Induzione del fallimento ventricolare destro da parte della costrizione dell'arteria polmonare e valutazione della funzione ventricolare destra nei topi

Riepilogo

Qui, forniamo un approccio utile per studiare il meccanismo del fallimento ventricolare destro. Un approccio più conveniente ed efficiente alla costrizione dell'arteria polmonare viene stabilito utilizzando strumenti chirurgici realizzati internamente. Inoltre, vengono forniti metodi per valutare la qualità di questo approccio mediante ecocardiografia e cateterizzazione.

Abstract

Il meccanismo di guasto ventricolare destro (RVF) richiede chiarimenti a causa dell'unicità, alta morbilità, alta mortalità, e natura refrattaria di RVF. Sono stati descritti i precedenti modelli di ratti che imitano la progressione di RVF. Rispetto ai ratti, i topi sono più accessibili, economici e ampiamente utilizzati negli esperimenti sugli animali. Abbiamo sviluppato un approccio di costrizione dell'arteria polmonare (PAC) che consiste nel fasciare il tronco polmonare nei topi per indurre l'ipertrofia ventricolare destra (RV). È stato progettato uno speciale ago di fissaggio chirurgico che consente una più facile separazione dell'aorta e del tronco polmonare. Nei nostri esperimenti, l'uso di questo ago di fissaggio fabbricato ha ridotto il rischio di arteriorrhexis e migliorato il tasso di successo chirurgico al 90%. Abbiamo usato diversi diametri dell'ago per creare con precisione costrizione quantitativa, che può indurre diversi gradi di ipertrofia RV. Abbiamo quantificato il grado di costrizione valutando la velocità del flusso sanguigno della PA, misurata dall'ecocardiografia transtoracica non invasiva. La funzione RV è stata valutata con precisione dalla cateterizzazione del cuore destro 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Gli strumenti chirurgici realizzati internamente erano composti da materiali comuni utilizzando un semplice processo che è facile da padroneggiare. Pertanto, l'approccio PAC descritto qui è facile da imitare utilizzando strumenti realizzati in laboratorio e può essere ampiamente utilizzato in altri laboratori. Questo studio presenta un approccio PAC modificato che ha un tasso di successo più alto rispetto ad altri modelli e un tasso di sopravvivenza post-chirurgia di 8 settimane del 97,8%. Questo approccio PAC fornisce una tecnica utile per studiare il meccanismo di RVF e consentirà una maggiore comprensione di RVF.

Introduzione

La disfunzione RV (RVD), qui definita come prova di una struttura o funzione anomala di RV, è associata a scarsi esiti clinici. RVF, come fase finale della funzione RV, è una sindrome clinica con segni e sintomi di insufficienza cardiaca che derivano da RVD progressiva¹. Con le differenze di struttura e funzione fisiologica, il fallimento ventricolare sinistro (LV) e RVF hanno meccanismi patofisiologici diversi. Sono stati riportati alcuni meccanismi patofisiologici indipendenti in RVF, tra cui la sovraespressione della segnalazione del recettore adrenergico², l'infiammazione³, il rimodellamento del tubulo trasversale e la disfunzione di gestione Di Ca² .

RVF può essere causato da un sovraccarico di volume o pressione dell'RV. Precedenti modelli animali hanno utilizzato SU5416 (un potente e selettivo inibitore del recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare) combinato con ipossia (SuHx)^5,6 o monocrolinea⁷ per indurre ipertensione polmonare, che risultati in RVF secondario alla malattia vascolare polmonare². I ricercatori che conducono questi studi si sono concentrati sulla vascolatura invece che sulla progressione patologica di RVF. Inoltre, la monocrolina ha effetti extra-cardiaci che non possono rappresentare con precisione la malattia cardiogenica. Altri modelli hanno usato shunt arteriovenosi per indurre il sovraccarico di volume e RVF⁸. Tuttavia, questo intervento chirurgico è difficile da eseguire e inappropriato per i topi, che richiedono lunghi periodi di induzione per la produzione di RVF.

Esistono anche modelli di rat PAC che utilizzano clip di bande^9,10. Rispetto ai ratti, i topi hanno molti vantaggi come modelli animali di malattie cardiache, come una riproduzione più facile, un uso più diffuso, costi ridotti e l'accesso alla modificazione genica¹¹. Tuttavia, i diametri delle clip di fasciatura di solito variano da 0,5 mm a 1,0 mm, che sono troppo grandi per i topi⁹. Inoltre, la clip di bande è difficile da produrre, imitare e diffondere in altri laboratori.

Forniamo un protocollo per sviluppare un modello murino RVF riproduttivo modificato basato su studi riportati, che utilizza PAC per imitare la tetralogia della sindrome di Fallot e Noonan o altre malattie ipertensive arteriose polmonari^{12,13, 14,15,16,17,18,19}. Questo approccio PAC viene creato legando il tronco polmonare dei topi utilizzando un fermo e un ago di imbottitura realizzati internamente per controllare il grado di costrizione. L'ago di fissaggio è costituito da una siringa a iniezione curva di 90 gradi con una sutura di seta intrecciata passata attraverso la siringa. L'ago è fatto da materiali comuni utilizzando un processo che è facile da padroneggiare. L'ago dell'imbottitura è curvo a 120 gradi dall'ago del calibro. Vengono utilizzati aghi di imbottitura con diametri diversi (0,6-0,8 mm), a seconda del peso dei topi (20-35 g). Inoltre, stabiliamo un criterio di valutazione per determinare la stabilità e la qualità del modello RVF mediante ecocardiografia e cateterizzazione del cuore destro. Usiamo i topi come animale modello a causa del loro uso diffuso in altri esperimenti. Gli aghi realizzati in laboratorio sono facili da riprodurre e possono essere ampiamente utilizzati in altri laboratori. Questo studio fornisce un buon approccio per i ricercatori per studiare il meccanismo di RVF.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per la ricerca sugli animali, che sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dai National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione n. 85-23, rivista nel 1996). C57BL/6 topi maschi (8-10 settimane, del peso di 20-25 g) sono stati forniti dall'Animal Center della South Medical University. Dopo l'arrivo, i topi sono stati alloggiati sotto un ciclo buio/chiaro 12/12 h, con cibo e acqua sufficienti.

1. Preparazione degli strumenti chirurgici e fabbricazione degli aghi

1. Preparare gli strumenti chirurgici sterili (Figura 1A), una sutura di seta intrecciata 6-0 (Figura 1B[a]) per la legatura e una sutura in nylon 5-0 per la chiusura dell'incisione (Figura 1B[b]).
2. Passare la sutura di seta intrecciata 6-0 (Figura1B[a]) attraverso un ago da 25 G smontato da una siringa di iniezione da 1 mL. Quindi, curvare l'ago di 90 gradi con pinze emostatiche per fare un ago di fermo (Figura 1C[a]). Curvare l'ago da 22 G 120 gradi (Figura1C (b)) per fare un ago di imbottitura.

2. Preparazione per interventi chirurgici

1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico. Regolare la piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi. Anestesizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale con una miscela di xilazina (5 mg/kg) e chetamina (100 mg/kg) per alleviare il dolore. Collocare i topi in singole scatole per attendere l'insorgenza di stupefacenti.
   NOTA: Si raccomanda inoltre di utilizzare l'1,5% dell'isoflurane per l'anestesia inalante.
2. Monitorare l'adeguatezza dell'anestesia con la scomparsa del riflesso di ritiro del pedale. Mantenere i topi in posizione supina sul pad di riscaldamento fissando gli incisivi con una sutura e fissando le gambe con del nastro adesivo. Controllare nuovamente il riflesso per garantire la profondità dell'anestesia.
3. Applicare la pasta depilatoria sulla pelle dal collo al processo xifoideo. Disinfettare l'area con iodio seguito da 75% alcol.
4. Eseguire l'intubazione endotracheale.
   1. Regolare i parametri del miniventilatore animale (Figura1D)e impostare la frequenza respiratoria su 150/min e il volume delle maree a 300 .
   2. Estrarre leggermente la lingua utilizzando pinze appuntite, elevare la mandibole con una spatola fatta in laboratorio Figura 1C[c]) per esporre la glottide, e delicatamente inserire un laboratorio fatto trachea cannula (Figura 1C[d]) attraverso la glottide, mentre una fonte di luce fredda è diretto sulla lassollang.
   3. Collegare il tubo e il ventilatore per verificare se la cannula è stata inserita nella trachea. Fissare la trachea utilizzando nastro adesivo se la cannula è stata inserita correttamente.

3. Chirurgia

1. Apri il torace.
   1. Fare un'incisione nella pelle parallela alla seconda costola, lunga circa 10 mm, con forbici oftalmiche. Assicurarsi che l'incisione inizi dall'angolo di poppa e termina sulla linea ascellare anteriore sinistra. Identificare il secondo spazio intercostale contando le nervature dall'angolo sternale.
   2. Separare e tagliare i muscoli minori pettorali maggiori e pettorali con forbici e pinzette di gomito sopra il secondo spazio intercostale per esporre questo spazio.
      NOTA: Si raccomanda anche di separare senza mezzi termini, mobilitare e spostare i muscoli pettorali a destra e cranicamente.
   3. Penetrare smussatamente il secondo spazio intercostale con pinzette a gomito e aprire questo spazio. Quindi, separare senza mezzi termini il parenchyma e il timo fino a quando il tronco polmonare è visibile.
2. Costringi l'arteria polmonare.
   1. Separare senza mezzi termini il tronco polmonare e l'aorta ascendente con pinzette a gomito. Passare la sutura attraverso il tessuto connettivo tra il tronco polmonare e l'aorta ascendente con un ago di fissaggio.
   2. Posizionare l'ago di imbottitura (vedi passo 1.2) sul tronco polmonare e, quindi, sigaro il tronco polmonare insieme all'ago di imbottitura, utilizzando la sutura di seta intrecciata 6-0. Rimuovere l'ago dell'imbottitura immediatamente dopo aver osservato il riempimento del cono polmonare e tagliare le estremità della sutura.
   3. Osservare il riempimento del conus polmonare per valutare se c'è una costrizione presente. Valutare nuovamente il riflesso dell'animale per garantire il successo della legatura.
      NOTA: Eseguire un intervento chirurgico fittizio seguendo tutti i passaggi di cui sopra ad eccezione della costrizione.
3. Chiudere il petto e la pelle con la sutura di nylon 5-0. Disinfettare nuovamente la pelle con il 75% di alcol.
4. Iniettare 0,5 mL di sottocutanea salina per sostituire qualsiasi liquido perso durante l'intervento chirurgico. Posizionare il mouse nella gabbia separatamente con la piastra di riscaldamento per favorire il recupero. Riportare i topi nelle loro gabbie in una sala ciclo di luce/buio 12/12 h quando la coscienza ritorna. Trattare i topi con buprenorphine attraverso la loro acqua potabile per i seguenti 3 giorni.
5. Prestare particolare attenzione alla guarigione della ferita toracotomia monitorando i topi 2 volte al giorno durante la prima settimana per rilevare eventuali segni di guarigione insufficiente, mobilità alterata, o perdita di peso.

4. Valutazione ecocardiografica della funzione RV dopo l'intervento chirurgico

NOTA: I cambiamenti cardiografici possono essere rilevati 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.

1. Anestesizzare i topi con 3% isoflurane attraverso l'inalazione e mantenere la profondità di anestesia con 1.5% isoflurane. Fissare un mouse sulla piattaforma, nastro i suoi artigli per l'elettrodo, e mantenere l'animale in una posizione supina. Mantenere la frequenza cardiaca del mouse tra 450-550 battiti/min regolando la concentrazione di isoflurane tra l'1,5% e il 2,5%.
2. Rimuovere i capelli sul petto del mouse con crema depilatoria e applicare gel ad ultrasuoni sulla pelle del torace.
3. Valutare la costrizione del tronco polmonare con una sonda a 30 MHz.
   1. Mantenere la sonda a 30 gradi in senso antiorario rispetto alla linea parasterna sinistra, mentre si orienta la tacca nella direzione caudale. Regolare l'asse ye l'asse xsotto la modalità B fino a quando la valvola mitrale, l'aorta e la camera LV non sono chiaramente visibili.
   2. Ruotare la sonda di 30 gradi e 40 gradi sul suo asse yverso il torace. Regolare l'asse ye l'asse xfino a quando il conus polmonare è chiaramente visibile.
   3. Posizionare il cursore sulla punta dei volantini della valvola polmonare per misurare la velocità del flusso di picco. Utilizzare la modalità Doppler colore premendo Colore, seguito da PW, quindi spostando il cursore per posizionare la linea tratteggiata PW parallela alla direzione del flusso sanguigno.
   4. Misurare la velocità del picco dell'arteria polmonare. Salvare i dati e l'immagine con Cine Store e Frame Store.
4. Valutare i parametri RV con una sonda a 30 MHz.
   1. Regolare il lato sinistro del pad in modo che sia inferiore al lato destro. Mantenere la sonda orientata a 30 gradi verso l'orizzonte lungo la linea ascellare anteriore destra con la tacca puntata nella direzione caudale. Regolare l'asse ye l'asse xfino a visualizzare chiaramente il rV.
   2. Premere M-Mode 2x per visualizzare la linea dell'indicatore. Misurare la dimensione della camera RV, l'accorciamento frazionario e lo spessore della parete RV. Salvare i dati e l'immagine con Cine Store e Frame Store.
5. Fermare l'inalazione dell'isoflurane per consentire ai topi di recuperare coscienza e poi riportare gli animali alle loro gabbie in una sala ciclabile 12 h luce / buia.

5. Cateterizzazione del cuore destro per valutare la funzione RV

NOTA: La cateterizzazione del cuore destro è stata eseguita 8 settimane dopo l'intervento chirurgico per valutare la funzione RV, utilizzando un catetere 1.0 F e un sistema di monitoraggio.

1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici. Anestesizzare l'animale tramite iniezione intraperitoneale con una miscela di xilanina (5 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg).
2. Dopo che il riflesso di ritiro del pedale scompare, fissare il mouse sulla piattaforma, nastro i suoi artigli per l'elettrodo, e mantenere il mouse in posizione supina. Rimuovere i capelli nell'area chirurgica con crema depilatoria.
3. Disinfettare la pelle dell'area chirurgica con il 75% di alcol. Utilizzando pinze appuntite,tirare la lingua fuori leggermente, elevare la mandibole con una spatola fatta incasa per esporre la glottide, e inserire dolcemente la cannula trachea fatta ininternamente attraverso la glottide mentre una fonte di luce fredda è diretta sulla lassa. Utilizzare un ventilatore (Figura 1E) per aiutare con la ventilazione.
4. Aprire la cavità toracica per mezzo di un'incisione bilaterale di 1,5 cm sotto il processo xifoideo attraverso il diaframma con forbici oftalmiche e pinze. Tagliare il diaframma e le costole con forbici oftalmiche per esporre il cuore. Penetrare la parete libera CamV con un ago da 23 G e rimuovere l'ago; premere delicatamente il punto di puntura con un tampone di cotone per fermare qualsiasi sanguinamento. Forare il ventricolo con la punta del catetere attraverso la ferita.
   NOTA: Si raccomanda anche di eseguire cateterizzazione del cuore destro tramite la vena giugulare destra⁶. Quando la punta del catetere è nel ventricolo, il monitor visualizzerà la curva di pressione RV.
5. Registrare la pressione sanguigna sistolica RV, la pressione diastolica Diastolica RV, il RV dP/dt, la frequenza cardiaca del mouse e la costante temporale rV di rilassamento (Tau) per 10 min quando la curva è stabile. Utilizzando il software, fare clic su Seleziona e quindi su Analizza.
6. Regolare la punta del catetere verso il tratto di deflusso del camper. Estrarre il catetere al termine della registrazione. Posizionare il catetere in salina quando le misurazioni sono finite.
7. Eutanasia i topi mediante iniezioni intraperitali di sodio pentobarbitale 150 mg/kg, seguite da lussazione cervicale. Quindi, raccogliere il cuore, i polmoni e la tibia per le analisi biologiche istomorfologiche e molecolari.

Risultati

In questo studio, i topi sono stati assegnati in modo casuale al gruppo PAC (n - 9) o al gruppo di operazioni fittizie (n - 10). L'ecocardiografia fu eseguita a 1, 4 e 8 settimane dopo l'intervento. Otto settimane dopo l'intervento chirurgico, dopo le ultime valutazioni dell'ecocardiografia e della cateterizzazione, i topi sono stati eutanasia e i loro cuori sono stati raccolti per una valutazione morfologica e istologica.

Discussione

Gli aumenti patologici delle pressioni di riempimento RV provocano uno spostamento verso sinistra del setto, che può alterare la geometria LV²¹. Questi cambiamenti contribuiscono alla riduzione dell'uscita cardiaca e alla frazione di espulsione Di LV (LVEF), che può causare un disturbo emodinamico del sistema circolatorio²². Pertanto, un modello efficiente, stabile ed economico per studiare il meccanismo di RVF è prezioso.

Abbiamo sviluppato u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALC-V8S ventilator	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-V8S	Assist ventilation
Animal Mini Ventilator	Haverd	Type 845	Assist ventilation
Animal ultrasound system VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	Echocardiography
Cold light illuminator	Olympus	ILD-2	Light
Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  CO	ALC-HTP-S1	Heating
Isoflurane	RWD life science	R510-22	Inhalant anaesthesia
Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer	Midmark Corporation	VIP 3000	Anesthetization
Medical braided silk suture (6-0)	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.	6-0	Ligation
Medical nylon suture (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Suture
Millar Catheter (1.0 F)	AD instruments	1.0F	For right heart catheterization
Pentobarbital sodium salt	Merck	25MG	Anesthetization
PowerLab multi-Directional physiological Recording System	AD instruments	4/35	Record the result of right heart catheterization
Precision electronic balance	Denver Instrument	TB-114	Weighing sensor
Self-made latch needle			Separate the aorta and pulmonary trunk
Self-made padding needle			Constriction
Self-made tracheal intubation			Tracheal intubation
Small animal microsurgery equipment	Napox	MA-65	Surgical instruments
Transmission Gel	Guang Gong pai	250ML	Echocardiography
Veet hair removal cream	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Type 2	Remove hair of mice
Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Auto clean the surgical instruments
Vertical small animal surgery microscope	Yihua Optical Instrument	Y-HX-4A	For right heart catheterization