar um pellet. Desprezar o sobrenadante.
3. Para lisar os glóbulos vermelhos, Ressuspender a suspensão de eritrócitos em 5 mL de 0,2 M NH₄Cl e incubar a temperatura ambiente por 10 min. inverter os tubos de cabeça para baixo suavemente cada 2 min. Adicione 5 mL de HBSS, no final da incubação, para parar a Lise.
4. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
5. Ressuspender as células em cerca de 5 mL de HBSS. Encha os tubos com HBSS.
6. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
7. Ressuspender as células em cerca de 5 mL de HBSS. Encha os tubos com HBSS.
8. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
9. Ressuspender as células em 5 mL de HBSS por Timo e 10 mL para o baço.
10. Transferência de 1 mL de suspensão de células do Timo e 500 µ l de suspensão de célula esplênica para 5 mL redonda tubos com tampas de filtro da célula. Aplica a suspensão de células para as tampas de filtro de célula.
    Nota: Uma malha de nylon de 35 µm é incorporada a tampa. Cerca de 5 milhões de células foram coletadas em cada tubo.

3. única célula isolamento de PDLN

1. Coloque uma malha de metal estéril 250 µm sobre um tubo cônico de 15 mL em um rack. Enxágue a malha com 1 mL de RPMI.
2. Transferir os gânglios linfáticos para o engranzamento do metal e triturá-los através da malha usando um par de pinças. Aplique 1 mL de RPMI o engranzamento do metal para lavar as células dentro do tubo. Repetir 3 vezes mais e remover a malha.
3. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em cerca de 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.
5. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
6. Ressuspender as células em cerca de 5 mL de RPMI. Encha os tubos com RPMI.
7. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
8. Ressuspender as células em 2 mL de RPMI. Transferência de 2 mL de suspensão de células para 5 mL redonda tubos com tampas de filtro da célula. Aplica a suspensão de células para as tampas de filtro de célula.

4. fluxo Cytometry

1. Centrifugar as suspensões de células do timo, PDLN e baço a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
2. Manchar as células com as seguintes anticorpos superfície em 100 µ l de buffer (buffer de FACS) a coloração de citometria de fluxo: 0,75 anticorpo µ g/100 µ l CD4 FITC-conjugados, 0,60 anticorpo CD8 APC-H7-conjugados de µ g/100 µ l, 0,30 µ g/100 µ l CD25 PE-conjugado anticorpo, 5 µ l (01:20) APC-conjugado anticorpo Nrp1. Incube os tubos no gelo por 40 min.
3. Adicione 200 µ l de tampão de FACS a cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante. Repita mais uma vez.
4. Corrigir e permeabilize as células por resuspending o centrifugado em 500 µ l de tampão de fixação de permeabilização (PFB).
   Nota: PFB é preparada pela mistura de 1 parte de fixação/permeabilizacao se concentrar com 3 peças de fixação/permeabilização diluente.
5. Manter os tubos na geladeira a 4 ° C durante a noite.
   Nota: Uma incubação de 1 h também funciona.
6. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
7. Ressuspender as células em 500 µ l de tampão de lavagem permeabilização (PWB). Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   Nota: PWB é preparado pela diluição permeabilização Buffer (10x) a 01:10 em água destilada.
8. Manchar as células com as seguintes anticorpos intracelulares em 100 µ l do PWB: 0,30 anticorpo µ g/100 µ l Foxp3 PE-Cy7-conjugado, anticorpo conjugado PacificBlue Helios de 4 µ l (01:25). Incube os tubos no gelo por 1h.
9. Adicione 500 µ l do PWB para cada tubo. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
10. Ressuspender as células em 500 µ l do PWB. Centrifugar os tubos a 433 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
11. Ressuspender as células em 300 µ l de tampão de FACS.
12. Analise as células em um citômetro de fluxo.
13. As células única baseadas na dispersão-área lateral, altura e largura e Forward Scatter-área, altura e largura da porta. Execute 1 milhão eventos para análise.
14. Exportar os arquivos FCS de experiências e analisá-los usando um software de analisador de citometria de fluxo.

Resultados

Para investigar a expressão da Nrp1 e Helios em células tTreg e pTreg, nós preparados única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD de normoglycemic e manchadas-los com os marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 para fluxo cytometric análise. Os resultados foram analisados conforme o representante gating estratégias (Figura 1). Descobrimos que a proporção de células de Helios⁺ entre CD4^+<...

Discussão

Neste estudo, nós isolado única células das glândulas do timo, PDLNs e baços de camundongos NOD e investigou a expressão de Helios e Nrp1 em CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg células usando citometria de fluxo. No presente estudo, foram utilizados camundongos NOD, que é um modelo murino de diabetes tipo 1. Em um estudo anterior, usamos as estirpes de tipo selvagem do mouse CD-1 e camundongos C57BL/6 para investigar se o Helios ou Nrp1 é um melhor marcador para distinguir cél...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15ml, 120x17mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5ml	Sarstedt	72.690.001
disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic