Indução de insuficiência ventricular direita por constrição da artéria pulmonar e avaliação da função ventricular direita em camundongos

Resumo

Aqui, nós fornecemos uma aproximação útil para estudar o mecanismo da falha ventricular direita. Uma aproximação mais conveniente e mais eficiente à constrição da artéria pulmonaa é estabelecida usando instrumentos cirúrgicos feitos inhouse. Além disso, são fornecidos métodos para avaliar a qualidade dessa abordagem por ecocardiografia e cateterismo.

Resumo

O mecanismo de insuficiência ventricular direita (RVF) requer esclarecimento devido à singularidade, alta morbidade, alta mortalidade e natureza refratária da RVF. Os modelos precedentes do rato que imitando a progressão de RVF foram descritos. Comparado com ratos, os ratos são mais acessíveis, econômicos e amplamente utilizados em experimentos com animais. Nós desenvolvemos uma aproximação da constrição da artéria pulmonaa (PAC) que seja compreendida de bandagem o tronco pulmonar nos ratos para induzir a hipertrofia ventricular direita (RV). Uma agulha cirúrgica especial da trava foi projetada que permita a separação mais fácil da aorta e do tronco pulmonar. Em nossos experimentos, o uso desta agulha de trava fabricada reduziu o risco de arteriorrhexis e melhorou a taxa de sucesso cirúrgico para 90%. Utilizamos diferentes diâmetros de agulhas de preenchimento para criar precisamente constrição quantitativa, o que pode induzir diferentes graus de hipertrofia do VD. Quantificamos o grau de constrição avaliando-se a velocidade do fluxo sanguíneo do PA, medida pela ecocardiografia transtorácica não invasiva. A função do RV foi avaliada precisamente pelo cateterismo direito do coração em 8 semanas após a cirurgia. Os instrumentos cirúrgicos feitos no inhouse foram compor de materiais comuns usando um processo simples que seja fácil de dominar. Portanto, a abordagem PAC descrita aqui é fácil de imitar usando instrumentos feitos no laboratório e pode ser amplamente utilizado em outros laboratórios. Este estudo apresenta uma abordagem PAC modificada que tem uma taxa de sucesso maior do que outros modelos e uma taxa de sobrevida pós-cirúrgica de 8 semanas de 97,8%. Esta aproximação do PAC fornece uma técnica útil para estudar o mecanismo de RVF e permitirá uma compreensão aumentada de RVF.

Introdução

A deficiência orgânica do RV (RVD), definida aqui como a evidência de uma estrutura ou de uma função anormal do RV, é associada com os resultados clínicos pobres. RVF, como o estágio da extremidade da função do RV, é uma síndrome clínica com sinais e sintomas da falha de coração que resultam do RVD progressivo¹. Com diferenças na estrutura e função fisiológica, a insuficiência ventricular esquerda (ve) e a RVF apresentam diferentes mecanismos fisiopatológicos. Alguns mecanismos patofisiológicos independentes em RVF foram relatados, incluindo o superexpressão da sinalização²do receptor β2-adrenergic, da inflamação³, da remodelação do Túbulo transversal, e da disfunção 4 do tratamento de CA^{2 +} .

RVF pode ser causado pelo volume ou pela sobrecarga da pressão do RV. Modelos animais anteriores utilizaram SU5416 (um inibidor potente e seletivo do receptor do fator de crescimento endotelial vascular) combinado com hipóxia (suhx)^5,6 ou monocrotalina⁷ para induzir hipertensão pulmonar, que resultados em RVF secundária à doença vascular pulmonaa². Os pesquisadores que realizam estes estudos centraram-se na vasculatura em vez da progressão patológica da RVF. Além disso, a monocrotalina tem efeitos extra-cardíacos que não podem representar precisamente a doença cardiogênica. Outros modelos utilizaram shunts arteriovenosos para induzir sobrecarga de volume e RVF⁸. No entanto, esta cirurgia é difícil de executar e inadequada para camundongos, que necessitam de longos períodos de indução para a produção de RVF.

Modelos de Rat PAC usando clipes^debandas também existem^9,10. Comparado com ratos, os camundongos têm muitas vantagens como modelos animais de doenças cardíacas, como reprodução mais fácil, uso mais generalizado, custos reduzidos e acesso à modificação do gene¹¹. No entanto, os diâmetros dos clipes de bandas geralmente variam de 0,5 mm a 1,0 mm, que são muito grandes para os camundongos⁹. Além disso, o clipe de bandagem é difícil de produzir, imitar e popularizar em outros laboratórios.

Nós fornecemos um protocolo para desenvolver um modelo reprodutivo modificado do rato de RVF baseado em estudos relatados, que usa o PAC para imitar o tetralogia da síndrome de Fallot e de Noonan ou de outras doenças hipertensivas arteriais pulmonaas^{12,13, 14,15,16,17,18,19}. Esta aproximação do PAC é criada ligando o tronco pulmonar dos ratos usando uma trava e a agulha do estofamento fêz o inhouse para controlar o grau de constrição. A agulha da trava é feita de uma seringa curvada 90 ° da injeção com uma sutura de seda trançada passada através da seringa. A agulha é feita a partir de materiais comuns usando um processo que é fácil de dominar. A agulha do estofamento é curvada 120 ° da agulha do calibre. As agulhas do estofamento com diâmetros diferentes (0.6-0.8 milímetros) são usadas, dependendo do peso dos ratos (20-35 g). Adicionalmente, estabelecemos um critério de avaliação para determinar a estabilidade e a qualidade do modelo de RVF por ecocardiografia e cateterismo cardíaco direito. Nós usamos camundongos como o animal modelo por causa de seu uso generalizado em outros experimentos. As agulhas feitas no laboratório são fáceis de reproduzir e podem ser amplamente utilizadas em outros laboratórios. Este estudo fornece uma boa aproximação para que os investigadores investiguem o mecanismo de RVF.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de pesquisa animal, que estão em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório publicados pelos institutos nacionais de saúde dos EUA (NIH publication n º 85-23, revisado em 1996). C57BL/6 camundongos machos (8-10 semanas de idade, pesando 20-25 g) foram fornecidos pelo centro animal da universidade médica do Sul. Após a chegada, os camundongos foram alojados um ciclo de 12/12 h escuro/luz, com comida e água suficientes.

1. preparação dos instrumentos cirúrgicos e fabricação das agulhas

1. Prepare os instrumentos cirúrgicos estéreis (Figura 1a), uma sutura de seda trançada 6-0 (Figura 1b[a]) para a ligadura, e uma sutura de nylon 5-0 para o fechamento da incisão (Figura 1b[b]).
2. Passe a sutura de seda trançada 6-0 (Figura 1b[a]) através de uma agulha de 25 G desmontada de uma seringa de injeção de 1 ml. Em seguida, Curve a agulha 90 ° com pinça hemostática para fazer uma agulha de trava (Figura 1C[a]). Curve a agulha de 22 G 120 ° (Figura 1C (b)) para fazer uma agulha de enchimento.

2. preparação para a cirurgia

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Regule a almofada de aquecimento para 37 ° c. Anestesie os camundongos por injeção intraperitoneal com uma mistura de xilazina (5 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg) para alívio da dor. Coloc os ratos em caixas individuais para esperar o início narcótico.
   Nota: recomenda-se também a utilização de 1,5% de isoflurano para anestesia inalante.
2. Monitore a adequação da anestesia pelo desaparecimento do reflexo de retirada do pedal. Mantenha os camundongos na posição supina na almofada de aquecimento, fixando os incisivos com uma sutura e fixando as pernas com fita adesiva. Verifique novamente o reflexo para garantir a profundidade da anestesia.
3. Aplique a pasta depilatória na pele do pescoço ao processo xifóide. Desinfecte a área com iodo seguido de 75% de álcool.
4. Realizar intubação endotraqueal.
   1. Ajuste os parâmetros do miniventilador animal (Figura 1D) e defina a frequência respiratória para 150/min e o volume corrente para 300 μl.
   2. Retire a língua ligeiramente usando alicates pontiagudos, elevar a mandíbula com um laboratório feito espátula Figura 1C[c]) para expor a glote, e suavemente inserir um laboratório feito cânula traquéia (Figura 1C[d]) através da glote, enquanto uma fonte de luz fria é dirigida sobre a laringe.
   3. Conecte o tubo e o ventilador para verificar se a cânula foi inserida na traquéia. Fixe a traqueia com fita adesiva se a cânula tiver sido inserida correctamente.

3. cirurgia

1. Abra o baú.
   1. Faça uma incisão na pele paralela à segunda costela, cerca de 10 mm de comprimento, com tesouras oftálmicas. Certifique-se de que a incisão começa a partir do ângulo esternal e termina na linha axilar anterior esquerda. Identifique o segundo espaço intercostal contando as costelas do ângulo esternal.
   2. Separe e corte os músculos peitorais maiores e peitorais menores com tesouras e pinças de cotovelo acima do segundo espaço intercostal para expor este espaço.
      Nota: também é recomendado para separar sem rodeios, mobilizar, e mover os músculos peitorais para a direita e cranialmente.
   3. Penetre sem rodeios o segundo espaço intercostal com pinças de cotovelo e abra este espaço. Em seguida, separe sem rodeios o parênquima e o Timo até que o tronco pulmonar seja visível.
2. Constrict a artéria pulmonar.
   1. Separe sem rodeios o tronco pulmonar e a aorta ascendente com pinças de cotovelo. Passar a sutura através do tecido conjuntivo entre o tronco pulmonar e a aorta ascendente com uma agulha de trava.
   2. Coloque a agulha de preenchimento (ver passo 1,2) no tronco pulmonar e, em seguida, ligadura o tronco pulmonar juntamente com a agulha de preenchimento, utilizando a sutura de seda trançado 6-0. Retire a agulha de enchimento imediatamente após o enchimento do cone pulmonar é observado e cortar as extremidades da sutura.
   3. Observar o preenchimento do cone pulmonar para avaliar se existe uma constrição presente. Avalie novamente o reflexo do animal para garantir o sucesso da ligadura.
      Nota: realize uma cirurgia simulando, seguindo todas as etapas acima, exceto para a constrição.
3. Feche o peito e a pele com a sutura de nylon 5-0. Desinfete a pele novamente com 75% de álcool.
4. Injete 0,5 mL de soro fisiológico por via subcutânea para substituir qualquer fluido perdido durante a cirurgia. Coloque o mouse na gaiola separadamente com almofada de aquecimento para promover a recuperação. Retorne os ratos a suas gaiolas em uma sala de ciclo clara/escura de 12/12 h quando a consciência retorna. Trate os ratos com buprenorfina através de sua água potável para os seguintes 3 dias.
5. Preste especial atenção à cicatrização da ferida toracotomia monitorando os camundongos 2x por dia durante a primeira semana para detectar quaisquer sinais de cura insuficiente, mobilidade prejudicada ou perda de peso.

4. Avaliação ecocardiográfica da função do VD após a cirurgia

Nota: alterações ecocardiográficas podem ser detectadas 3 dias após a cirurgia.

1. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 3% por inalação e manter a profundidade de anestesia com 1,5% de isoflurano. Fixar um mouse sobre a plataforma, tape suas garras para o eletrodo, e manter o animal em uma posição supina. Mantenha a frequência cardíaca do rato entre 450-550 batimentos/min ajustando a concentração de isoflurano entre 1,5% e 2,5%.
2. Retire o cabelo no peito do rato com creme depilatório e aplique o gel do ultra-som à pele do peito.
3. Avalie a constrição do tronco pulmonar com uma sonda de 30 MHz.
   1. Manter a sonda a 30 ° no sentido anti-horário em relação à linha paraesternal esquerda, enquanto orientando o entalhe na direção caudal. Regule o eixo ye o eixo xo modo B até que a valva mitral, a AORTA e a câmara LV sejam claramente visíveis.
   2. Gire a sonda 30 °-40 ° em seu eixo yem direção ao tórax. Regule o eixo ye o eixo xaté que o cone pulmonar seja claramente visível.
   3. Posicione o cursor na ponta dos folhetos da válvula pulmonar para medir a velocidade de pico de fluxo. Use o modo Color Doppler pressionando Color, seguido por PW, e depois movendo o cursor para colocar a linha PW-tracejada paralela à direção do fluxo sanguíneo.
   4. Medir a velocidade de pico da artéria pulmonar. Salve os dados e a imagem com o Cine Store e o frame Store.
4. Avalie os parâmetros do RV com uma sonda de 30 MHz.
   1. Ajuste o lado esquerdo da almofada de modo que seja mais baixo do que o lado direito. Mantenha a sonda orientada a 30 ° para o horizonte ao longo da linha axilar anterior direita com o entalhe apontado na direção caudal. Regule o eixo ye o eixo xaté que o RV seja mostrado claramente.
   2. Pressione M-mode 2x para mostrar a linha do indicador. Meça a dimensão da câmara do RV, encurtamento fracionário, e espessura da parede do RV. Salve os dados e a imagem com o Cine Store e o frame Store.
5. Pare a inalação do isoflurano para permitir que os ratos recuperem a consciência e retorne então os animais a suas gaiolas em uma sala de ciclo claro/escura de 12 h.

5. cateterismo cardíaco direito para avaliação da função RV

Nota: o cateterismo cardíaco direito foi realizado 8 semanas após a cirurgia para avaliar a função do VD, utilizando um cateter 1,0 F e um sistema de monitorização.

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos. Anestesie o animal através de injeção intraperitoneal com uma mistura de xilazina (5 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg).
2. Após o reflexo de retirada do pedal desaparece, fixar o mouse sobre a plataforma, tape suas garras para o eletrodo, e manter o mouse em posição supina. Retire o cabelo na área cirúrgica com creme depilatório.
3. Desinfecte a pele da área cirúrgica com 75% de álcool. Usando alicates pontiagudos, puxe a língua para fora ligeiramente, elevar a mandíbula com uma espátula feita inhouse para expor a glote, e suavemente inserir a cânula da traquéia feita inhouse através da glote, enquanto uma fonte de luz fria é dirigida sobre a laringe. Utilize um ventilador (Figura 1e) para auxiliar na ventilação.
4. Abra a cavidade torácica por meio de uma incisão bilateral de 1,5 cm abaixo do processo xiphoide através do diafragma com tesoura oftálmicas e fórceps. Corte através do diafragma e costelas com tesoura oftálmicas para expor o coração. Penetrar a parede livre do RV com uma agulha de 23 G e remover a agulha; pressione suavemente o ponto de punção com um cotonete de algodão para parar qualquer sangramento. Perfure o ventrículo com a ponta do cateter através da ferida.
   Nota: recomenda-se também realizar Cateterismo cardíaco direito através da veia jugular direita⁶. Quando a ponta do cateter estiver no ventrículo, o monitor exibirá a curva de pressão do VD.
5. Registre a pressão arterial sistólica do VD, a pressão diastólica final do VD, o VD dP/DT, a frequência cardíaca do mouse e a constante de tempo exponencial do RV de relaxamento (Tau) por 10 min quando a curva estiver estável. Usando o software, clique em selecionar e, em seguida, clique em analisar.
6. Regule a ponta do cateter em direção ao trato de saída do VD. Retire o cateter depois de concluída a gravação. Coloque o cateter em soro fisiológico quando as medições estiverem terminadas.
7. Eutanizar os camundongos por injeções intraperitoneal de sódio pentobarbital 150 mg/kg, seguido por luxação cervical. Em seguida, colher o coração, pulmões e tíbia para análises biológicas histomorfológicas e moleculares.

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Resultados

Neste estudo, os camundongos foram aleatoriamente atribuídos ao grupo PAC (n = 9) ou ao grupo de operação Sham (n = 10). A ecocardiografia foi executada em 1, 4, e 8 semanas após a cirurgia. Oito semanas após a cirurgia, após as últimas avaliações de ecocardiografia e cateterismo, os camundongos foram eutanasiados, e seus corações foram colhidos para avaliação morfológica e histológica.

A constri...

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Discussão

Os aumentos patológicos nas pressões de enchimento do RV resultam em um deslocamento leftward do septo, que possa alterar a geometria²¹do LV. Essas alterações contribuem para a redução do débito cardíaco e da fração de ejeção do ve (FEVE), o que pode causar um distúrbio hemodinâmico do sistema circulatório²². Conseqüentemente, um modelo eficiente, estável, e econômico para estudar o mecanismo de RVF é valioso.

Nós desenvolvemo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALC-V8S ventilator	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-V8S	Assist ventilation
Animal Mini Ventilator	Haverd	Type 845	Assist ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical braided silk suture (6-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	6-0	Ligation
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Suture
Millar Catheter (1.0 F)	AD instruments	1.0F	For right heart catheterization
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab multi-Directional physiological Recording System	AD instruments	4/35	Record the result of right heart catheterization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made latch needle			Separate the aorta and pulmonary trunk
Self-made padding needle			Constriction
Self-made tracheal intubation			Tracheal intubation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments
Vertical small animal surgery microscope	Yihua Optical Instrument	Y-HX-4A	For right heart catheterization