Um trabalho-economia e repetível Touch-Force sinalização mutante Screen Protocol para o estudo de Thigmomorphogenesis de uma planta modelo Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Resumo

Uma máquina de carregamento suave de força de toque é construída a partir de escovas de cabelo humano, braços robóticos e um controlador. As escovas do cabelo são conduzidas por braços robóticos instalados na máquina e movem-se periodicamente para aplicar a toque-força em plantas. A força dos toques de cabelo acionado por máquina é comparável à dos toques aplicados manualmente.

Resumo

As plantas que respondem às estimulações mecânicas intracelular e extracelular (ou sinais da força) e desenvolvem mudanças morfológicas especiais, um thigmomorphogenesis chamado. Em décadas passadas, vários componentes de sinalização foram identificados e relatados por estarem envolvidos na mecanotransdução (por exemplo, proteínas de ligação de íons de cálcio e enzimas de biossíntese de ácido jasmonico). Entretanto, o ritmo relativamente lento da pesquisa no estudo da sinalização da força ou do thigmomorphogenesis é atribuído pela maior parte a duas razões: a exigência para a indução mão-manipulada humana trabalhoso do toque do thigmomorphogenesis e os erros da força da força associado ao toque das pessoas. Para realçar a eficiência do carregamento externo da força em um organismo de planta, uma máquina de carregamento automática da toque-força foi construída. Este braço robótico-driven escova de cabelo toques fornecer um trabalho-economia e facilmente repetível toque-força de simulação, ilimitado rodadas de toque de repetição e ajustável força de toque. Esta máquina do carregamento da toque-força do cabelo pode ser usada para a seleção da grande escala de mutantes da sinalização da toque-força e o estudo phenomics da planta thigmomorphogenesis. Além, os materiais do toque tais como o cabelo humano, podem ser substituídos com outros materiais naturais como o cabelo animal, as linhas de seda e as fibras do algodão. Os braços moventes automatizados na máquina podem ser equipados com os bocais de aspersão da água e os sopradores de ar para imitar as forças naturais de gotas e de vento da chuva, respectivamente. Usando esta máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo em combinação com o toque Hand-realizado do cotonete de algodão, nós investigamos a resposta do toque de dois mutantes de sinalização da força, MAP kinase kinase 1 (MKK1) e plantas MKK2 . Os diferentes das plantas tipo selvagem carregadas da toque-força e dois mutantes foram avaliados estatisticamente. Eles exibiram diferenças significativas na resposta ao toque.

Introdução

O thigmomorphogenesis da planta é um termo que seja cunhado por Jaffe, MJ em 1973¹. É um tropismo vegetal, mas diferente do conhecido fototropismo ou gravitropismo causado por estímulos de luz solar ou gravidade^2,3. Descreve alterações fenotípicas associadas a estímulos mecânicos periódicos, que têm sido freqüentemente observados por botânicos em épocas anteriores^4,5. Pingos de chuva, vento, planta, animal e toques humanos, mesmo mordidas de animais, são todos considerados diferentes tipos de estímulos Mecano que desencadeiam a sinalização de força em plantas^4,5. As características do thigmomorphogenesis da planta incluem o atraso de aparafir, de uma haste mais curta, de um tamanho menor da roseta/folha em plantas herbáceas, e de uma haste mais grossa em plantas arborizados^6,7,8. Isto é diferente da resposta movimentos ou thigmotropic encontrada frequentemente na planta do Mimosa ou em outras videiras mechano-sensíveis, onde estas respostas rápidas do toque são mais fáceis de ser observadas^1,9,10. O thigmomorphogenesis, de um lado, é relativamente difícil de ser observado por causa de sua resposta lenta do crescimento. O thigmomorphogenesis é observado geralmente depois das semanas ou mesmo dos anos de estimulação contínua da força-carregamento. Esta natureza original da resposta do toque da planta faz difícil executar uma tela genética para diante usando a estimulação humana do toque da mão para isolar os mutantes resistentes da sinalização da toque-força em uma maneira robusta.

Para elucidar as vias de transdução de sinal de força e os mecanismos moleculares subjacentes ao thigmomorphogenesis^6,11, molecular e celular experimentos biológicos têm sido realizados nos últimos^{6, 12,13,14}. Estes estudos têm proposto que os receptores de sinal de força vegetal consistem principalmente em canais de íons mecanosensíveis (MSC) e os complexos de MSC tethered compostos por complexos multiméricos de proteínas de abrangência de membrana^{11,12 , 15}. o pico de CA^{2 +} transiente citoplasmático gerado dentro de segundos do toque inicial. Vento-, chuva-, ou gravi-estimulação pode interagir com os sensores de cálcio a jusante para transduce os sinais de força para eventos nucleares^14,16,17,18. Além do que estudos moleculars e celulares, a tela genética para diante com toque manual do dedo das plantas encontrou que os fitormônios e os Metabolites secundários são involvidos na expressão de gene toque-inducible (tch) conseqüente que segue o carga da força de toque^13,19. Para exemplos, aos e OPR3²⁰ mutantes foram identificados assim distante dos estudos genéticos. Entretanto, o problema principal associado com a aplicação da genética para diante no estudo do thigmomorphogenesis é ainda o trabalho intensivo exigido para quantificar o nível de resposta do toque e tocar em uma grande população de mutado genetically plantas individuais. O problema demorado igualmente persiste na tela tocante-baseada do mutante da mão^14,20. Para um exemplo, para completar uma rodada de estimulação de força de toque, uma pessoa precisa tocar 30-60 vezes (um toque por segundo) em uma planta individual. A fim ter bastante número de plantas para a análise estatística do phenotype, 20-50 plantas individuais do mesmo genótipo são exigidas normalmente para o processo do carregamento da toque-força. Este regime de carregamento da força de toque significa que uma pessoa precisa de executar repetitivamente 600-3000 toques em um genótipo da escolha. Este tipo de toque normalmente precisa ser repetido 3 a 5 rodadas por dia, que equivale a cerca de 1800-15000 dedo ou cotonete toques por dia por genótipo de plantas. Uma pessoa bem treinada é normalmente necessária para manter a força e força de múltiplos toques dentro de uma faixa desejável ao longo de muitas rodadas de repetição em um dia para evitar a grande variação na força e força. Como é sabido que o thigmomorphogenesis é um processo saturável e dose-dependente^6,21, força/força do toque torna-se crítico a um sucesso em provocar a resposta do toque de uma planta.

Para remover o carregamento de força de toque dependente da pessoa e para manter a aplicação mecânica dentro de um intervalo de erro aceitável¹⁴, nós projetamos conseqüentemente uma máquina de carregamento automática da toque-força para substituir os toques Hand-manipulados. A máquina tem 4 braços moventes construídos, cada qual é equipado com a uma escova de cabelo humana. Esta versão é nomeada modelo K1 para especificar sua característica do carregamento do toque-força do cabelo humano. Se 4 genótipos são medidos quantitativamente por sua thigmomorphogenesis ou resposta do toque uma máquina, 40-48 indivíduos por o genótipo podem ser medidos. Cada rodada de repetição de toque (menos de 60 vezes de toque por planta) dura menos de 5 minutos usando um braço robótico ajustável de velocidade móvel. Assim, as plantas em uma máquina do toque do modelo K1 podem mecanicamente ser estimuladas para círculos múltiplos um o dia ou com um carregamento constante da toque-força ou níveis diferentes de forças como programado inicialmente.

Arabidopsis Arabidopsis thaliana, um organismo modelo da planta, foi escolhida conseqüentemente como a espécie da planta do alvo para testar a aplicação inteiramente automática da máquina do carregamento da toque-força do cabelo. Porque há diversos grandes bancos de sementes disponíveis para recuperar os vários germplasms dos mutantes e o tamanho da florescência, Arabidopsis cabe bem ao espaço disponível na prateleira do crescimento montada com a máquina do toque do modelo K1.

A máquina automática do toque do modelo K1 consiste em três componentes principais: (1) a cremalheira do metal da H-forma compor por dois atuadores lineares correia-conduzidos, (2) braços robóticos do metal equipados com as escovas de cabelo, e (3) um controlador. Para uma máquina de toque modelo K1 personalizada, cada módulo de eixo X/Y é composto por um trilho-guia acionado por correia, dois blocos de slides (vermelho) e motor deslizante 1 57 (pré-instalado e desmontável) (Figura 1a,B). O atuador horizontal superior permite que o braço de metal robótico se mova para a esquerda e para a direita horizontalmente, o atuador linear com acionamento vertical inferior permite que o braço de metal robótico mova para cima e para baixo verticalmente (Figura 1B, Figura 2a ). Quatro braços robóticos desmontáveis foram instalados no atuador vertical (Figura 1C, Figura 2B). Quatro escovas de cabelo humano foram ligadas a quatro braços robóticos, respectivamente (Figura 1C, Figura 2B). Todas as peças mecânicas para construir a máquina de toque modelo K1 na fonte em negrito abaixo são marcadas na Figura 1C (ver também a tabela de materiais).

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Protocolo

1. preparação de sementes

Nota: as sementes de Arabidopsis de ambos os tipos selvagens (Col-0) assim como os mutantes mkk1 e mkk2 da perda--função usadas foram compradas do centro de recursos biológicos de arabidopsis (ABRC, https://www.Arabidopsis.org, Columbus, Oh).

1. Calcule Quantos indivíduos vegetais de cada genótipo serão utilizados para uma análise estatística fiável. Prepare um número suficiente de sementes com base na taxa de germinação de cada linha, geralmente 4-5 vezes mais do que o que é necessário para um experimento. Assegure o número suficiente de plantas saudáveis e uniforme-feitas medida pode ser usada para o ensaio da resposta do toque. De acordo com este protocolo, 300-500 sementes por genótipo são geralmente utilizados para produzir 80-90 plantas de tamanho semelhante.
2. Mergulhe as sementes em água fria e guarde-as em 4 ° c (cobertas com folha de alumínio para manter no escuro) para embebição de sementes. Semeie as sementes 5-7 dias após a embebição.

2. crescimento vegetal

1. Selecione o solo apropriado para o crescimento da planta (veja a tabela de materiais). Evite grandes aglomerantes e misture-os homogeneamente.
2. Prepare 24 copos plásticos: a capacidade da terra arrendada é 207 mL e o diâmetro superior da borda é 7,4 cm. perfure três furos redondos na parte inferior de um copo para a finalidade da irrigação.
3. Encha estes copos plásticos com o solo misturado. Deixe o solo empilhe até 1-2 cm mais altamente do que a borda do copo e aplainar a superfície do solo empilhou macia.
4. Transfira 24 copos em uma bandeja plástica (21 polegadas x 10,8 polegadas x 2,5 polegadas) e coloc a bandeja a condição clara constante (veja abaixo).
5. Adicione 2,5 L de água em cada bandeja duas horas antes da semeadura da semente. Deixe o solo absorver a água dos furos situados nas partes inferiores dos copos e esperar para que a superfície do solo deixe cair ao nível da borda do copo.
6. Semeie 3-4 sementes em um único ponto, e 4 pontos uniformemente distribuídos dentro de um copo.
7. Coloc uma tampa plástica transparente acima de cada bandeja, e deixe sementes germinar por uma semana. Em seguida, retire a tampa e permita que as mudas cresçam por mais uma semana.
8. Remova plantas extra diluindo e mantenha 4 indivíduos da planta do tamanho similar em cada copo 9-10 dias após a sementeira da semente.
9. Irrigar plantas com 1,5 L de água todos os dias após a germinação das sementes.

3. condição de crescimento

1. Definir a temperatura da câmara de crescimento em 23,5 ± 1,5 ° c, e umidade entre 35 e 45%.
2. Ajuste a intensidade luminosa entre 180 e 240 μE ∙ m^-2∙ s^-1 (medido pelo RADIÓMETRO da pesquisa de Il 1700, luz internacional)¹⁴. A radiação fotossintética ativa é de 90 a 120 μE ∙ m^-2∙ s^-1.
3. Defina a condição de luz para ser 24 h constante.

4. a construção da máquina de carregamento da toque-força

Nota: esta máquina de carregamento de força de toque de cabelo robótico (modelo K1) foi concebida para servir para fins de detecção de mutantes de sinalização de força táctil e geração de thigmomorfogênese de plantas (Figura 1, Figura 2).

1. Módulos de pré-instalação (desmontável, Figura 1C)
   1. Instale dois blocos de slides (I) e um motor deslizante 57 (II) no módulo de guia-trilho de eixo X/Y (III/V).
   2. Instale dois blocos de slides (I) na viga auxiliar do eixo X/Y (IV/VI).
2. Instalação de outras peças mecânicas (Figura 1C)
   1. Fixe o módulo do guia-trilho do eixo X (III) e a viga auxiliar do eixo x (IV) junto montando duas placas de junção (VII) em cada extremidade do guia-trilho.
   2. Fixar o eixo Y guia-Rail módulo (V) para o dorsal de dois blocos de slides (eixo X) em uma posição de cruzamento através da montagem de duas placas de junção (VIII) no meio.
   3. Fixar a viga auxiliar do eixo Y (vi) no dorsal dos outros dois blocos de slides (eixo X) em uma posição de cruzamento, montando duas placas de junção (VIII) no meio.
   4. Monte o suporte dos braços do robô (IX) na frente de dois blocos de slides (eixo Y) em uma posição de cruzamento com uma placa de junção (Figura 2a).
   5. Montar 4 escovas de cabelo (X) nos braços do robô (IX) com grampos (Figura 2B).

5. ajuste da máquina de carregamento da toque-força

Nota: todos os parâmetros de controle para definir o modelo K1 Touch Machine na fonte em negrito abaixo são mostrados no painel de controle (Figura 2F).

1. Instale escovas de cabelo toque sobre os braços robóticos. Use uma régua de aço 330 mm-Long como um suporte para fixar uma camada de cabelo humano (3600-4600 cabelos/escova) uniformente. O comprimento do cabelo é de 126 mm (Figura 1C).
2. Fixar as réguas de aço sobre os braços robóticos com duas braçadeiras de metal.
3. Defina a altura dos braços da máquina ao longo da dimensão vertical (eixo Y) primeiro. Pressione jog F + para elevar e jog R- para abaixar os braços robóticos e escovas. Deixe a ponta de escovas de cabelo 0,5 cm mais baixo do que a borda do copo. Pressione o conjunto de zero. Pre-Run a máquina 1-2 ciclos para certificar-se de todos os indivíduos da planta estão sendo tocados. Ajustar e calibrar as escovas e pontas do cabelo para a mesma altura todos os dias durante todo o período de toque.
4. Use uma balança eletrônica para medir a força de toque (carregamento vertical) e manter o nível de força de toque em 1-2 mN¹⁴.
5. Defina a posição inicial dos braços da máquina ao longo da dimensão horizontal (eixo X) manualmente. Permita que as escovas de cabelo pendurem na borda de cada bandeja e certifique-se de que nenhuma planta está sendo tocada antes que o experimento tocante comece. Pressione jog F +/jog R- para mover o braço da máquina horizontalmente pouco a pouco para definir a posição inicial.
6. Defina a distância de viagem da escova de cabelo na dimensão horizontal (eixo X) para 365 mm pressionando o botão de viagem . Pressione Inc. F +/Inc. R- para mover os braços da máquina para obter uma distância de viagem completa e garantir que todas as plantas tratadas estão sendo tocadas durante todo o experimento tocante.
7. Ajuste a velocidade de movimento ao longo do eixo X dos braços da máquina em 5.000 mm/min pressionando o botão de velocidade automática . Mantenha a mesma velocidade de movimento durante toda a experiência tocante.
8. Defina o tempo de toque em 20 ensaios pressionando o botão ciclo menor . Mantenha o mesmo número de toques por rodada durante todo o experimento tocante.
   Nota: um ciclo menor é igual a duas distâncias de viagem , o que significa que os braços da máquina se movem da posição inicial para a posição final e depois voltam para a posição inicial. Um ciclo menor gera dois toques. Escovas de cabelo tocar plantas 40 vezes dentro de 20 ensaios (2 toques x 20 ensaios = 40 toques). O 40-Touch é definido para ser uma rodada de carga de força de toque.
9. Defina o intervalo de repetição do touch-round em 480 min por dia pressionando o botão de período principal . Mantenha a mesma frequência de rodadas de toque durante toda uma experiência tocante.
   Nota: isso permite que as escovas de cabelo para tocar plantas para 3 rodadas por dia, eo tempo de intervalo entre cada rodada é 480 min (8 h). O número azul exibido representa o tempo de intervalo de cada rodada de toque. A máquina iniciará uma nova rodada de toque automaticamente quando a contagem regressiva abaixo (número vermelho) se transforma em 0000.
10. Defina o ciclo principal em 12 ensaios, o que significa que a máquina irá tocar plantas para 12 rodadas dentro de um período de 4 dias automaticamente. Esta configuração de 12 ensaios é usado para evitar erro humano em pular um dia de tocar.
11. Pressione o botão Iniciar para iniciar o programa pré-definido. A máquina do toque do modelo K1 executará automaticamente o carregamento da força do toque de acordo com ajustes.

6. análise e coleta de dados fisiológicos

1. Dias para aparafir: Registre o dia de aparafação de cada planta individualmente dentro de um experimento tocante. O bolting é um símbolo que uma planta muda seu estágio do crescimento da fase vegetativa à fase reprodutiva. Em Arabidopsis, o dia de aparafusamento é definido como o número de dias utilizados por uma planta para ter sua primeira haste de inflorescência atingir 1 cm de comprimento.
   Nota: a condição de crescimento descrita acima, a aparafação de plantas tipo selvagem normalmente inicia de 19 a 23 dias após a semeadura da semente e termina em 28-32 dias.
2. Raio da roseta: Meça a distância do centro da roseta à ponta da folha a mais longa.
   1. Tire fotos de toda a bandeja a partir do topo. Tire fotos do grupo de controle e do grupo tratado por toque separadamente.
   2. Baixe o software apropriado. Use o software baixado gratuitamente ImageJ (https://ImageJ.nih.gov/IJ/download.html) por exemplo.
   3. Abra um arquivo de foto, use a função de zoom para ampliar a foto em um tamanho apropriado.
   4. Escolha a ferramenta reta para desenhar uma linha reta entre o centro da roseta e a ponta de uma folha mais longa para medir o raio da roseta.
   5. Selecione uma planta e pressione o botão esquerdo para desenhar uma linha reta do centro da roseta até a ponta mais longa da folha.
   6. Escolha a função Analyze-Measure ou pressione Ctrl + M para analisar a distância da linha.
   7. Selecione um copo e repita os dois passos anteriores para analisar o diâmetro de cada copo de plástico ao mesmo tempo. Use esses dados para executar o cálculo para eliminar o viés resultante da tomada de fotos.
      Nota: a equação é:
      R_a/d_a = r_m/d_m
      (R_a, o raio real de Rosette de uma planta; D_a, o diâmetro real do copo plástico; R_m, o raio Rosette medido da mesma planta determinada por um software; D_m, o diâmetro medido do copo plástico que é usado para crescer a mesma planta)
3. Rosette área: medir a área de superfície horizontal 2-dimensional de folhas de Roseta.
   1. Retire a inflorescência sem afetar o resto dos órgãos de Roseta.
   2. Tire fotos do topo de cada planta junto com uma régua de escala colocada nas proximidades.
   3. Use um plugin gratuito de ImageJ, Rosette Tracker e siga o protocolo publicado anteriormente²².

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Resultados

A máquina de carregamento automática do toque-força do cabelo
Para a observação de alterações morfológicas nas plantas, tanto as condições de crescimento reprodutíveis quanto os métodos de tratamento são fundamentais para a obtenção de resultados repetíveis. Esta triagem de sinalização mutante de alta produtividade e força de toque automática é alcançada pela máquina de carregamento de força de toque de cabelo recém-construída, modelo K1 (Figura 1

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Discussão

Thigmomorphogenesis é uma resposta complexa do crescimento de planta para perturbações mecânicas, que envolve uma rede da sinalização e da ação celulares de phytohormones. É uma consequência da evolução adaptativa das plantas para sobreviver as condições ambientais indesejáveis^25,26. O toque mecânico, especialmente o toque humano do dedo e o toque Hand-Held do cotonete de algodão, foram selecionados para estudar estas mudanças morfológicas em e...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 hair brushes		customized
4 robot arms with one holder		customized	1000 mm length holder and 560 mm length robot arm
57 stepper motor		57HS22-A
All purpose potting soil	Plantmate, Hong Kong
Arabidopsis plant seeds	Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH		For arabidopsis seed purchase
BIO-MIX potting substratum	Jiffy Products International BV, the Netherlands	1000682050	Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and  BIO-MIX is 1:2
IL 1700 research radiometer	International Light, Newburyport, MA		The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/download.html		Free downloaded software
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited	Shenzhen, China		For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase
Junction plate of the slide block			To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks
Junction plate of the X axis module		customized	To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder
Slide block
WDT4045 X axis guide-rail module		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
WDT4045 Y axis guide-rail module		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
X axis auxiliary girder		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks
Y axis auxiliary girder		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks