모델 식물 애기장대 의 Thigmomorphogenesis의 연구를 위한 노동 절약 및 반복 가능한 터치 포스 신호 돌연변이 스크린 프로토콜

요약

부드러운 터치 포스 로딩 기계는 인간의 머리 브러시, 로봇 팔 과 컨트롤러에서 내장되어 있습니다. 헤어 브러쉬는 기계에 설치된 로봇 팔에 의해 구동되며 주기적으로 이동하여 식물에 터치 포스를 가합니다. 기계 구동 헤어 터치의 강도는 수동으로 적용된 터치의 강도와 비슷합니다.

초록

세포내 및 세포외 기계적 자극(또는 힘 신호)에 반응하는 식물은 특별한 형태학적 변화를 일으킵니다. 지난 수십 년 동안, 몇몇 신호 성분은 메카노트랜스덕션(예를 들어, 칼슘 이온 결합 단백질 및 자스몬산 생합성 효소)에 관여하기 위해 확인되고 보고되었다. 그러나, 힘 신호 또는 thigmomorphogenesis의 연구에서 연구의 상대적으로 느린 속도는 크게 두 가지 이유에 기인: 힘든 인간의 손으로 조작 터치 유도에 대 한 요구 사항 thigmomorphogenesis 및 힘 강도 오류 사람의 손터치와 관련이 있습니다. 식물 유기체에 대한 외부 하중의 효율성을 향상시키기 위해 자동 터치 포스 로딩 기계가 제작되었습니다. 이 로봇 팔 구동 헤어 브러시 터치는 노동력을 절약하고 쉽게 반복 할 수있는 터치 포스 시뮬레이션, 무제한 터치 반복 및 조정 가능한 터치 강도를 제공합니다. 이 모발 터치 포스 로딩 기계는 터치 포스 신호 돌연변이의 대규모 스크리닝과 식물 의 회모 형성의 페노믹스 연구에 모두 사용될 수 있다. 또한, 인간의 머리카락과 같은 터치 재료는 동물 털, 실크 스레드 및 면섬유와 같은 다른 천연 재료로 대체 될 수 있습니다. 기계의 자동 이동 암에는 각각 빗방울과 바람의 자연적인 힘을 모방하기 위해 물을 뿌리는 노즐과 에어 블로어가 장착 될 수 있습니다. 이 자동 헤어 터치 포스 로딩 기계를 손으로 수행 된 면봉 터치와 결합하여, 우리는 두 개의 힘 신호 돌연변이, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) 및 MKK2 식물의 터치 응답을 조사했습니다. . 접촉력 로드 야생형 식물 및 2개의 돌연변이체의 현상을 통계적으로 평가하였다. 그들은 터치 응답에 상당한 차이를 나타냈다.

서문

식물 티그모모포제네시스는 1973년 MJ자페에 의해 만들어진용어이다. 그것은 식물 tropism하지만 햇빛이나 중력의 자극에 의해 발생하는 잘 알려진 포토로피즘 또는중력과 는 다른 2,³. 그것은 주기적인 기계적인 자극과 관련되었던 표현형 변경을 기술합니다, 이전 시간^4,5에서식물학자에 의해 빈번히 관찰되었습니다. 빗방울, 바람, 식물, 동물 및 인간의 손길, 심지어 동물물림조차도 식물^4,5에서힘 신호를 유발하는 메카노 자극의 상이한 유형으로 간주된다. 식물 의 특징은 볼팅의 지연을 포함, 짧은 줄기, 초본 식물에서 작은 장미 / 잎 크기, 우디 식물두꺼운 줄기^6,7,8. 이것은 미모사 식물 또는 다른 메카노에 민감한 덩굴에서 흔히 발견되는 티그모나스틱 또는 티그모트로픽 반응과는달리, 이러한 빠른 터치 반응이 관찰되기 쉬운 1,^9,10. 반면, 티그모모포제네시스는 성장 반응이 느리기 때문에 관찰하기가 상대적으로 어렵다. Thigmomorphogenesis는 일반적으로 연속적인 힘 하중 자극의 주 또는 년 다음 에 따라 관찰됩니다. 식물 터치 반응의 이 독특한 특성은 강력한 방식으로 터치 포스 신호 내성 돌연변이를 격리하기 위해 인간의 손 터치 자극을 사용하여 전방 유전 스크린을 수행하기 어렵게 만든다.

지난 6일, ^{6, 11, 분자 및 세포 생물학적 실험이 수행되어 온 힘 신호 전이 경로 및 분자 기전을 해명하기 위해, 11, 12,13,14}. 이러한 연구는 식물력 신호 수용체가 주로 메카노민성 이온 채널(MSC)과 막 스패니어 단백질의 다중 복합체로 구성된 테더드 MSC 복합체로 구성된다는 것을 제안했습니다^{11,14 , 15}. 세포질 Ca²⁺ 과도 스파이크는 초기 터치의 초 이내에 생성. 바람, 비, 또는 그라비 자극은 핵 이벤트^{14,16,17,18에}힘 신호를 변환하기 위해 다운스트림 칼슘 센서와 상호 작용할 수 있다. 분자 및 세포 연구 이외에, 식물의 수동 손가락 접촉을 가진 전방 유전 스크린은 식물 호르몬 및 이차 대사 산물이 다음의 결과적인 터치 유도성 (TCH) 유전자 발현에 관여한다는 것을 것을을 발견했습니다 터치 포스 로딩^13,19. 예를 들어, aos 및 opr3²⁰ 돌연변이체는 유전 학원으로부터 지금까지 확인되었습니다. 그러나, thigmomorphogenesis의 연구 결과에 있는 전방 유전학의 응용과 관련되었던 중요한 문제점은 아직도 접촉 반응의 수준을 양량화하고 유전으로 돌연변이된의 큰 인구를 만지기 위하여 요구된 집중적인 노동입니다 개별 식물. 시간 소모적인 문제는 또한 손 만지기 기반 돌연변이^{화면(14,20)에서}지속된다. 예를 들어, 터치 포스 자극의 한 라운드를 완료하려면, 사람은 개별 식물에 30-60 번 (초당 원터치)을 터치해야합니다. 통계적 표현형 분석을 위한 충분한 수의 식물을 갖기 위해서는, 동일한 유전자형의 20-50개의 개별 식물이 일반적으로 터치 포스 로딩 공정에 필요합니다. 이 터치 포스 로딩 정권은 사람이 반복적으로 선택의 한 유전자형에 600-3,000 터치를 수행 할 필요가 있음을 의미한다. 이 유형의 터치는 일반적으로 식물의 유전자 형 당 하루에 약 1,800-15,000 손가락 또는 면봉 터치와 같은 하루에 3 ~ 5 라운드를 반복해야합니다. 잘 훈련 된 사람은 일반적으로 힘과 강도의 큰 변화를 피하기 위해 하루에 반복의 많은 라운드를 통해 바람직한 범위 내에서 여러 접촉의 강도와 힘을 유지하는 데 필요합니다. 티그모모포제네시스는 포화및 투여량 의존적 과정6,^21,터치력/강도가 식물의 터치 반응을 촉발시키는 데 성공하는 데 매우 중요한 것으로 알려져 있다.

사람에 의존하는 터치 포스 하중을 제거하고 허용 가능한 오차 범위¹⁴내에서 기계적 적용을 유지하기 위해 수동 조작 된 터치를 대체하는 자동 터치 포스 로딩 기계를 설계했습니다. 이 기계에는 4 개의 움직이는 팔이 내장되어 있으며, 각 팔에는 하나의 인간 헤어 브러시가 장착되어 있습니다. 이 버전은 인간의 머리카락 터치 힘 하중의 기능을 지정하기 위해 모델 K1이라는 이름입니다. 4개의 유전자형이 1개의 기계의 밑에 그들의 thigmomorphogenesis 또는 접촉 반응을 위해 정량적으로 측정되는 경우에, 유전자형 당 40-48명의 개별은 측정될 수 있습니다. 각 터치 반복(식물당 60회 미만의 터치)은 움직이는 속도 조절식 로봇 팔을 사용하여 5분 미만지속됩니다. 따라서 Model K1 터치 머신의 플랜트는 처음에 프로그래밍된 대로 일정한 터치 포스 로딩 또는 다양한 강도 레벨로 하루에 여러 라운드를 기계적으로 자극할 수 있습니다.

애기장대,모델 식물 유기체, 따라서 전자동 헤어 터치 포스 로딩 기계 응용 프로그램을 테스트하기위한 대상 식물 종으로 선택되었다. 돌연변이의 다양한 세균과 꽃의 크기를 검색 할 수있는 여러 개의 큰 종자 은행이 있기 때문에, 애기장은 모델 K1 터치 기계와 함께 장착 성장 선반에서 사용할 수있는 공간에 잘 맞는.

Model K1 자동 터치 머신은 (1) 벨트 구동 선형 액추에이터 2개로 구성된 H자형 금속 랙, (2) 헤어 브러시가 장착된 로봇 금속 암, (3) 컨트롤러의 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 맞춤형 모델 K1 터치 머신의 경우 각 X/Y 축 모듈은 벨트 구동 가이드 레일 1개, 슬라이드 블록 2개(빨간색) 및 57스테퍼 모터 1개(사전 설치 및 분리 가능)로 구성됩니다(그림1A, B). 상부 수평 액추에이터는 로봇 금속 암이 좌우로 수평으로 움직일 수 있게 해주며, 하부 수직 벨트 구동 선형 액추에이터는 로봇 금속 암이 수직으로 위아래로 움직일 수 있게 합니다(그림1B, 그림 2AA) ). 4개의 분리가능한 로봇 암이 수직 액추에이터에 설치되었다(그림1C, 도 2B). 4개의 인간 모발 브러쉬는 각각 4개의 로봇 팔에 결합되었다(도1C, 도 2B). 모델 K1 터치 머신을 아래 굵게 표시된 글꼴로 구성하는 모든 기계 부품은 그림 1C에 표시됩니다(재질 표참조).

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프로토콜

1. 종자 준비

참고: 야생형(Col-0)의 애기장대 종자뿐만 아니라 MKk1 및 mkk2 기능 상실 돌연변이체는 애기장대 생물자원센터(ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH)로부터 구입하였다.

1. 신뢰할 수 있는 통계 분석을 위해 각 유전자형의 얼마나 많은 식물 개인을 사용할지 계산합니다. 각 라인의 발아 속도에 따라 충분한 수의 씨앗을 준비하십시오( 일반적으로 실험에 필요한 것보다 4-5 배 더 많은 시간). 터치 응답 분석에 사용할 수 있는 건강하고 균일한 크기의 식물의 수를 충분히 보장합니다. 이 프로토콜에 따르면, 유전자형 당 300-500 씨앗은 일반적으로 비슷한 크기의 80-90 식물을 생산하는 데 사용됩니다.
2. 차가운 물에 씨앗을 담그고 4 °C (알루미늄 호일로 덮여 서 어둡게 유지)에 저장하여 종자 침폐를 하십시오. 씨앗을 뿌리고 5-7 일 후에 심미를 뿌린후.

2. 식물 성장

1. 식물 성장에 적합한 토양을 선택합니다(재료 표참조). 큰 덩어리를 피하고 균일하게 섞는다.
2. 24 플라스틱 컵 준비 : 보유 용량은 207 mL이며 상부 림 직경은 7.4 cm입니다. 관개 목적으로 컵 바닥에 세 개의 둥근 구멍을 뚫습니다.
3. 혼합 토양이 플라스틱 컵을 채웁니다. 컵 테두리보다 1-2cm 더 높은 토양을 쌓아 놓고 쌓인 토양의 표면을 부드럽게 평평하게 합니다.
4. 24컵을 플라스틱 트레이(21인치 x 10.8인치 x 2.5인치)에 옮기고 트레이를 일정한 조명 조건(아래 참조)에 놓습니다.
5. 씨앗 파종 하기 2 시간 전에 각 트레이에 물 2.5 L을 추가 합니다. 토양이 컵의 바닥에있는 구멍에서 물을 흡수하고 컵 림 수준으로 떨어질 토양의 표면을 기다립니다.
6. 한 자리에 3-4 씨앗을 뿌리고, 컵 안에 4 개의 고르게 분포된 반점을 뿌림.
7. 각 트레이 위에 투명한 플라스틱 커버를 놓고 씨앗을 일주일 동안 발아시십시오. 그런 다음 덮개를 제거하고 모종을 다른 주 동안 자라고 합니다.
8. 숱이 에 의해 여분의 식물을 제거하고 유지 4 각 컵에 비슷한 크기의 식물 개인 9-10 종자 파종 후 일.
9. 씨앗이 발아 한 후 격일로 1.5 L의 물로 식물을 관개하십시오.

3. 성장 상태

1. 성장 챔버의 온도를 23.5 ±1.5 °C로 설정하고 35 ~45 %의 습도를 설정합니다.
2. 180 및 240 μE∙m^-2∙s^-1 사이의 광 강도를 설정 (IL 1700 연구 방사계, 국제 빛에 의해 측정)^14. 광합성 활성 방사선은 90~120μE∙m^-2∙s^-1이다.
3. 라이트 조건을 24시간 상수로 설정합니다.

4. 터치 포스 로딩 기계의 건설

참고 : 이 로봇 헤어 터치 포스 로딩 기계 (모델 K1)는 터치 포스 신호 돌연변이 스크리닝 및식물 의 시그모모포제생성 을 모두 목적으로 설계되었습니다 (그림 1, 그림2).

1. 사전 설치 모듈(분리 가능, 그림 1C)
   1. X/Y 축 가이드 레일 모듈(III/V)에슬라이드 블록 2개(I)와 57스테퍼 모터(II) 1개를 설치합니다.
   2. X/Y축 보조 거더(IV/VI)에두 개의 슬라이드 블록(I)을 설치합니다.
2. 기타 기계 부품 설치(그림1C)
   1. 가이드 레일의 각 끝에 두 개의 접합 플레이트(VII)를 조립하여 X축 가이드 레일 모듈(III) 및 X축 보조 거더(IV)를 함께 고정합니다.
   2. Y축 가이드 레일 모듈(V)을 두 개의 접합판(VIII)을 그 사이에 조립하여 교차 위치에서 두 개의 슬라이드 블록(X축)의 등쪽 위에 고정합니다.
   3. Y축 보조 거더(VI)를 다른 두 슬라이드 블록(X축)의 등쪽 위에 고정하여 그 사이에 두 개의 접합판(VIII)을 조립하여 교차 위치에 놓습니다.
   4. 로봇 암(IX)의 홀더를 접합판이 있는 교차 위치에서 두 개의 슬라이드 블록(Y축)의 전면에 조립합니다(그림2A).
   5. 4개의 헤어 브러쉬(X)를 클램프로 로봇 암(IX)에 조립합니다(그림2B).

5. 터치 포스 로딩 기계 설정

참고: 모델 K1 터치 머신을 아래 굵게 표시된 글꼴로 설정하는 모든 제어 매개 변수는 제어 판넬에 표시됩니다(그림2F).

1. 터치 헤어 브러시를 로봇 팔에 설치합니다. 330mm 길이의 강철 눈금자를 홀더로 사용하여 사람의 머리카락 한 겹(3,600-4,600개의 머리카락/브러시)을 균등하게 고정합니다. 머리카락의 길이는 126mm입니다 (그림1C).
2. 두 개의 금속 클램프로 로봇 팔에 강철 눈금자를 고정합니다.
3. 수직 치수(Y축)를 따라 기계 암의 높이를 먼저 설정합니다. 조그 F+를 눌러 높이고 조그 R-를 눌러 로봇 팔과 브러시를 낮춥춥습니다. 머리 끝을 컵 테두리보다 0.5cm 낮게 브러쉬합니다. 제로 세트를누릅니다. 기계 1-2 사이클을 미리 실행하여 모든 식물 개인이 만지고 있는지 확인하십시오. 브러쉬와 헤어 팁을 전체 터치 기간 동안 매일 같은 높이로 조정하고 보정합니다.
4. 전자 스케일을 사용하여 터치 력(수직 하중)을 측정하고 1-2 mN^14에서터치 력 레벨을 유지합니다.
5. 수평 치수(X축)를 따라 기계 암의 시작 위치를 수동으로 설정합니다. 헤어 브러쉬가 각 트레이의 가장자리에 매달려 있는지 확인하고 만지는 실험이 시작되기 전에 식물이 만지지 않도록 하십시오. 조그 F+/조그 R-를 눌러 기계 암을 수평으로 조금씩 움직여 시작 위치를 설정합니다.
6. 이동 버튼을 눌러 머리 브러시 이동 거리를 수평 치수(X축)에서 365mm로 설정합니다. 프레스 Inc. F + /Inc. R-전체 이동 거리를 얻고 처리 된 식물의 모든 전체 터치 실험 중에 만지고 있는지 확인하기 위해 기계 팔을 이동합니다.
7. 자동 속도 버튼을 눌러 기계 암의 X축을 따라 이동 속도를 5,000mm/min로 설정합니다. 전체 터치 실험 중에 동일한 이동 속도를 유지합니다.
8. 마이너 사이클 버튼을 눌러 20 번의 시험에서 터치 시간을 설정합니다. 전체 터치 실험 중에 라운드당 동일한 횟수를 유지합니다.
   주: 하나의 마이너 사이클은 두 개의 이동 거리와 같으며, 이는 기계 암이 시작 위치에서 끝 위치로 이동한 다음 다시 시작 위치로 이동한다는 것을 의미합니다. 하나의 사소한 주기는 두 개의 터치를 생성합니다. 헤어 브러쉬는 20번의 시험 에서 식물을 40 번 만집니다 (2 터치 x 20 번의 시험 = 40 터치). 40터치는 터치 포스 로딩의 한 라운드로 정의됩니다.
9. 메이저 피리어드 버튼을 눌러 터치 라운드의 반복 간격을 하루 480분으로 설정합니다. 전체 터치 실험 중에 터치 라운드의 주파수를 동일하게 유지합니다.
   참고 : 이것은 헤어 브러시가 하루에 3 라운드 동안 식물을 터치 할 수 있으며, 각 라운드 사이의 간격 시간은 480 분 (8 시간)입니다. 표시된 파란색 숫자는 각 터치 라운드의 간격 시간을 의미합니다. 아래 카운트 다운 (빨간색 번호)가 0000으로 바뀌면 기기가 자동으로 새로운 터치 라운드를 시작합니다.
10. 12번의 시험에서 주요 주기를 설정하면 기계가 4일 이내에 12회 동안 식물을 자동으로 만질 수 있습니다. 12 개의 시험의이 설정은 만지는 하루를 건너 뛰는 인간의 실수를 피하기 위해 사용됩니다.
11. 시작 버튼을 눌러 미리 설정된 프로그램을 시작합니다. 모델 K1 터치 머신은 설정에 따라 터치 포스 로딩을 자동으로 수행합니다.

6. 생리학적 데이터 수집 및 분석

1. 볼팅일: 감동적인 실험에서 각 플랜트의 볼트 일을 개별적으로 기록합니다. 볼팅은 식물이 식물 단계에서 생식 단계로 성장 단계를 변경하는 상징이다. 애기장대에서 볼팅 데이는 식물이 첫 번째 꽃줄기를 가지고 사용하는 일수로 정의됩니다 길이가 1cm에 도달합니다.
   참고 : 위에서 설명한 성장 조건하에서 야생 형 식물의 볼트는 일반적으로 종자 파종 후 19 일에서 23 일까지 시작되고 28-32 일에 끝납니다.
2. 로제트 반경: 로제트 중심에서 가장 긴 잎의 끝까지의 거리를 측정합니다.
   1. 상단에서 전체 트레이의 사진을 찍습니다. 대조군과 터치 처리된 그룹의 사진을 따로 찍는다.
   2. 적절한 소프트웨어를 다운로드합니다. 예를 들어 무료로 다운로드한 소프트웨어 ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/download.html)를 사용합니다.
   3. 사진 파일을 열고 확대/축소 기능을 사용하여 사진을 적절한 크기로 확대합니다.
   4. 직선 도구를 선택하여 로제트 중심과 가장 긴 잎의 끝 사이에 직선을 그려 로제트 반경을 측정합니다.
   5. 하나의 식물을 선택하고 왼쪽 버튼을 눌러 로제트 중심에서 가장 긴 잎 끝까지 직선을 그립니다.
   6. 분석-측정 기능을 선택하거나 Ctrl + M을 눌러 선 거리를 분석합니다.
   7. 한 컵을 선택하고 앞의 두 단계를 반복하여 각 플라스틱 컵의 직경을 동시에 분석합니다. 이러한 데이터를 사용하여 계산을 수행하여 사진 촬영으로 인한 바이어스를 제거합니다.
      참고: 방정식은 다음과 같은 것입니다.
      R_a/D_a = R m/D_m
      (Ra, 식물의 실제 로제트 반경; Da, 플라스틱 컵의 실제 직경; Rm, 소프트웨어에 의해 결정된 동일한 식물의 측정된 로제트 반경; Dm, 동일한 식물을 재배하는 데 사용되는 플라스틱 컵의 측정 직경)
3. 로제트 영역: 장미 잎의 수평 2 차원 표면적을 측정합니다.
   1. 로제트 기관의 나머지 부분에 영향을 주지 않고 꽃을 제거하십시오.
   2. 각 식물의 꼭대기에서 근처에 배치 된 스케일 눈금과 함께 사진을 찍습니다.
   3. ImageJ, 로제트 트래커의 하나의 무료 플러그인을 사용하고 이전에 게시 된 프로토콜을 따르십시오²².

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결과

자동 헤어 터치 포스 로딩 기계
식물의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 재현 가능한 성장 조건과 치료 방법은 반복 가능한 결과를 얻는 데 핵심적인 것입니다. 이 고처리량 및 자동 터치 포스 신호 돌연변이 스크리닝은 새로 구축된 헤어 터치포스 로딩 머신인 Model K1(그림 1, 그림2)에 의해 달성된다. 이 헤어 브러쉬는 최대 4 개의 식물 트?...

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토론

Thigmomorphogenesis는 기계적인 섭동을 향해 복잡한 식물 성장 반응입니다, 이는 세포 신호 및 식물 호르몬의 활동의 네트워크를 관련시킵니다. 바람직하지 않은 환경 조건^25,26에서살아남기 위해 식물의 적응 진화의 결과입니다. 기계적 터치, 특히 인간의 손가락 터치 와 핸드 헬드 면봉 터치, 이전의 thigmomorphogenetic 연구^14,

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 hair brushes		customized
4 robot arms with one holder		customized	1000 mm length holder and 560 mm length robot arm
57 stepper motor		57HS22-A
All purpose potting soil	Plantmate, Hong Kong
Arabidopsis plant seeds	Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH		For arabidopsis seed purchase
BIO-MIX potting substratum	Jiffy Products International BV, the Netherlands	1000682050	Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and  BIO-MIX is 1:2
IL 1700 research radiometer	International Light, Newburyport, MA		The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/download.html		Free downloaded software
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited	Shenzhen, China		For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase
Junction plate of the slide block			To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks
Junction plate of the X axis module		customized	To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder
Slide block
WDT4045 X axis guide-rail module		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
WDT4045 Y axis guide-rail module		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
X axis auxiliary girder		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks
Y axis auxiliary girder		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks