Un protocollo dello schermo mutante di segnalazione della forza di manodopera e ripetibile per lo studio della Thigmomorphogenesis di un modello di arabidopsis thaliana

Riepilogo

Una delicata macchina di caricamento touch-force è costruita da spazzole per capelli umani, bracci robotici e un controller. Le spazzole per capelli sono azionate da bracci robotici installati sulla macchina e si muovono periodicamente per applicare la forza tocco sulle piante. La forza dei tocchi di capelli guidati da macchine è paragonabile a quella dei tocchi applicati manualmente.

Abstract

Piante che rispondono a stimolazioni meccaniche intracellulari ed extracellulari (o segnali di forza) e sviluppano speciali cambiamenti morfologici, una chiamata thigmomorfogenesi. Negli ultimi decenni, diversi componenti di segnalazione sono stati identificati e segnalati per essere coinvolti nella meccanotra (ad esempio, proteine che legano gli ioni di calcio ed enzimi di biosintesi dell'acido jasmonico). Tuttavia, il ritmo relativamente lento della ricerca nello studio della segnalazione della forza o della tigmomorfogenesi è in gran parte attribuito a due motivi: il requisito per l'induzione del tocco manipolato a mano umano della thigmomorfogenesi e gli errori di forza della forza associato al tocco delle persone. Per migliorare l'efficienza del carico di forza esterna su un organismo vegetale, è stata costruita una macchina di carico automatico touch-force. Questo pennello robotico a braccio-driven fornisce una simulazione touch-force salvabile e facilmente ripetibile, cicli illimitati di ripetizione tramite tocco e forza di tocco regolabile. Questa macchina per il caricamento a pressione dei capelli può essere utilizzata sia per lo screening su larga scala dei mutanti di segnalazione a forza di tatto sia per lo studio della fenomica della tigmomorfogenesi delle piante. Inoltre, materiali tattili come i capelli umani, possono essere sostituiti con altri materiali naturali come i peli di animali, fili di seta e fibre di cotone. I bracci mobili automatizzati sulla macchina possono essere dotati di ugelli di spolverata d'acqua e soffiatori d'aria per imitare le forze naturali delle gocce di pioggia e del vento, rispettivamente. Utilizzando questa macchina di carico automatica per il tocco di capelli in combinazione con il tappi di cotone eseguito a mano, abbiamo studiato la risposta al tocco di due mutanti di segnalazione di forza, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) e MKK2 impianti . I fenomi delle piante di tipo selvaggio caricate a motore e due mutanti sono stati valutati statisticamente. Hanno mostrato differenze significative nella risposta al tocco.

Introduzione

La thigmomorfogenesi vegetale è un termine che è stato coniato da Jaffe, MJ nel 1973¹. È un tropismo vegetale ma diverso dal noto fototropismo o gravitropismo causato da stimoli di luce solare o gravità^2,3. Descrive alterazioni fenotipiche associate a stimolazioni meccaniche periodiche, che sono state frequentemente osservate dai botanici in tempi precedenti^4,5. Gocce di pioggia, vento, piante, tocchi animali e umani, anche morsi di animali, sono tutti considerati diversi tipi di mechano-stimoli che innescano la segnalazione della forza nelle piante^4,5. Le caratteristiche della thigmomorphogenesis comprendono il ritardo di bullonatura, uno stelo più corto, la dimensione più piccola di rosette/foglia nelle piante erbacee e uno stelo più spesso nelle piante legnose^6,7,8. Questo è diverso dalla risposta tigmonastica o tigmotropica che si trova spesso nella pianta di Mimosa o in altre viti sensibili al meccano, dove queste risposte rapide al tatto sono più facili da osservare^1,9,10. La thigmomorfogenesi, d'altra parte, è relativamente difficile da osservare a causa della sua lenta risposta alla crescita. La thigmomorfogenesi è di solito osservata dopo settimane o addirittura anni di stimolazione continua del caricamento della forza. Questa natura unica della risposta al tocco delle piante rende difficile eseguire uno schermo genetico in avanti utilizzando la stimolazione del tocco della mano umana per isolare i mutanti resistenti alla segnalazione della forza touche in modo robusto.

Per chiarire le vie di trasduzione del segnale di forza e i meccanismi molecolari alla base della tigmomorfogenesi^6,11, esperimenti biologici molecolari e cellulari sono stati eseguiti negli ultimi^{6, 12,13,14}. Questi studi hanno proposto che i recettori del segnale di forza vegetale consistono principalmente di canali ionici meccanosensitive (MSC) e complessi MSC legati composti da complessi multimerici di proteine che si estendono a membrana^{11,14 , 15.}Il picco transitorio citoplasma Ca^{2 o} generato in pochi secondi dal tocco iniziale. Vento, pioggia-, o gravi-stimolazione può interagire con i sensori di calcio a valle per trasdurre i segnali di forza agli eventi nucleari^14,16,17,18. Oltre agli studi molecolari e cellulari, lo schermo genetico in avanti con tocco manuale delle piante ha scoperto che i fitoormoni e i metaboliti secondari sono coinvolti nella conseguente espressione genica tramite terrore (TCH) carico touch-force^13,19. Ad esempio, aos e opr3²⁰ mutanti sono stati identificati finora dagli studi genetici. Tuttavia, il problema principale associato all'applicazione della genetica avanzata nello studio della thigmomorfogenesi è ancora il lavoro intensivo necessario per quantificare il livello di risposta al tatto e toccare una grande popolazione di geneticamente mutati singole piante. Il problema che richiede molto tempo persiste anche nello schermo mutante a contatto a mano^14,20. Per un esempio, per completare un round di stimolazione della forza di tocco, una persona deve toccare 30-60 volte (un tocco al secondo) su una singola pianta. Per avere un numero sufficiente di piante per l'analisi statistica del fenotipo, per il processo di caricamento della forza touch sono normalmente necessari 20-50 singoli impianti dello stesso genotipo. Questo regime di caricamento touch-force significa che una persona ha bisogno di eseguire ripetutamente 600-3.000 tocchi su un genotipo di scelta. Questo tipo di tocco normalmente deve essere ripetuto da 3 a 5 colpi al giorno, che equivale a circa 1.800-15.000 dita o tocchi di cotone tocchi di cotone al giorno per genotipo di piante. Una persona ben addestrata è normalmente necessaria per mantenere la forza e la forza di tocchi multipli all'interno di una gamma desiderabile attraverso molti cicli di ripetizione in un giorno per evitare la grande variazione di forza e forza. Come è ben noto che la tigmomorfogenesi è un processo saturabile e dose-dipendente^6,21, forza tocco / forza diventa fondamentale per un successo nell'attivazione della risposta al tocco di una pianta.

Per rimuovere il caricamento a passo toccato dipendente dalla persona e mantenere l'applicazione meccanica entro un intervallo di errore accettabile^14,abbiamo quindi progettato una macchina di caricamento automatico a forza di tatto per sostituire i tocchi manipolati a mano. La macchina ha 4 bracci in movimento costruiti, ognuno dei quali è dotato di una spazzola per capelli umana. Questa versione è denominata Modello K1 per specificare la sua caratteristica del caricamento tatto-forza dei capelli umani. Se 4 genotipi sono misurati quantitativamente per la loro tigmomorfogenesi o risposta al tatto sotto una macchina, 40-48 individui per genotipo possono essere misurati. Ogni ripetizione del tocco (meno di 60 volte di tocco per pianta) dura meno di 5 minuti utilizzando un braccio robotico regolabile a velocità in movimento. Così, gli impianti su una macchina touch model K1 possono essere stimolati meccanicamente per più round al giorno, con un carico costante di touch-force o diversi livelli di forza inizialmente programmati.

L'Arabidopsis thaliana, un organismo vegetale modello, è stata quindi scelta come specie vegetale bersaglio per testare l'applicazione della macchina di carico a motore touch-force dei capelli completamente automatica. Poiché ci sono diverse grandi sementi disponibili per il recupero dei vari germplasmi di mutanti e delle dimensioni della fioritura, l'Arabidopsis si adatta bene allo spazio disponibile nella mensola di crescita montata con la macchina touch Model K1.

La macchina a sfioramento automatico Model K1 è composta da tre componenti principali: (1) il rack metallico a forma di H composto da due attuatori lineari a nastro, (2) bracci metallici robotici dotati di spazzole per capelli e (3) un controller. Per una macchina touch model K1 personalizzata, ogni modulo dell'asse X/Y è composto da una guida-rail guidata da cintura, due blocchi di scorrimento (rosso) e un motore da 57 stepper (preinstallato e smontabile) (Figura 1A,B). L'attuatore orizzontale superiore permette al braccio metallico robotico di muoversi a sinistra ea destra orizzontalmente, l'attuatore lineare con cintura verticale inferiore consente al braccio metallico robotico di muoversi su e giù verticalmente (Figura 1B, Figura 2A ). Nell'attuatore verticale sono stati installati quattro bracci robotici smontabili (Figura 1C, Figura 2B). Quattro spazzole per capelli umane erano legate a quattro bracci robotici, rispettivamente (Figura 1C, Figura 2B). Tutte le parti meccaniche per costruire la macchina touch Model K1 in grassetto riportato di seguito sono contrassegnate nella Figura 1C (vedere anche la tabella dei materiali).

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Protocollo

1. Preparazione dei semi

NOTA: i semi di Arabidopsis di entrambi i tipi selvatici (Col-0) così come i mutanti mkk1 e mkk2 loss-of-function utilizzati sono stati acquistati presso l'Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, https://www.arabidopsis.org, Columbus, OH).

1. Calcolare quanti individui vegetali di ciascun genotipo saranno utilizzati per un'analisi statistica affidabile. Preparare un numero sufficiente di semi in base al tasso di germinazione di ogni linea, di solito 4-5 volte di più di quanto necessario per un esperimento. Assicurarsi che un numero sufficiente di piante sane e di dimensioni uniformi possa essere utilizzato per il saggio di risposta al tocco. Secondo questo protocollo, 300-500 semi per genotipo sono di solito utilizzati per produrre 80-90 piante di dimensioni simili.
2. Immergere i semi in acqua fredda e conservarli in 4 gradi centigradi (coperti con un foglio di alluminio per tenerli scuri) per l'imbibition dei semi. Semina i semi 5-7 giorni dopo l'imbibition.

2. Crescita delle piante

1. Selezionare il terreno appropriato per la crescita delle piante (vedere la Tabella dei Materiali). Evitare grandi ciuffi e mescolare in modo omogeneo.
2. Preparare 24 bicchieri di plastica: la capacità di tenuta è di 207 mL e il diametro superiore del bordo è di 7,4 cm. Forare tre fori rotondi nella parte inferiore di una tazza per scopi di irrigazione.
3. Riempire queste tazze di plastica con il terreno misto. Lasciare che il terreno si accumuli fino a 1-2 cm più in alto del bordo della tazza e appiattisci la superficie del terreno accatastato dolcemente.
4. Trasferire 24 tazze in un vassoio di plastica (21 pollici x 10,8 pollici x 2,5 pollici) e posizionare il vassoio in condizioni di luce costante (vedi sotto).
5. Aggiungere 2,5 L di acqua in ogni vassoio due ore prima della semina del seme. Lasciare che il terreno assorba l'acqua dai fori situati sul fondo delle tazze e attendere che la superficie del terreno cada al livello del cerchio della tazza.
6. Semina 3-4 semi in un unico punto, e 4 punti distribuiti uniformemente all'interno di una tazza.
7. Posizionare una copertura di plastica trasparente sopra ogni vassoio e lasciare che i semi germinano per una settimana. Quindi rimuovere il coperchio e lasciare che le piantine a crescere per un'altra settimana.
8. Rimuovere le piante extra assottigliando e mantenere 4 individui vegetali di dimensioni simili in ogni tazza 9-10 giorni dopo la semina di semi.
9. Irrigare le piante con 1,5 L di acqua ogni due giorni dopo la germinamento dei semi.

3. Condizione di crescita

1. Impostare la temperatura della camera di crescita a 23,5 x 1,5 gradi centigradi, e l'umidità tra il 35 e il 45%.
2. Impostare l'intensità della luce tra 180 e 240 m^-2ì s^-1 (misurata dal radiometro di ricerca IL 1700, Luce internazionale)¹⁴. La radiazione attiva fotosintetica è da 90 a 120 - M^-2s^-1.
3. Impostare la condizione della luce su una costante di 24 ore.

4. La costruzione della macchina di carico touch-force

NOTA: Questa macchina robotica per il caricamento a motore dei capelli (modello K1) è progettata per servire per scopi sia di screening mutante di segnalazione touch-force che di generazione di piante thigmomorphogenesis (Figura 1, Figura 2).

1. Moduli di preinstallazione (smontabile, Figura 1C)
   1. Installare due blocchi scorrevoli (I) e un motore da 57 stepper (II) sul modulo guida dell'asse X/Y (III/V).
   2. Installare due blocchi scorrevoli (I) sulla trave ausiliaria dell'asse X/Y (IV/VI).
2. Installazione di altre parti meccaniche (Figura 1C)
   1. Fissare insieme il modulo guide-rail dell'asse X (III) e la trave ausiliaria (IV) dell'asse X assemblando due piastre di giunzione (VII) ad ogni estremità della guide-rail.
   2. Fissare il modulo guide-rail dell'asse Y (V) sulla dorsale di due blocchi di scorrimento (asse X) in posizione di incrocio assemblando due piastre di giunzione (VIII) in mezzo.
   3. Fissare la trave ausiliaria dell'asse Y (VI) sulla dorsale degli altri due blocchi di scorrimento (asse X) in posizione di incrocio assemblando due piastre di giunzione (VIII) in mezzo.
   4. Assemblare il supporto di bracci robot (IX) sulla parte anteriore di due blocchi di scorrimento (asse Y) in una posizione di incrocio con una piastra di giunzione (Figura 2A).
   5. Assemblare 4 spazzole per capelli (X) su bracci robot (IX) con morsetti (Figura 2B).

5. Impostazione della macchina di caricamento Touch-Force

NOTA: tutti i parametri di controllo per impostare la macchina touch Model K1 in grassetto riportato di seguito sono visualizzati nel pannello di controllo (Figura 2F).

1. Installare spazzole per capelli touch sui bracci robotici. Utilizzare un righello d'acciaio lungo 330 mm come supporto per fissare uno strato di capelli umani (3.600-4.600 capelli /spazzola) in modo uniforme. La lunghezza dei capelli è 126 mm (Figura 1C).
2. Fissare quei righelli d'acciaio sui bracci robotici con due morsetti metallici.
3. Impostare prima l'altezza dei bracci macchina lungo la quota verticale (asse Y). Premere Jog F, per sollevare e Jog R- per abbassare i bracci e i pennelli robotici. Lasciare che la punta dei capelli spazzola 0,5 cm più in basso del bordo della tazza. Premere il set di zero. Pre-eseguire la macchina 1-2 cicli per assicurarsi che tutti gli individui dell'impianto vengono toccati. Regolare e calibrare le spazzole e le punte dei capelli alla stessa altezza ogni giorno durante l'intero periodo di contatto.
4. Utilizzare una scala elettronica per misurare la forza di tocco (caricamento verticale) e mantenere il livello di forza tocco a 1-2 mN¹⁴.
5. Impostare manualmente la posizione iniziale dei bracci macchina lungo la quota orizzontale (asse X). Lasciare che i pennelli per capelli appesi al bordo di ogni vassoio e assicurarsi che nessuna pianta venga toccata prima dell'inizio dell'esperimento toccante. Premere Jog F/Jog R- per spostare il braccio della macchina orizzontalmente a poco a poco per impostare la posizione di partenza.
6. Impostare la distanza di percorrenza del pennello per capelli nella dimensione orizzontale (asse X) su 365 mm premendo il pulsante Viaggi. Premere R- per spostare i bracci della macchina per ottenere una distanza di viaggio completa e assicurarsi che tutte le piante trattate vengano toccate durante l'intero esperimento di contatto.
7. Impostare la velocità di movimento lungo l'asse X dei bracci macchina a 5.000 mm/min premendo il pulsante Velocità automatica. Mantenere la stessa velocità di movimento durante l'intero esperimento di tocco.
8. Impostare il tempo di tocco in 20 prove premendo il pulsante Ciclo secondario. Mantenere lo stesso numero di tocchi per round durante l'intero esperimento di tocco.
   NOTA: Un Ciclo Minore equivale a due distanze di viaggio, il che significa che i bracci della macchina si sposteranno dalla posizione di partenza alla posizione finale e poi di nuovo alla posizione di partenza. Un ciclo secondario genera due tocchi. Le spazzole per capelli toccano le piante 40 volte in 20 prove (2 tocchi x 20 prove - 40 tocchi). Il 40-touch è definito per essere un giro di carico touch-force.
9. Impostare l'intervallo di ripetizione del round a tocco a 480 min al giorno premendo il pulsante Periodo principale. Mantenere la stessa frequenza di turni di tocco durante un intero esperimento di tocco.
   NOTA: Questo permette alle spazzole per capelli di toccare le piante per 3 giri al giorno, e l'intervallo di tempo tra ogni round è di 480 min (8 h). Il numero blu visualizzato rappresenta l'intervallo di tempo di ogni round di tocco. La macchina avvierà automaticamente un nuovo giro di tocco quando il conto alla rovescia sotto (numero rosso) si trasforma in 0000.
10. Impostare il ciclo principale a 12 prove, il che significa che la macchina toccherà le piante per 12 colpi entro un periodo di 4 giorni automaticamente. Questa impostazione di 12 prove viene utilizzata per evitare errori umani nel saltare un giorno di contatto.
11. Premere il pulsante di avvio per avviare il programma preimpostato. La macchina touch Model K1 eseguirà automaticamente il caricamento della forza tocco in base alle impostazioni.

6. Raccolta e analisi dei dati fisiologici

1. Giorni di bullolaggio: Registrare il giorno di bullolaggio di ogni pianta singolarmente all'interno di un esperimento toccante. Il bullonaggio è un simbolo che una pianta cambia la sua fase di crescita dalla fase vegetativa alla fase riproduttiva. Nell'Arabidopsis, il giorno di bullolazione è definito come il numero di giorni utilizzati da una pianta per avere il suo primo stelo di infiorescenza raggiunge 1 cm di lunghezza.
   NOTA: In base alle condizioni di crescita sopra descritte, l'imbullonatura delle piante di tipo selvatico inizia normalmente da 19 a 23 giorni dopo la semina del seme e termina a 28-32 giorni.
2. Rosette Raggio: Misurare la distanza dal centro della rosetta alla punta della foglia più lunga.
   1. Scattare foto di tutto il vassoio dall'alto. Scattare foto del gruppo di controllo e del gruppo trattato con il tocco separatamente.
   2. Scaricare il software appropriato. Utilizzare il software libero scaricato ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) per esempio.
   3. Aprire un file di foto, utilizzare la funzione di zoom per ingrandire la foto in una dimensione appropriata.
   4. Scegliere lo strumento Retteper disegnare una linea retta tra il centro della rosetta e la punta di una foglia più lunga per misurare il raggio della rosetta.
   5. Selezionare una pianta e premere il pulsante sinistro per disegnare una linea retta dal centro della rosetta alla punta foglia più lunga.
   6. Scegliere la funzione Analyze-Measure o premere Ctrl s M per analizzare la distanza della linea.
   7. Selezionare una tazza e ripetere i due passaggi precedenti per analizzare contemporaneamente il diametro di ogni tazza di plastica. Utilizzare questi dati per eseguire il calcolo per eliminare la distorsione risultante dalla foto-presa.
      NOTA: l'equazione è:
      R_a/D_a : R_m/D_m
      (R_a, l'effettivo Rosette Radius di una pianta; D_a, il diametro effettivo della tazza di plastica; R_m, la Rosette Radius misurata della stessa pianta determinata da un software; D_m, il diametro misurato della tazza di plastica che viene utilizzato per coltivare la stessa pianta)
3. Area Rosette: Misura l'area orizzontale della superficie 2 dimensionale delle foglie di rosetta.
   1. Rimuovere l'infiorescenza senza influenzare il resto degli organi della rosetta.
   2. Scattare foto dalla parte superiore di ogni pianta insieme a un righello in scala posizionato nelle vicinanze.
   3. Utilizzare un plugin gratuito di ImageJ, Rosette Tracker e seguire il protocollo pubblicato in precedenza²².

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Risultati

La macchina automatica di caricamento a contatto con i capelli
Per l'osservazione dei cambiamenti morfologici sulle piante, sia le condizioni di crescita riproducibili che i metodi di trattamento sono fondamentali per ottenere risultati ripetibili. Questo screening mutante ad alta velocità effettiva e automatico di segnalazione a pressione viene ottenuto dalla macchina di caricamento a pressione dei capelli appena costruita, Model K1 (Figura 1, Figur...

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Discussione

La thigmomorfogenesi è una risposta complessa alla crescita delle piante verso le perturbazioni meccaniche, che coinvolge una rete di segnalazione cellulare e l'azione dei fitoormoni. È una conseguenza dell'evoluzione adattativa delle piante per sopravvivere sotto le condizioni ambientali indesiderabili^25,26. Il tocco meccanico, in particolare il tocco delle dita umane e il tocco di tampone di cotone portatile, sono stati selezionati per studiare questi cambiam...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 hair brushes		customized
4 robot arms with one holder		customized	1000 mm length holder and 560 mm length robot arm
57 stepper motor		57HS22-A
All purpose potting soil	Plantmate, Hong Kong
Arabidopsis plant seeds	Arabidopsis Biological Resource Centers, Columbus, OH		For arabidopsis seed purchase
BIO-MIX potting substratum	Jiffy Products International BV, the Netherlands	1000682050	Two soils were mixed together to grow Arabidopsis. The ratio of All purpos potting soil and  BIO-MIX is 1:2
IL 1700 research radiometer	International Light, Newburyport, MA		The light intensity of both full-wavelength and photosynthetic active radiation can be measured.
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/download.html		Free downloaded software
Ju Feng Precision and Automation Technology Limited	Shenzhen, China		For belt-driven linear actuators and other mechanical modules purchase
Junction plate of the slide block			To fix the Y guide-rail module or Y auxiliary girder onto backs of slide blocks
Junction plate of the X axis module		customized	To connect the X guide-rail module and X auxiliary girder
Slide block
WDT4045 X axis guide-rail module		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
WDT4045 Y axis guide-rail module		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks and one 57 stepper motor
X axis auxiliary girder		843 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks
Y axis auxiliary girder		1038 mm, customized	Pre-installed with two slide blocks