Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

요약

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

초록

규제 T 세포 (Treg) 세포 등 면역 세포의 다양 한 숫자와 우리의 면역 체계에 의하여 이루어져 있다. Treg 세포는 두 개의 하위 집합, thymic 파생된 Treg (tTreg) 세포와 주변 유도 Treg (pTreg) 셀으로 나눌 수 있습니다. 그들은 우리의 신체의 다른 장기에 존재 하 고 헬 리오스 Neuropilin 1 등 특정 마커에 의해 구별 될 수 있다. TTreg 세포는 pTreg 셀 보다 기능적으로 더 진압으로 보고 되었습니다. 따라서, 그것은 다른 유형의 세포 인구를 조사할 때 tTreg와 pTreg 세포의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 수집 thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프절과 spleens cytometry를 사용 하 여 pTreg 세포에서 tTreg 셀을 구별 normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 쥐에서. 우리는 수동으로 단일 셀 정지가이 기관에서 준비. 형광 색소 활용 된 표면 CD4, CD8, CD25, 그리고 Neuropilin 1 항 체는 세포 얼룩 사용 되었다. 그들은 하룻밤 냉장고에 보관 했다. 다음 날, 세포 형광 색소 활용 된 세포내 Foxp3와 헬 리오스 항 체와 얼룩이 있었다. 이러한 마커는 Treg 세포의 두 하위 집합 하 사용 되었다. 이 프로토콜에서는 murine thymus, 림프절, 비장을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하 고 이후의 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 간단 하지만 실용적인 방법을 보여 줍니다.

서문

규정 (Treg) T 세포는 면역 시스템의 항상 성에 대 한 중요 합니다. Treg 세포 표면 항 원 c d 4의 식와 CD25, 및 녹음 방송 요인 forkhead 상자 P3 (Foxp3)^1,2,3에 의해 정의 됩니다. 사 카 구치 외. 먼저 CD25 constitutively 쥐⁴, 인간 Treg 세포의 식별에 대 한 선구적인 관찰을 제공 하는 T 억제기 세포에 표현 된 보여주었다. Treg 세포 apoptosis, cytokine 소비 및 세포 독성의 표현을 통해 억제를 유도 하는 granzymes의 분 비를 통해 cytolysis를 포함 하 여 메커니즘의 다양 한 통해 진압 능력을 발휘 하 여 면역 관용에 중심 역할을 담당 T-림프 구 항 4⁵. 또한, 그들은 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터 루 킨-10 (IL-10) 및 IL-35⁵등 억제 cytokines를 분 비 수 있습니다. Treg 세포 자연스럽 게 파생 될 수 있다, thymus에서 thymic 파생된 Treg (tTreg) 셀, 지정 되어 어떤 경우에 또는 케이스 주변 유도 Treg (pTreg) 셀 이라고 그 주변 기관에서 유도 될 수 있다.

헬 리오스, Ikaros 녹음 방송 요인 가족의 일원이 tTreg 세포 사이 구별을 위한 마커 이기 위하여 보고 되었다 그리고 pTreg 세포⁶. 나중에, 다른 두 그룹 Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III 수용 체 특정 조건^7,8에서 tTreg 세포에 대 한 표면 표식으로 될 수 있는 보고. 그럼에도 불구 하 고, 싱 외. 헬 리오스는 순진한 마우스⁹에서 이런이 맥락에서 더 나은 표식으로 나타났습니다.

Treg 세포의 하위 집합 및 면역 및 감염에 대 한 보호 면역 체계의 항상성 유지에 중추적인 역할. 따라서, 그것은 숫자와 림프 및 비 림프 조직에 이러한 인구의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 이를 위해, 하나의 단일 셀이이 기관에서 정지를 준비 하고있다. 여러 프로토콜 설명 또는 이전 연구에서 사용 된 있다. 주로, 자동 dissociators 이전 게시 된 보고서^10,11에 사용 되었습니다. 자동 dissociators를 사용 하는 편리 하 고 시간 절약, 하지만 그것은 비싼 절차. 따라서, normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 (끄 덕) 쥐, 및이 기관에서 격리 된 단일 셀에서 murine thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프 노드 (PDLNs) 및 spleens 단일 셀 정지를 준비 하는 수동 방법을 사용 했습니다. 이 방법은 우리의 이전 연구에서 사용 되었습니다 그리고 우리는 단일 세포 현 탁 액을 준비 하기 위한 수동 방법 자동 dissociator 방법^9,12,,1314만큼 효율적 이다 발견. 또한, 우리는 CD4의 비율을 확인 하려면 cytometry 사용⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포와 Treg 하위 집합 tTreg 및 pTreg 세포 세포. TTreg 및 pTreg 세포 tTreg 세포에 대 한 표식으로 헬 리오스와 Nrp1를 사용 하 여 구분 했다. 따라서, 우리의 결과 단일 셀을 준비 하기 위한 수동 방법 효율적으로 작동 하 고 준비 된 단일 셀 정지 추가 연구 cytometry 사용 하 여 사용 될 수 있습니다 나타냅니다.

프로토콜

웁살라 대학에서 로컬 동물 윤리 위원회 동물 실험 승인.

1. 동물에서 장기 수확

1. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 희생.
2. Thymic 샘 놓고 20 mL 섬광 튜브 또는 15 mL 원뿔 튜브 Hanks´의 5 mL로 가득 spleens 균형 소금물 (HBSS). 1.5 mL 마이크로 튜브 RPMI 1640의 1 mL로 가득에서 장소 PDLNs. 전체 thymus, 비장, 그리고 모든 PDLNs를 사용 합니다.
   참고: 기관 절차에 걸쳐 얼음에 보관 해야 하 고 탐정 thymic 면역 세포 높은 온도에서 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 이후 thymic 조직을 처리 하는 경우에 특히 단일 셀 정지를 준비 하는 동안 빠른 수 하려고 한다.

2. 단일 셀 별개로 Thymus, 비장

1. 철저 하 게 짠 다 thymus, 비장 면역 세포를 분리 하는 핀셋 한 켤레. 나머지 thymic 및 비장 캡슐을 삭제 합니다.
2. 세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 펠 릿을 형성 하기 위하여 4 ° C에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 원심 분리기를 전송 합니다. 폐기는 상쾌한.
3. 붉은 혈액 세포를 lyse 세포 현 탁 액 0.2 M NH₄Cl의 5 mL에 resuspend 하 고 10 분 반전 튜브 거꾸로 부드럽게 매 2 분 추가 5 mL는 세포를 중지 하는 외피의 끝에 HBSS의 대 한 상 온에서 품 어.
4. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
5. HBSS 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. HBSS로 튜브를 채우십시오.
6. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
7. HBSS 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. HBSS로 튜브를 채우십시오.
8. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
9. Thymus 위한 HBSS의 5 mL와 10 mL 비장에 대 한에 셀 펠 릿을 resuspend.
10. Thymic 셀 서 스 펜 션의 1 mL 및 비장 세포 현 탁 액 5 ml의 500 µ L 라운드 셀 스 트레이너 모자 하단 튜브. 셀 스 트레이너 모자에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.
    참고: 35 µ m 나일론 메쉬 모자에 통합 됩니다. 약 5-10 백만 셀 각 튜브에 수집 되었다.

3. 단일 셀 별개로 PDLN

1. 15 mL 원뿔 튜브 랙에 살 균 250 µ m 금속 메시를 놓습니다. 메쉬 RPMI의 1 mL와 린스.
2. 금속 메쉬를 림프 노드를 전송 하 고 핀셋의 쌍을 사용 하 여 메시를 통해 그들을 갈기. 튜브에 세포를 금속 메쉬에 RPMI의 1 mL를 적용 합니다. 3 번 더 반복 하 고 메시를 제거 합니다.
3. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
4. RPMI의 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 튜브를 RPMI 채우십시오.
5. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
6. RPMI의 약 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 튜브를 RPMI 채우십시오.
7. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
8. 2 ml RPMI의 셀 펠 릿을 resuspend. 이전 셀 서 스 펜 션의 2 mL 5 mL 라운드 셀 스 트레이너 모자 하단 튜브. 셀 스 트레이너 모자에 세포 현 탁 액을 적용 합니다.

4. Cytometry

1. Thymus, PDLN 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 433 x g 에서 비장 세포 정지 원심 폐기는 상쾌한.
2. Cytometry 버퍼 (버퍼 FACS) 얼룩의 100 µ L에 다음 표면 항 체와 세포 얼룩: 0.75 µ g/100 µ L CD4 FITC 활용 된 항 체, 0.60 µ g/100 µ L APC H7 활용 된 CD8 항 체, 0.30 µ g/100 µ L CD25 PE 활용 된 항 체, 5 µ L (1: 20) APC 활용 된 Nrp1 항 체입니다. 40 분 동안 얼음에 튜브를 품 어.
3. 각 튜브를 FACS 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한. 한 번 더 반복 합니다.
4. 수정 하 고 500 µ L Permeabilization 고정 버퍼 (PFB)의에서 셀 펠 릿을 resuspending 하 여 세포를 permeabilize.
   참고: PFB는 고정/Permeabilization 고정/Permeabilization 희석제의 3 부분으로 집중의 1 부분을 혼합 하 여 준비 된다.
5. 하룻밤에 4 ° C 냉장고에 튜브를 유지.
   참고: 1 시간 보육도 작동합니다.
6. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
7. 500 µ L Permeabilization 세척 버퍼 (PWB)의에서 셀 펠 릿을 resuspend. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
   참고: PWB Permeabilization diluting 준비한 증류수에 1:10 (10 배)를 버퍼.
8. PWB의 100 µ L에 다음 세포내 항 체와 세포 얼룩: 0.30 µ g/100 µ L Foxp3 PE Cy7 활용 된 항 체, 4 µ L (1: 25) 헬 리오스 PacificBlue 활용 된 항 체. 1 시간에 대 한 얼음에 튜브를 품 어.
9. 각 튜브를 PWB의 500 µ L를 추가 합니다. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
10. PWB의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 원심 관 433 x g 4 ° c.에 5 분에서 폐기는 상쾌한.
11. FACS 버퍼의 300 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
12. 에 교류 cytometer 세포 분석.
13. 측면 살포 지역, 높이 폭, 그리고 앞으로 피해 지역, 높이 너비에 따라 단일 셀 게이트 분석에 대 한 1 백만 이벤트를 실행 합니다.
14. 실험의 FCS 파일 내보내고 흐름 cytometry 분석기 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

결과

Nrp1 및 tTreg 및 pTreg 세포에 헬 리오스의 식을 조사, 우리 thymic 동맥, PDLNs 및 normoglycemic 끄 덕 임 쥐의 spleens에서에서 단일 셀을 준비 하 고 흐름 cytometric 위한 Treg 세포 마커 CD4, CD25, Foxp3, 헬 리오스와 Nrp1으로 그들을 물 분석입니다. 결과 전략 (그림 1) 게이팅 담당자와 같이 분석 되었다. 우리는 CD4 중 헬 리오스⁺ 세포의 비율을 발견⁺CD8

토론

이 연구에서 우리는 thymic 동맥, PDLNs 및 끄 덕 임 쥐의 spleens에서 단일 셀을 절연 하 고 헬 리오스와 CD4에 Nrp1의 식을 조사⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg 세포 cytometry 사용 하 여. 현재 연구는 타입-1 당뇨병의 murine 모델은 끄 덕 임 쥐가 사용 되었다. 이전 연구에서 우리는 헬 리오스 또는 Nrp1 tTreg pTreg 세포에서 세포를 구별을 위한 더 나은 표식 인지를 조사 하는 야생 타입 마우스 C...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic