Определение нормативных Т-клеток подмножеств в мышиных вилочковой железы, поджелудочной железы, дренаж лимфатических узлов и селезенки, с помощью проточной цитометрии

Резюме

Здесь мы представляем протокол подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки для дальнейшего изучения этих клеток с помощью проточной цитометрии. Кроме того этот протокол был использован для определения подмножества регулирующих Т-клеток с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Наша иммунная система состоит из числа и разнообразия иммунных клеток, включая нормативные Т-клетки (Treg) клетки. TREG клетки можно разделить на два подмножества, тимуса производных Treg (tTreg) клеток и периферически индуцированных Treg (pTreg) клеток. Они присутствуют в различных органов нашего тела и можно отличить по конкретным маркеров, например Гелиос и Нейропилины 1. Сообщается, что tTreg клетки функционально более подавляющей, чем pTreg клетки. Таким образом важно определить долю tTreg и pTreg клеток при расследовании гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы собрали тимуса желез, поджелудочной крылом лимфатических узлов и селезенки от normoglycemic-ожирением диабетических мышей, чтобы отличить tTreg клеток из pTreg клеток с помощью проточной цитометрии. Мы вручную подготовили одну ячейку суспензий от деятельности этих органов. Флюрохром конъюгированных поверхности CD4, CD8, CD25, и 1 Нейропилины антитела были использованы для запятнать клетки. Они хранились в холодильнике всю ночь. На следующий день клетки окрашивали флюрохром конъюгированных внутриклеточных Foxp3 и Гелиос антител. Эти маркеры использовались для характеризуют два подмножества Treg клеток. Этот протокол демонстрирует простой, но практический способ подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки и использовать их для анализа гранулярных последующих потоков.

Введение

Регуляторных клеток T (Treg) являются критическими для гомеостаза иммунной системы. TREG клетки определяются выражением поверхностных антигенов CD4 и CD25 и транскрипционным фактором forkhead поле P3 (Foxp3)^1,2,3. Сакагути et al. впервые показал, что CD25 выражается конститутивно на Т-супрессорной клетки мышей⁴, который предусматривает новаторские наблюдения для выявления клеток человека Treg. TREG клетки играют центральную роль в иммунной толерантности, оказав подавляющие способность через различные механизмы, включая цитолиза через секрецию granzymes навести apoptosis, цитокин потребления и ингибирование через выражение цитотоксических T-лимфоцитов антигеном 4⁵. Кроме того они могут выделяют ингибирующее цитокины такие преобразования фактор роста бета (TGF-β), интерлейкин-10 (IL-10) и Ил-35⁵. TREG клетки естественным образом могут быть получены из тимуса, в этом случае они обозначаются тимуса производных Treg (tTreg) клеток, или они могут быть вызваны в периферических органов в этом случае называются периферически индуцированных Treg (pTreg) клеток.

Helios, членом семьи фактор транскрипции Ikaros, было сообщено быть маркера для разграничения между tTreg клеток и pTreg клетки⁶. Позднее две другие группы сообщили, что Нейропилины 1 (Nrp1), semaphorin III-рецептор, может служить поверхности маркера для tTreg клеток при определенных условиях^7,8. Тем не менее Singh et al. показали, что Helios является маркер лучше в этом контексте в наивной мышей⁹.

Подмножества Treg клетки играют ключевую роль в поддержании гомеостаза иммунной системы и защиты от аутоиммунные заболевания и инфекции. Таким образом важно определить количество и долю этих групп населения в лимфоидных и не лимфоидной ткани. Для достижения этой цели, надо подготовить одну ячейку суспензий от деятельности этих органов. Ряд протоколов были описаны или используемых в ходе предыдущих исследований. Главным образом автоматическая Диссоциаторы были использованы в ранее опубликованных докладов^10,11. Использование автоматического Диссоциаторы удобно и экономия времени, но она является дорогостоящей процедурой. Таким образом мы использовали ручной метод для подготовки единого клеточных суспензий из мышиных тимуса желез, поджелудочной крылом лимфатические узлы (PDLNs) и селезенки от normoglycemic-ожирением диабетических мышей (НОД) и изолированных клеток одного из этих органов. Этот метод был использован в наших предыдущих исследований, и мы обнаружили, что ручной метод для подготовки одну ячейку подвеска так эффективно, как автоматическая диссоциатором метод^9,12,,1314. Кроме того, мы использовали проточной цитометрии для определения соотношения CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клетки и подмножества Treg клеток tTreg и pTreg клеток. TTreg и pTreg клетки были отделены с помощью Гелиос и Nrp1 как маркеры для tTreg клеток. Таким образом наши результаты показывают, что ручной метод для подготовки единого клетки работать эффективно и суспензий подготовленный одной ячейки могут в дальнейшем использоваться для исследования с использованием проточной цитометрии.

протокол

Комитет местных животных этики Уппсальского университета одобрил эксперименты на животных.

1. заготовка органов от животных

1. Пожертвуйте мышей шейки матки дислокации.
2. Место вилочковой железы железы и селезенки во флаконах сцинтилляционные 20 мл или 15 мл конические трубы заполнены с 5 мл Hanks´ сбалансированного солевого раствора (HBSS). Место PDLNs в 1,5 мл микро труб, заполненных с 1 мл раствора RPMI 1640. Используйте весь вилочковой железы и селезенки и все PDLNs.
   Примечание: Органы должны храниться на льду на протяжении всей процедуры, и следователь должен стараться быть быстро при подготовке единого клеточных суспензий, особенно при обработке ткани тимуса, поскольку тимуса иммунные клетки могут быть быстро деградации при высоких температурах.

2. одну ячейку изоляции от вилочковой железы и селезенки

1. Тщательно выжмите с парой пинцетов выпустить иммунные клетки вилочковой железы и селезенки. Отменить оставшиеся капсула селезенки и вилочковой железы.
2. Суспензию клеток передавать 15 мл Конические трубки и центрифуги на 433 x g 5 минут при температуре 4 ° C сформировать лепешки. Выбросите супернатант.
3. Чтобы лизировать красных кровяных клеток, Ресуспензируйте суспензию клеток в 5 мл 0,2 М NH₄Cl и инкубации при комнатной температуре за 10 мин инвертировать трубы вниз осторожно каждые 2 мин добавить 5 мл HBSS в конце инкубации остановить lysis.
4. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
5. Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл HBSS. Заполните трубы с HBSS.
6. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
7. Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл HBSS. Заполните трубы с HBSS.
8. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
9. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл HBSS тимуса и 10 мл для селезенки.
10. Передача 1 мл суспензии клеток тимуса и 500 мкл суспензии селезеночной клеток до 5 мл вокруг нижней трубы с ячейки сита шапки. Применить суспензию клеток к крышкам ситечко клеток.
    Примечание: 35 мкм нейлоновая сетка включена в крышку. Приблизительно 5-10 миллионов клеток были собраны в каждой тюбике.

3. одной ячейки изоляции от PDLN

1. Место стерильным 250 мкм металлической сетки над 15 мл конические пробки в стойку. Промойте сетку с 1 мл раствора RPMI.
2. Передача на лимфатические узлы в металлической сетки и растереть их через сетку, используя пинцет. Примените 1 мл RPMI на металлические сетки для сброса клетки в трубу. Повторите 3 раза и удалить сетку.
3. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
4. Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл RPMI. Заполните трубы с RPMI.
5. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
6. Ресуспензируйте Пелле клеток в приблизительно 5 мл RPMI. Заполните трубы с RPMI.
7. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
8. Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл RPMI. Передача 2 мл суспензии клеток 5 мл вокруг нижней трубы с ячейки сита шапки. Применить суспензию клеток к крышкам ситечко клеток.

4. проточной цитометрии

1. Центрифуга для клеточных суспензий из тимуса, PDLN и селезенки на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
2. Запятнать клетки с ниже поверхности антител в 100 мкл проточной цитометрии окрашивание (FACS буферу): 0,75 мкг/100 мкл CD4, FITC-конъюгированных антител, 0,60 мкг/100 мкл CD8 APC-H7-конъюгированных антител, 0.30 мкг/100 мкл CD25 PE-конъюгированных антител, 5 мкл (1:20) APC-конъюгированных антител Nrp1. Инкубируйте трубы на льду на 40 мин.
3. Добавьте 200 мкл буфера СУИМ в каждую пробирку. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант. Повторите еще раз.
4. Исправить и разрушения клеток, resuspending клетки Пелле в 500 мкл Permeabilization фиксации буфера (БМЗ).
   Примечание: PFB готовят путем смешивания 1 часть фиксации/Permeabilization концентрат с 3-х частях разбавителя фиксации/Permeabilization.
5. Держите трубы в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь.
   Примечание: 1 ч инкубации также работает.
6. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
7. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл буфера мытья Permeabilization (ПРБ). Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
   Примечание: PWB готовится путем разбавления Permeabilization буфера (10 x) до 1:10 в дистиллированной воде.
8. Запятнать клетки с следующих внутриклеточных антител в 100 мкл PWB: 0.30 мкг/100 мкл Foxp3 PE-Cy7-конъюгированных антител, антитело проспряганное PacificBlue Helios 4 мкл (1:25). Инкубируйте трубы на льду за 1 час.
9. Добавьте 500 мкл PWB каждой трубы. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
10. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл ПРБ. Центрифуга для трубы на 433 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
11. Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл буфера СУИМ.
12. Анализ на проточный цитометр ячейки.
13. Ворота одной ячейки, основанные на Scatter-Сиде, высота и ширина и вперед Scatter-площади, высоты и ширины. Запустите один миллион событий для анализа.
14. Экспортируйте файлы FCS экспериментов и анализировать их с помощью программного обеспечения цитометрии анализатор потока.

Результаты

Исследовать выражение Nrp1 и Helios на tTreg и pTreg клетки, мы подготовили отдельные ячейки из тимуса желез, PDLNs и селезенки мышей КИВНУЛ normoglycemic и окрашивали маркеры Treg клеток CD4, CD25, Foxp3, Гелиос и Nrp1 для потока гранулярных анализ. Были проанализированы результаты, как показано в п...

Обсуждение

В этом исследовании, мы изолированы единичных клеток железы тимуса, PDLNs и селезенки мышей КИВНУЛ и расследование выражение Гелиос и Nrp1 в CD4⁺CD8^–CD25⁺Foxp3⁺ Treg клеток с помощью проточной цитометрии. В настоящем исследовании были использованы NOD мышей, который является мо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15ml, 120x17mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5ml	Sarstedt	72.690.001
disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic