Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Resumo

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Resumo

As células tumorais circulantes (CTCs) derivadas do tumor primário são derramadas na corrente sanguínea ou no sistema linfático. Estas pilhas raras (1 − 10 pilhas por o mL do sangue) justificam um prognóstico pobre e são correlacionadas com a sobrevivência total mais curta em diversos cancros (por exemplo, peito, próstata e colorectal). Atualmente, o sistema de captura de CTC com base em talão magnético anti-EpCAM é o teste padrão ouro aprovado pela administração de alimentos e drogas dos EUA (FDA) para enumerar CTCs na corrente sanguínea. Este teste é baseado no uso de grânulos magnéticos revestidos com os marcadores anti-EpCAM, que visam especificamente as células cancerosas epiteliais. Muitos estudos têm ilustrado que EpCAM não é o marcador ideal para a detecção de CTC. De fato, os CTCs são uma subpopulação heterogênea de células cancerosas e são capazes de sofrer uma transição epitelial-mesenquimais (EMT) associada à proliferação e invasão metastáticas. Estes CTCs são capazes de reduzir a expressão do marcador epitelial de superfície celular EpCAM, enquanto aumentam os marcadores mesenquimais como vimentina. Para abordar este obstáculo técnico, outros métodos de isolamento baseados em propriedades físicas de CTCs foram desenvolvidos. As tecnologias microfluidic permitem uma aproximação Label-Free ao enriquecimento de CTC das amostras de sangue inteiras. A tecnologia microfluídico espiral usa as forças de arrasto inercial e Dean com fluxo contínuo em canais curvados gerados dentro de um chip microfluídico espiral. As células são separadas com base nas diferenças de tamanho e plasticidade entre as células sanguíneas normais e células tumorais. Este protocolo detalha as etapas diferentes para caracterizar a expressão programada do Death-ligand 1 (PD-L1) dos CTCs, combinando um dispositivo microfluídicos espiral com o conjunto de marcador customizável da imunofluorescência (if).

Introdução

Os linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos do tumor (CTLs) jogam um papel crucial na resposta aos cancros através de um processo sabido como o cancer "fiscalização imune". Suas funções antitumorais são reforçadas por anticorpos imunológicos de bloqueio de ponto de verificação, como inibidores da CTLA-4 e inibidores da PD-1/PD-L1. No câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), as terapias anti-PD-1/PD-L1 resultam em taxas de resposta variando de 0%-17% em pacientes com tumores PD-L1-negativos e 36%-100% naqueles que expressam PD-L1. As respostas robustas ao bloqueio PD-1/PD-L1 observadas no melanoma e no NSCLC são mostradas pela evidência da taxa de resposta global melhorada (RR), dos benefícios clínicos duráveis, e da sobrevivência livre de progressão (PFS). Actualmente, os tratamentos PD1 são o padrão de cuidados no tratamento com NSCLC de segunda linha com nivolumab, independentemente da expressão PD-L1 e com pembrolizumab em doentes que expressam PD-L1 ≥ 1%. No tratamento de primeira linha, o padrão de cuidado é pembrolizumab isoladamente em pacientes com NSCLC expressando PD-L1 ≥ 50% e pode ser potencialmente reforçada com quimioterapia (platina e droga de dúvida dependendo do subtipo histológico)^1,2.

Entretanto, tal aproximação à gerência paciente é discutível³, desde que a expressão de PD-L1 em pilhas do tumor por immunohistochemistry (IHC) é provavelmente não o Biomarker o mais ideal do companheiro. Outros, como a carga de mutação tumoral⁴ (TMB), a instabilidade de MICROSSATÉLITES (MSI) e/ou a microbiota são possivelmente interessantes neste ajuste isoladamente ou em combinação. NSCLC é sabido para ser tumores heterogêneos, ou espacialmente (de um local do tumor a um outro) ou temporally (do diagnóstico ao retorno). Os pacientes com NSCLC são geralmente frágeis, e as biópsias invasoras iterativas do tecido podem ser uma edição. Na verdade, a taxa de re-biópsia na primeira progressão varia de 46%-84%, dependendo da série, e a re-biópsia bem-sucedida (significado com análise histológica e completa molecular) varia de 33%-75%. Isso significa que 25%-67% dos pacientes não podem receber uma análise de re-biópsia abrangente durante a primeira progressão^5,6,7,8.

O advento das "biópsias líquidas" gerou assim um entusiasmo considerável neste cenário particular, pois possibilita uma reavaliação crucial das alterações moleculares durante a progressão da doença, examinando o DNA livre circulante (cfDNA) derivado da circulação células tumorais (CTCs). Estas células vivem são liberados do tumor para a corrente sanguínea, onde circulam livremente. Embora não seja rotineiramente utilizado, a análise de CTCs parece ser altamente promissora no caso de caracterização molecular e fenotípica, prognóstico e significância preditiva no câncer de pulmão (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna e análise proteica). Certamente, os CTCs provavelmente abrigam características fenotípicas da doença ativa um pouco do que os marcadores iniciais (detectados em biópsias do tecido no diagnóstico). Além disso, os CTCs contorneam o problema da heterogeneidade espacial do tecido do tumor, que pode ser uma edição crucial em biópsias pequenas. Consequentemente, a expressão de PD-L1 em CTCs pode potencialmente lançar luz sobre as discrepâncias derivadas de seu uso como um biomarcador preditivo usando tecido tumoral.

Recentemente, a expressão PD-L1 foi testada em CTCs do NSCLC. Quase todos os pacientes testados⁹ foram positivos para PD-L1, complicando a interpretação do resultado e seu uso clínico. Em geral, os CTCs PD-L1-positivos foram detectados em 69,4% das amostras de uma média de 4,5 células/mL¹⁰. Após o início da radioterapia, a proporção de CTCs PD-L1-positivas aumentou significativamente, indicando a upregulação da expressão de PD-L1 em resposta à radiação¹¹. Daqui, a análise do CTCs PD-L1 pode ser usada para monitorar mudanças dinâmicas do tumor e da resposta imune, que podem refletir a resposta à quimioterapia, à radiação, e aos tratamentos prováveis da imunoterapia (TI).

Até o momento, o isolamento CTCs e a caracterização PD-L1 dependem de vários métodos, como captura de CTC com base em talão magnético revestido com anti-epcam, ensaio baseado em enriquecimento e com base em tamanho de^12,13 ensaios de captura de CTC. Entretanto, os CTCs foram detectados somente em 45%-65% dos pacientes com NSCLC metastático, limitando assim sua habilidade de fornecer toda a informação para mais do que a metade de pacientes metastáticos de NSCLC. Além, a contagem do CTC era baixa em a maioria destes estudos usando a aproximação tamanho-baseada¹⁰. Além disso, este método conduziu às discrepâncias tais como a deteção de pilhas de CD45 (-)/DAPI (+) com "testes padrões citomorfológicos da malignidade" na circulação sanguínea de doadores saudáveis. Estas preocupações destacam a necessidade de um método altamente sensível de coleta de CTC associado à imuno-fenotipagem de células CD45 (-) atípicas de sangue total saudável usando biomarcadores adicionais de câncer (i.e., TTF1, Vimentin, EpCAM e CD44) no NSCLC.

Consequentemente, avaliamos um dispositivo microfluídico espiral que utiliza forças de arrasto inercial e Dean para separar as células com base no tamanho e na plasticidade através de um chip microfluídico. A formação de fluxos de vórtice Dean presente nos resultados de chip microfluídico em CTCs maiores localizados ao longo da parede interna e células imunes menores ao longo da parede externa do chip. O processo de enriquecimento é completado por desviando as células maiores na tomada de coleta como a fração de CTC enriquecida. Este método é particularmente sensível e específico (detecção de cerca de 1 CTC/mL de sangue total)¹⁴ e pode ser associado a análises de imunofluorescência (if) personalizadas. Estas ferramentas permitirão a criação de um limiar positivo para a interpretação clínica. Um fluxo de trabalho é descrito assim que permite que os biólogos isolem e immunophenotype CTCs com uma taxa elevada de recuperação e de especificidade. O protocolo descreve o uso ideal do dispositivo microfluídico espiral para coletar CTCs, os ensaios otimizados IF que podem ser personalizados de acordo com o tipo de câncer, e o uso de software livre de código aberto para medir e analisar imagens de células para executar um semiautomático numeração das células de acordo com a coloração fluorescente. Além disso, a multiplexação por microscópio pode ser realizada dependendo do número de filtros/marcadores fluorescentes disponíveis.

Protocolo

As amostras foram coletadas prospectivamente no âmbito da coorte CIRCAN ("câncer circulante") com base no hospital universitário de Lyon, após o consentimento por escrito do paciente. Este estudo foi integrado na coorte CIRCAN_ALL. O estudo CIRCAN_ALL foi reconhecido como não intervencionista pelo CPP sudeste IV datado de 04/11/2015 a referência L15-188. Uma versão alterada foi reconhecida como não intervencionista em 20/09/2016 a referência L16-160. O estudo CIRCAN_ALL foi declarado ao IT e ao correspondente da liberdade dos Hospices civils de Lyon em 01/12/2015, a referência 15-131. A coleta de sangue foi realizada quando os médicos observaram a primeira indicação de progressão tumoral.

Nota: Use todos os reagentes e materiais descritos na tabela de materiais com as respectivas condições de armazenamento para preparação de amostras pré-analíticas e ensaio de imunofluorescência. Substituir os reagentes e/ou modificar as condições de armazenamento pode resultar em um desempenho de ensaio subsuboptimal.

1. descontaminação do dispositivo Microfluídico espiral

Nota: A descontaminação do dispositivo microfluídico espiral é uma exigência para remover todo o fundo da imunofluorescência gerado da contaminação das bactérias, explora a citomorfologia dos CTCs, e pode diferenciá-los das pilhas imunes normais. O protocolo é otimizado para amostras de sangue coletadas em tubos de EDTA K₂dentro de 6 h após a amostragem de sangue e enriquecido usando o dispositivo microfluídico em espiral em condições limpas. A utilização deste ensaio para outros tipos de amostras (outros fluidos biológicos) pode requerer uma optimização adicional. Este protocolo de descontaminação deve ser feito uma vez por semana.

1. Preparação de reagentes
   1. Preparação do tampão diluente
      1. Esterilizar 20 mL de reagente aditivo diluente usando um filtro de seringa de 0,22 μm e adicionar diretamente a 1 L de 1x tampão fosfato salina (PBS) Ultra-Pure grau (tabela de materiais).
   2. Esterilização de reagentes e a palha de entrada
      1. Esterilizar o tampão de lise do RBC e o tampão de ressuspensão (RSB; Tabela de materiais) usando um filtro de seringa de 0,22 μm e um estoque em um novo tubo cônico de polipropileno 50 mL para cada solução.
      2. Esterilize a palha da entrada incubando na temperatura ambiente (RT) para 1 h no reagente de limpeza para todos os fins (tabela de materiais). Transfira a palha para o agente de limpeza à base de lixívia (tabela de materiais) e incubar na RT durante 1 h.
      3. Lave a palha de entrada duas vezes com PBS estéril por 1 h cada e guarde a palha de entrada esterilizada em um saco cirurgicamente estéril (tabela de materiais).
2. Descontaminando o dispositivo microfluídico espiral
   1. Desinfecção usando o reagente de limpeza para todos os fins
      1. Desligue a tampa do frasco diluente da porta diluente do dispositivo microfluídico espiral desparafusando o parafuso castanho. um gabinete de segurança microbiológica, transfira até 250 mL de reagente de limpeza para todos os fins (tabela de materiais) para uma nova garrafa vazia.
      2. Aparafuse a tampa e a palha do frasco diluente ao frasco de 250 mL de reagente de limpeza para todos os fins, um gabinete de segurança microbiológico. Prenda este frasco à porta diluente do dispositivo microfluídico espiral aparafusando o parafuso castanho.
      3. Transferência de até 100 mL de lixívia (1% de concentração final; Tabela de materiais) para o recipiente de resíduos fornecido no kit de corrida (Figura 1a).
      4. Coloque uma nova palha de entrada estéril sobre o dispositivo microfluídico espiral (tabela de materiais) na porta de entrada. Carregue um novo tubo de centrífuga de 50 mL na porta de entrada. Carregue um novo tubo de centrífuga de 50 mL na porta de saída.
      5. Prossiga para Prime o dispositivo microfluídico espiral clicando em Prime no dispositivo microfluídico espiral (3 min). Retire o tubo de entrada após a conclusão da Prime.
      6. Transfira até 15 mL de reagente de limpeza para todos os fins para um novo tubo de centrifugação de 50 mL com uma pipeta serológica um armário de segurança microbiológico e prenda o tubo à porta de entrada do dispositivo microfluídico espiral.
      7. Antes de iniciar a corrida, verifique se a solução está livre de bolhas excessivas. Se as bolhas estiverem presentes, retire-as por aspiração lenta com uma pipeta.
      8. Carregue um chip microfluídico de descontaminação no dispositivo microfluídico espiral. Execute um programa 3 no dispositivo microfluídico espiral clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min).
         Nota: o programa 3 do dispositivo microfluídico espiral permite um rápido enriquecimento de CTCs em 31 min.
      9. Continue com a etapa de limpeza do dispositivo microfluídico espiral usando o volume restante do reagente de limpeza para todos os fins no tubo de entrada.
      10. Descarte o tubo de entrada após a conclusão da etapa de limpeza, deixando para trás a palha de entrada.
   2. Descontaminação usando o agente de limpeza à base de lixívia
      1. Desconecte a tampa de garrafa de reagente de limpeza para todos os fins da porta diluente do dispositivo microfluídico espiral, desapertando o parafuso marrom. um gabinete de segurança microbiológica, transfira até 250 mL de agente de limpeza à base de lixívia (tabela de materiais) num novo frasco vazio (Figura 1a).
      2. Aparafuse a tampa de garrafa de reagente de limpeza para todos os fins e a palha ao frasco que contém o agente de limpeza à base de lixívia um gabinete de segurança microbiológico. Prenda este frasco à porta diluente do dispositivo microfluídico espiral aparafusando o parafuso castanho.
      3. Transfira até 15 mL de agente de limpeza à base de lixívia para um novo tubo de entrada de tubo de centrifugação de 50 mL utilizando uma pipeta serológica um gabinete de segurança microbiológico. Coloque a posição de entrada do tubo de centrifugação 50 mL. Coloque um tubo vazio na posição de saída.
      4. Antes de processar a corrida, verifique se a amostra está livre de bolhas excessivas e se houver algum presente, retire as bolhas, aspirando-as lentamente com uma pipeta.
      5. Execute o programa 3 clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min). Após a execução, prossiga diretamente para a etapa de limpeza usando o volume restante do agente de limpeza à base de lixívia no tubo de entrada.
      6. Descarte os tubos de entrada e saída.
   3. Enxágüe o dispositivo microfluídico espiral.
      1. Desconecte a tampa do frasco do agente de limpeza à base de lixívia da porta diluente do dispositivo microfluídico espiral desparafusando o parafuso marrom. um gabinete de segurança microbiológica, transfira a palha do frasco contendo o agente de limpeza à base de lixívia para a nova garrafa que contém o tampão diluente. Aparafuse o frasco ao dispositivo microfluídico espiral.
      2. Transfira até 15 mL de água esterilizada (tabela de materiais) para um novo tubo de entrada de tubo de centrifugação de 50 ml utilizando uma pipeta serológica um armário de segurança microbiológico. Coloque a posição de entrada do tubo de centrifugação 50 mL. Coloque um tubo vazio na posição de saída.
      3. Antes de processar a corrida, verifique se a amostra está livre de bolhas excessivas e se houver algum presente, retire as bolhas, aspirando-as lentamente com uma pipeta.
      4. Execute o programa 3 clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min). Após a corrida, prossiga diretamente para a etapa de limpeza usando o volume restante de água esterilizada no tubo de entrada.
      5. Descarte os tubos de entrada e saída.

2. manutenção para manter o dispositivo Microfluídico espiral bactérias-livre

Nota: A manutenção de rotina deve ser feita no final do dia durante a última etapa de limpeza.

1. Transfira até 7 mL de agente de limpeza à base de lixívia para o novo tubo de centrifugação de 50 mL utilizando uma pipeta serológica um armário de segurança microbiológico. Aparafuse o tubo de limpeza à base de lixívia na porta de entrada do dispositivo microfluídico espiral.
2. Antes de processar o funcionamento limpo, verifique se a amostra de entrada está livre de bolhas excessivas e, se houver, retire as bolhas, aspirando-as lentamente com uma pipeta.
3. Execute a limpeza no dispositivo microfluídico espiral.

3. enriquecimento pré-analítico do CTC de amostras de sangue do paciente

1. Colete 7,5 ml de sangue no tubo do EDTA de K₂e mantenha-se a agitação delicada para evitar o sedimentação e a coagulação da pilha. Processo dentro de 6 h.
   Nota: Se o sangue é coletado em um tubo de coleta de sangue de DNA sem células contendo conservante, armazene a 4 ° c até o processamento. Assegure-se de que a amostra de sangue, o tampão de lise de RBC, e o amortecedor RBS estejam em RT antes de prosseguir com a etapa do enriquecimento.
2. Transfira até 7,5 ml do sangue inteiro a um tubo de entrada novo do tubo de centrifugação de 50 ml usando uma pipeta sorológicos um armário de segurança microbiológico.
3. Centrifugador em 1.600 x g por 10 min em RT. colete a fração de plasma com uma pipeta sem perturbar o casaco Buffy. Substitua a fração plasmática adicionando volume diretamente equivalente de PBS até 7,5 mL.
4. Adicione delicadamente o amortecedor da lise de RBC (tabela dos materiais) à amostra de sangue a um volume final de 30 ml (para um tubo do EDTA de K₂) ou a 37,5 ml (para um tubo Cell-Free da coleção do sangue do ADN). Inverta suavemente o tubo de coleta de sangue 10x e incubar por 10 min em RT.
   Nota: A amostra de sangue fica vermelha mais escura durante a lise de RBC. Se nenhuma mudança (de vermelho escuro e opaco) é observada após 10 min, inverta suavemente o tubo 3x e deixar de pé para outro 5 min máximo. Não deixe a amostra no tampão de lise de RBC por mais de 15 minutos porque pode comprometer a qualidade da amostra e o desempenho do ensaio.
5. Centrifugue a amostra de sangue lisado em 500 x g por 10 min em RT, com freios centrífugos em (ou maior velocidade de desaceleração). Use uma pipeta de Pasteur ou uma pipeta sorológicos para remover delicadamente o sobrenadante até que o volume alcangue a marca de 4-5 ml. Em seguida, use as pontas de micropipeta filtradas para remover o sobrenadante restante.
6. Usando uma micropipeta P1000 com uma ponta filtrada, adicione 1,0 mL de RSB à parede do tubo de entrada do tubo de centrifugação de 50 mL. Para evitar a introdução de bolhas na mistura, Ressuspender o pellet celular gentilmente pipetando para cima e para baixo até que a amostra é homogênea.
7. Adicionar um adicional de 3 mL de RSB à parede do tubo de entrada do tubo de centrifugação de 50 mL (volume total 4 mL). Evite introduzir bolhas na mistura. Misture suavemente a suspensão da célula introduzindo suavemente a pipetagem para cima e para baixo.
   Nota: No caso improvável de que a pipetagem regular não é capaz de quebrar os aglomerantes de células (definido por ser visível ou bloqueando a ponta da pipeta), filtre a amostra através de um filtro de célula de 40 μm para remover quaisquer aglomerantes. Adicione 150 μL de RSB à amostra para compensar a perda de volume da filtragem. Observe que este método deve ser usado com moderação e somente quando grandes aglomerados são observados.
8. Antes de prosseguir para a etapa de enriquecimento, verifique se a amostra está livre de bolhas excessivas e, se houver, retire as bolhas e tome cuidado para não descartar nenhuma amostra. Se as bolhas minúsculas estão atuais, sua remoção não é exigida.
9. Processe a amostra no dispositivo microfluídico espiral.

4. enriquecimento de CTCs do sangue inteiro paciente com o dispositivo Microfluídico espiral

1. Carregue um novo chip microfluídico espiral. Carregue dois tubos de centrifugação vazios de 50 mL em portas de entrada e saída.
2. Execute um Prime clicando em Prime no dispositivo microfluídico espiral (3 min). Remova os tubos de entrada e saída e carregue a amostra a ser processada na porta de entrada.
3. Carregue um tubo cônico transparente de 15 mL na porta de saída para coletar CTCs enriquecidas. Execute o programa 3 clicando em executar e selecionando o programa 3 (31 min).
4. Descarregar o tubo de saída e centrifugar a 500 x g durante 10 min (aceleração: 9; desaceleração: 5). com uma pipeta serológica de 5 ml, retire o sobrenadante parando na marca de 2 ml no tubo cônico de 15 ml. Com uma micropipeta, retire o sobrenadante parando a 100 μL de marca no tubo cônico de 15 mL. Processe a amostra enriquecida diretamente para a coloração da imunofluorescência.

5. coloração da imunofluorescência

1. Enumerar em um slide com câmara com uma grade do tipo Hemocytometer o número de células por mL. Diluir a amostra enriquecida com 0,2% de solução antiligante (tabela de materiais) para uma concentração atingindo 100.000 células/100 μl por citospin.
2. Umedecer o contorno da câmara de amostra usando algodão (tabela de materiais) com 50 μL de 0,2% de solução antiligação. Coloc um vidro-corrediça do polilisina na câmara da amostra e feche-o.
3. Bata uma ponta com 0,2% anti-solução de ligação por pipetagem para cima e para baixo 3x. Resuspend a amostra enriquecida e transfira a solução da pilha na câmara da amostra. Centrifugador com uma centrífuga dedicada (tabela de materiais) a 400 rpm por 4 min (aceleração baixa).
4. Coloc um isolador do silicone em torno da área do depósito. Deixe secar o vidro-deslize um gabinete de segurança microbiológica por 2 min.
5. Prepare a solução de fixação diluindo 1 mL de paraformaldeído a 16% (PFA) com 3 mL de PBS estéril. Adicionar 100 μL de solução de fixação (4% PFA) por amostra e incubar em RT durante 10 min. Retire a solução de fixação e realize três lavas com 200 μL de PBS e incubar em RT cada por 2 min.
   Atenção: Use PFA um gabinete de segurança química para evitar a inalação.
6. Prepare a solução de saturação diluindo o soro fetal bovino (FBS) em 5%, o receptor FC (FcR) que bloqueia o reagente em 5%, e a albumina de soro bovina (BSA) em 1% em PBS estéril (tabela de materiais). Adicionar 100 μL de solução de saturação por amostra e incubar por 30 min em RT. remover a solução de saturação.
7. Adicionar 100 μL de solução de anticorpos por amostra (CD45 anticorpo 1/20; PanCK anticorpo 1/500; PD-L1 anticorpo 1/200; Solução de saturação QSP 100 μL) (tabela de materiais). Coloc o vidro-corrediça do polilisina em um prato de Petri de 100 milímetros x de 15 milímetros. Umedeça um papel absorvente com 2 mL de água estéril e feche o prato de Petri com a tampa. Coloc em 4 ° c durante a noite e proteja da luz.
8. Retire a mistura de anticorpos e realize 3 lavagens com 200 μL de PBS incubando cada lavagem durante 2 min. Deixe a amostra secar por 5 min e proteja-a da luz. Coloque 10 μL de solução de montagem (tabela de materiais) na área de deposição e cubra com uma lamínula de microscópio sem fazer uma bolha. Sele o lamela com lustrador de prego.

6. aquisição de imagens imunofluorescentes com microscópio fluorescente reto e software associado

1. Use um microscópio fluorescente reto com uma plataforma motorizada X/Y. Use um objetivo 20x para tirar imagens RGB TIFF de 8 bits em quatro canais correspondentes à tintura de DNA (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), corante PanCK (isotiocianato de fluoresceina [FITC]), corante PD-L1 (CY3) e corante CD45 (CY5). Gire sobre a lâmpada de mercúrio 15 minutos antes de usar, e adapte o microscópio e o software associado à parte aérea semiautomatizada.
2. Coloque a corrediça de vidro na plataforma.
3. No menu de aquisição, definir os quatro canais e configurar o tempo de exposição (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 MS; CY3 [PD-L1]: 800 MS; CY5 [CD45]: 1.000 MS). Defina as telhas para digitalizar. Clique em mosaicos. No experimento avançado, defina a área a ser digitalizá-lo.
4. Ajuste o foco na tela. Clique em Iniciar experimento.
5. Exporte arquivos TIF de cada canal e nomeie especificamente o arquivo de imagem com esta informação: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. tif (por exemplo, Sample1_TR1_c1m01). Tintura de nome como segue: o canal DAPI é C1, canal FITC é C2, CY3 canal é C3, e CY5 canal é C4.

7. análise de imagens imunofluorescentes com software de análise de imagem

1. Transfira e instale o software livre da análise da imagem do Web site do Instituto largo. Aceite todo o padrão durante a instalação. Abra o software de análise de imagem e clique em arquivo | Pipeline do arquivo | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
   Nota: O pipeline converte imagens de cores RGB em tons de cinza, remove artefatos Suavizando imagens com um filtro mediano, identifica núcleos e citoplasma, quantifica intensidades de fluorescência de cada canal e as exporta para um arquivo Excel.
2. Solte os arquivos na lista arquivo. Atualize os metadados para agrupar os arquivos por blocos.
   Nota: Todas as instruções para agrupar imagens são especificadas no software. Os arquivos de nome apareceram no módulo Namesandtypes e os arquivos são agrupados de acordo com o número do bloco e do canal por amostras.
3. Clique em exibir configurações de saída e especifique uma saída padrão correta. Clique em analisar imagens. Abra o arquivo de planilha correspondente aos parâmetros measure_intensity .

Resultados

O primeiro pré-requisito foi a obtenção de coleções não contaminadas (sem agente infeccioso) de CTCs para cultura tecidual e evitar o fundo IF gerado. O protocolo de descontaminação permitiu a limpeza de todos os tubos e bombas, e resultou na coleta de CTCs com uma boa taxa de recuperação sem contaminação bacteriana. As amostras enriquecidas foram comparadas sem e com o fluxo de trabalho do protocolo de descontaminação do dispositivo microfluídico espiral. Para validar o protocolo de descontaminação, uti...

Discussão

Dois pontos principais foram levantados no presente estudo, o primeiro com relação ao desempenho do fluxo de trabalho para sua transferência para aplicações clínicas, e o segundo referente à diminuição da subjetividade para a análise das imagens de fluorescência obtidas.

Um fluxo de trabalho performant e aperfeiçoado para A enumeração CTC foi determinado inicialmente usando o teste customizável do If após o enriquecimento da pilha através de um sistema microfluídicos Label-Fr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4 °C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4 °C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software