Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Résumé

La caractérisation des cellules tumorales circulantes (CTC) est un sujet populaire dans la recherche translationnelle. Ce protocole décrit un test semi-automatique d'immunofluorescence (IF) pour la caractérisation de PD-L1 et l'énumération des CTC dans les échantillons patients de cancer de poumon de non-petite cellule (NSCLC).

Résumé

Les cellules tumorales circulantes (CTC) dérivées de la tumeur primaire sont jetées dans la circulation sanguine ou le système lymphatique. Ces cellules rares (1 à 10 cellules par ml de sang) justifient un mauvais pronostic et sont corrélées avec une survie globale plus courte dans plusieurs cancers (p. ex. le sein, la prostate et le cancer colorectal). À l'heure actuelle, le système de capture à base de perles magnétiques anti-EpCAM est le test de référence approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l'énumération des CCT dans la circulation sanguine. Ce test est basé sur l'utilisation de perles magnétiques recouvertes de marqueurs anti-EpCAM, qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses épithéliales. De nombreuses études ont montré qu'EpCAM n'est pas le marqueur optimal pour la détection de la CCT. En effet, les CTC sont une sous-population hétérogène de cellules cancéreuses et sont capables de subir une transition épithéliale à mésenchymale (EMT) associée à la prolifération métastatique et à l'invasion. Ces CTC sont capables de réduire l'expression du marqueur épithélial de surface cellulaire EpCAM, tout en augmentant les marqueurs mésenchymal tels que la vimentine. Pour surmonter cet obstacle technique, d'autres méthodes d'isolement fondées sur les propriétés physiques des CCT ont été mises au point. Les technologies microfluidiques permettent une approche sans étiquette de l'enrichissement de la CCT à partir d'échantillons de sang entier. La technologie microfluidique spirale utilise les forces de traînée inertielles et Dean avec un flux continu dans les canaux incurvés générés dans une puce microfluidique spirale. Les cellules sont séparées en fonction des différences de taille et de plasticité entre les cellules sanguines normales et les cellules tumorales. Ce protocole détaille les différentes étapes pour caractériser l'expression programmée de la ligand de la mort 1 (PD-L1) des CTC, combinant un dispositif microfluidique en spirale avec l'ensemble de marqueurs d'immunofluorescence personnalisable (IF).

Introduction

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques à l'antigène tumoral jouent un rôle crucial dans la réponse aux cancers par le biais d'un processus connu sous le nom de « surveillance immunitaire » du cancer. Leurs fonctions antitumorales sont renforcées par des anticorps de blocus de point de contrôle immunitaire tels que les inhibiteurs cTLA-4 et les inhibiteurs De PD-1/PD-L1. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), les thérapies anti-PD-1/PD-L1 ont comme conséquence des taux de réponse s'étendant de 0%-17% dans les patients présentant des tumeurs PD-L1-négatives et 36%-100% dans ceux exprimant PD-L1. Les réponses robustes au blocus de PD-1/PD-L1 observées dans le mélanome et NSCLC sont montrées par l'évidence du taux global amélioré de réponse (RR), des avantages cliniques durables, et de la survie sans progression (PFS). À l'heure actuelle, les traitements anti-PD1 sont la norme de soins dans le traitement de deuxième intention avec le nivolumab indépendamment de l'expression PD-L1 et avec le pembrolizumab chez les patients exprimant PD-L1 -1%. Dans le traitement de première ligne, la norme de soins est le pembrolizumab seul chez les patients atteints de NSCLC exprimant PD-L1 50% et peut être potentiellement améliorée avec la chimiothérapie (platin et médicament doublet selon le sous-type histologique)^1,2.

Cependant, une telle approche à lagestion patiente est discutable 3, puisque l'expression de PD-L1 dans les cellules de tumeur par immunohistochemistry (IHC) n'est probablement pas le biomarqueur de compagnon le plus idéal. D'autres tels que la charge de mutation de tumeur⁴ (TMB), l'instabilité de microsatellite (MSI), et/ou le microbiote sont probablement intéressants dans ce arrangement seul ou en combinaison. NSCLC sont connus pour être des tumeurs hétérogènes, soit spatialement (d'un site de tumeur à un autre) ou temporellement (du diagnostic à la répétition). Les patients atteints de NSCLC sont généralement fragiles, et les biopsies invasives itératives de tissu peuvent être un problème. En effet, le taux de rebiopsie à la première progression varie de 46% à 84% selon les séries, et la re-biopsie réussie (c'est-à-dire avec une analyse histologique et moléculaire complète) varie de 33% à 75%. Cela signifie que 25%-67% des patients ne peuvent pas recevoir une analyse complète de re-biopsie au cours de la première progression^5,6,7^,8.

L'avènement des « biopsies liquides » a ainsi suscité un enthousiasme considérable dans ce contexte particulier, car il permet une réévaluation cruciale des altérations moléculaires lors de la progression de la maladie en examinant l'ADN libre circulant (aDNc) dérivé de la circulation cellules tumorales (CTC). Ces cellules vivantes sont libérées de la tumeur dans la circulation sanguine, où elles circulent librement. Bien qu'elle ne soit pas couramment utilisée, l'analyse des CCT semble très prometteuse dans le cas de la caractérisation moléculaire et phénotypique, du pronostic et de l'importance prédictive dans le cancer du poumon (via DNAseq, RNAseq, miRNA et analyse des protéines). En effet, les CTC abritent probablement des caractéristiques phénotypiques de la maladie active plutôt que les marqueurs initiaux (détectés sur les biopsies tissulaires au moment du diagnostic). En outre, les CTC détournent le problème de l'hétérogénéité spatiale du tissu tumoral, qui peut être un problème crucial dans de petites biopsies. Par conséquent, l'expression de PD-L1 sur des CTC peut potentiellement jeter la lumière sur les écarts dérivés de son utilisation comme biomarqueur prédictif utilisant le tissu de tumeur.

Récemment, l'expression PD-L1 a été testée dans les CCT de NSCLC. Presque tous les patients examinés⁹ étaient Positifs de PD-L1, compliquant l'interprétation du résultat et de son utilisation clinique. Dans l'ensemble, des CTC positifs au PD-L1 ont été détectés dans 69,4 % des échantillons provenant d'une moyenne de 4,5 cellules/mL¹⁰. Après l'initiation de la radiothérapie, la proportion de CTC PD-L1-positifs a augmenté de manière significative, indiquant la régulation vers le haut de l'expression de PD-L1 en réponse au rayonnement^11. Par conséquent, l'analyse de CTC de PD-L1 peut être employée pour surveiller des changements dynamiques de la tumeur et de la réponse immunitaire, qui peuvent refléter la réponse à la chimiothérapie, à la radiothérapie, et aux traitements probables d'immunothérapie (IT).

À ce jour, l'isolement des CCT et la caractérisation de la DPc-L1 s'appuient sur diverses méthodes telles que lacapture de perles magnétiques à base de perles magnétiques anti-EpCAM, l'analyse basée sans enrichissement et la taille 12^,13 essais de capture de la CCT. Cependant, les CTC n'ont été détectés que chez 45 à 65 % des patients atteints de NSCLC métastatique, ce qui limite leur capacité de fournir des renseignements à plus de la moitié des patients atteints de NSCLC métastatique. De plus, le nombre de CCT était faible dans la plupart de ces études en utilisant l'approche fondée sur la taille¹⁰. En outre, cette méthode a conduit à des divergences telles que la détection de cellules CD45(-)/DAPI(MD) avec des « modèles cytomorphologiques de malignité » dans la circulation sanguine de donneurs en bonne santé. Ces préoccupations soulignent la nécessité d'une méthode très sensible de collecte de la CCT associée au phénotypage immunitaire des cellules CD45(-) atypiques provenant de sang entier sain à l'aide de biomarqueurs du cancer supplémentaires (c.-à-d. TTF1, Vimentin, EpCAM et CD44) dans le NSCLC.

Par conséquent, nous avons évalué un dispositif microfluidique en spirale qui utilise des forces de traînée inertielles et dedoyen pour séparer les cellules en fonction de la taille et de la plasticité à l'intermédiaire d'une puce microfluidique. La formation des flux de vortex Dean présents dans la puce microfluidique donne lieu à de plus grandes CTC situées le long de la paroi intérieure et à de plus petites cellules immunitaires le long de la paroi extérieure de la puce. Le processus d'enrichissement est complété par le siphonnage des cellules plus grandes dans la prise de collecte comme la fraction de la CCT enrichie. Cette méthode est particulièrement sensible et spécifique (détection d'environ 1 CTC/mL de sang entier)¹⁴ et peut être associée à des analyses personnalisées d'immunofluorescence (IF). Ces outils permettront de mettre en place un seuil positif pour l'interprétation clinique. Un flux de travail est ainsi décrit qui permet aux biologistes d'isoler et d'immunophénotype CTC avec un taux élevé de récupération et de spécificité. Le protocole décrit l'utilisation optimale de l'appareil microfluidique en spirale pour recueillir les CTC, les tests IF optimisés qui peuvent être personnalisés selon le type de cancer, et l'utilisation de logiciels libres open-source pour mesurer et analyser les images cellulaires pour effectuer un semi-automatique numération des cellules en fonction de la coloration fluorescente. En outre, le multiplexage au microscope peut être effectué en fonction du nombre de filtres fluorescents/marqueurs disponibles.

Protocole

Des échantillons ont été prélevés de façon prospective dans le cadre de la cohorte CIRCAN (CIRculating CANcer) basée au CHU de Lyon après le consentement écrit du patient. Cette étude a été intégrée à la cohorte CIRCAN-ALL. L'étude CIRCAN-ALL a été reconnue comme non interventionnelle par le RPC Sud-Est IV daté du 04/11/2015 en vertu de la référence L15-188. Une version modifiée a été reconnue comme non interventionnelle le 20/09/2016 en vertu de la référence L16-160. L'étude CIRCAN-ALL a été déclarée au correspondant informatique et liberté des Hospices Civils de Lyon le 01/12/2015, sous la référence 15-131. La collecte de sang a été exécutée quand les médecins ont observé la première indication de progression de tumeur.

REMARQUE: Utiliser tous les réactifs et les matériaux décrits dans le Tableau des matériaux avec les conditions d'entreposage respectives pour la préparation pré-analytique de l'échantillon et l'analyse de l'immunofluorescence. Le remplacement des réactifs et/ou la modification des conditions de stockage pourrait entraîner des performances d'évaluation sous-optimales.

1. Décontamination de l'appareil microfluidique spiralé

REMARQUE: La décontamination de l'appareil microfluidique en spirale est une exigence pour éliminer tous les antécédents d'immunofluorescence générés par la contamination bactérienne, explorer la cytomorphologie des CTC et être en mesure de les différencier des cellules immunitaires normales. Le protocole est optimisé pour les échantillons de sang prélevés dans les tubes K₂EDTA dans les 6 h après l'échantillonnage du sang et enrichi à l'aide de l'appareil microfluidique spirale dans des conditions propres. L'utilisation de cet analyse pour d'autres types d'échantillons (autres fluides biologiques) peut nécessiter une optimisation supplémentaire. Ce protocole de décontamination doit être fait une fois par semaine.

1. Préparation des réactifs
   1. Préparation du tampon diluant
      1. Stériliser 20 mL de réactif additif diluant à l'aide d'un filtre à seringues de 0,22 m et ajouter directement à 1 L de 1x tampon de phosphate de qualité saline (PBS) de qualité ultra-pure (Tableau des matériaux).
   2. Stérilisation des réactifs et de la paille d'entrée
      1. Stériliser le tampon de lyse RBC et le tampon de résuspension (RSB; Tableau des matériaux) à l'aide d'un filtre à seringues de 0,22 m et d'un stock dans un nouveau tube conique en polypropylène de 50 ml pour chaque solution.
      2. Stériliser la paille d'entrée en couve à température ambiante (RT) pendant 1 h dans le réactif de nettoyage tout usage (Table des matériaux). Transférer la paille à l'agent nettoyant à base d'eau de Javel (Table of Materials) et couver à RT pendant 1 h.
      3. Rincer la paille d'entrée deux fois avec du PBS stérile pendant 1 h chacun et entreposer la paille d'entrée stérilisée dans un sac chirurgicalement stérile (Table des Matériaux).
2. Décontamination du dispositif microfluidique en spirale
   1. Désinfection à l'aide du réactif nettoyant tout usage
      1. Déconnectez le bouchon de bouteille diluant du port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en dévissant la vis brune. Sous un coffret de sécurité microbiologique, transférer jusqu'à 250 ml de réactif de nettoyage tout usage (Tableaudes matériaux)dans une nouvelle bouteille vide.
      2. Visser le bouchon de bouteille diluant et la paille à la bouteille de 250 ml de réactif de nettoyage tout usage sous une armoire de sécurité microbiologique. Fixez cette bouteille au port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en vissant la vis brune.
      3. Transférer jusqu'à 100 ml d'eau de Javel (1 % de concentration finale; Tableau des matériaux) au conteneur de déchets fourni dans le kit de course (Figure 1A).
      4. Chargez une nouvelle paille d'entrée stérile sur le dispositif microfluidique en spirale (Table of Materials) dans le port d'entrée. Chargez un nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml dans le port d'entrée. Chargez un nouveau tube centrifugeur de 50 mL dans le port de sortie.
      5. Procédez à l'apaisement de l'appareil microfluidique en spirale en cliquant sur Prime sur le dispositif microfluidique en spirale (3 min). Retirez le tube d'entrée une fois le premier terminé.
      6. Transférer jusqu'à 15 ml de réactif de nettoyage tout usage dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml avec une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique et attacher le tube au port d'entrée du dispositif microfluidique en spirale.
      7. Avant de commencer la course, vérifiez que la solution est exempte de bulles excessives. Si des bulles sont présentes, retirez-les par aspiration lente avec une pipette.
      8. Chargez une puce microfluidique de décontamination dans le dispositif microfluidique en spirale. Exécutez un programme 3 sur l'appareil microfluidique en spirale en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min).
         REMARQUE : Le programme 3 du dispositif microfluidique en spirale permet un enrichissement rapide des CCT en 31 min.
      9. Continuez avec l'étape de nettoyage du dispositif microfluidique en spirale en utilisant le volume restant du réactif de nettoyage tout usage dans le tube d'entrée.
      10. Jetez le tube d'entrée après l'étape de nettoyage est terminée, laissant derrière la paille d'entrée.
   2. Décontamination à l'aide de l'agent nettoyant à base d'eau de Javel
      1. Déconnectez le bouchon de bouteille de réactif de nettoyage tout usage du port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en dévissant la vis brune. Sous un coffret de sécurité microbiologique, transférer jusqu'à 250 ml d'agent nettoyant à base d'eau de Javel (tableaudes matériaux)dans une nouvelle bouteille vide (Figure 1A).
      2. Vissez le bouchon de bouteille de réactif de nettoyage tout usage et la paille à la bouteille contenant l'agent de nettoyage bleach-basé sous une armoire de sécurité microbiologique. Fixez cette bouteille au port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en vissant la vis brune.
      3. Transférer jusqu'à 15 ml d'agent nettoyant à base d'eau de Javel dans un nouveau tube d'entrée de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique. Chargez la position d'entrée du tube de centrifugeuse de 50 ml. Chargez un tube vide en position de sortie.
      4. Avant de traiter la course, vérifiez que l'échantillon est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles en les aspirant lentement avec une pipette.
      5. Exécuter le programme 3 en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min). Après la course, passez directement à l'étape de nettoyage en utilisant le volume restant d'agent nettoyant à base d'eau de Javel dans le tube d'entrée.
      6. Jeter les tubes d'entrée et de sortie.
   3. Rincer le dispositif microfluidique en spirale.
      1. Déconnectez le bouchon de bouteille à base d'agent nettoyant à base d'eau de Javel du port diluant de l'appareil microfluidique en spirale en dévissant la vis brune. Sous une armoire de sécurité microbiologique, transférer la paille de la bouteille contenant l'agent nettoyant à base d'eau de Javel à la nouvelle bouteille contenant le tampon diluant. Visser la bouteille à l'appareil microfluidique spirale.
      2. Transférer jusqu'à 15 ml d'eau stérilisée (Tabledes matériaux)dans un nouveau tube d'entrée de centrifugeuse de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous un coffret de sécurité microbiologique. Chargez la position d'entrée du tube de centrifugeuse de 50 ml. Chargez un tube vide en position de sortie.
      3. Avant de traiter la course, vérifiez que l'échantillon est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles en les aspirant lentement avec une pipette.
      4. Exécuter le programme 3 en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min). Après la course, passez directement à l'étape de nettoyage en utilisant le volume restant d'eau stérilisée dans le tube d'entrée.
      5. Jeter les tubes d'entrée et de sortie.

2. Entretien pour garder le dispositif microfluidique spiralé sans bactéries

REMARQUE: L'entretien de routine doit être effectué à la fin de la journée lors de la dernière étape de nettoyage.

1. Transférer jusqu'à 7 ml d'agent nettoyant à base d'eau de Javel dans le nouveau tube de centrifugeuse de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique. Visser le tube de nettoyage à base d'eau de Javel dans le port d'entrée de l'appareil microfluidique spirale.
2. Avant de traiter l'exécution propre, vérifiez que l'échantillon d'entrée est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles en les aspirant lentement avec une pipette.
3. Exécutez le nettoyage sur l'appareil microfluidique en spirale.

3. Enrichissement pré-analytique de la CCT à partir d'échantillons de sang de patients

1. Recueillir 7,5 ml de sang dans le tube K₂EDTA et garder sous une légère agitation pour éviter la sédimentation cellulaire et la coagulation. Processus dans les 6 h.
   REMARQUE: Si le sang est recueilli dans un tube de collecte d'ADN sans cellules contenant un agent de conservation, entreposez-le à 4 oC jusqu'au traitement. Assurez-vous que l'échantillon de sang, tampon de lyse RBC et tampon RBS sont à RT avant de procéder à l'étape d'enrichissement.
2. Transférer jusqu'à 7,5 ml de sang entier dans un nouveau tube d'entrée de centrifugeuse de 50 ml à l'aide d'une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique.
3. Centrifugeuse à 1 600 x g pendant 10 min à RT. Recueillir la fraction plasmatique avec une pipette sans déranger le pelage chamois. Remplacez la fraction plasmatique en ajoutant directement un volume équivalent de PBS jusqu'à 7,5 ml.
4. Ajouter délicatement le tampon de lyse RBC (Tableaudes matériaux)à l'échantillon de sang à un volume final de 30 ml (pour un tube K₂EDTA) ou 37,5 ml (pour un tube de collecte de sang d'ADN sans cellules). Invertis doucement le tube de collecte de sang 10x et incuber pendant 10 min à RT.
   REMARQUE: L'échantillon de sang devient rouge foncé pendant la lyse RBC. Si aucun changement (du rouge foncé et opaque) n'est observé après 10 min, inverser doucement le tube 3x et laisser reposer pendant un autre maximum de 5 min. Ne laissez pas l'échantillon dans le tampon de lyse RBC pendant plus de 15 minutes, car il peut compromettre la qualité de l'échantillon et les performances d'analyse.
5. Centrifugelée l'échantillon de sang lysé à 500 x g pendant 10 min à RT, avec des freins centrifugeurs sur (ou la vitesse de décélération la plus élevée). Utilisez une pipette Pasteur ou une pipette sérologique pour retirer délicatement le supernatant jusqu'à ce que le volume atteigne la marque de 4-5 ml. Ensuite, utilisez des pointes de micropipette filtrées pour enlever le supernatant restant.
6. À l'aide d'une micropipette P1000 à la pointe filtrée, ajouter 1,0 ml de RSB à la paroi du tube d'entrée du tube de centrifugeur de 50 ml. Pour éviter d'introduire des bulles dans le mélange, resuspendre la pastille cellulaire en faisant doucement monter et descendre jusqu'à ce que l'échantillon soit homogène.
7. Ajouter 3 ml de RSB supplémentaires à la paroi du tube d'entrée du tube de centrifugeuse de 50 ml (volume total de 4 ml). Évitez d'introduire des bulles dans le mélange. Mélanger délicatement la suspension cellulaire en faisant doucement monter et descendre.
   REMARQUE: Dans le cas peu probable où le tuyauterie ordinaire est incapable de décomposer les amas cellulaires (définis en étant visibles ou en bloquant la pointe de la pipette), filtrez l'échantillon à travers une passoire cellulaire de 40 m pour enlever les amas. Ajouter 150 L de RSB à l'échantillon pour compenser la perte de volume du filtrage. Notez que cette méthode doit être utilisée avec parcimoniellement et seulement lorsque de gros amas sont observés.
8. Avant de passer à l'étape d'enrichissement, vérifiez que l'échantillon est exempt de bulles excessives et, le cas échéant, retirez les bulles et prenez soin de ne pas jeter tout échantillon. Si de minuscules bulles sont présentes, leur élimination n'est pas nécessaire.
9. Traiter l'échantillon sur l'appareil microfluidique en spirale.

4. Enrichissement des CTC du sang entier du patient avec le dispositif microfluidique de spirale

1. Chargez une nouvelle puce microfluidique spirale. Chargez deux tubes de centrifugeuse vides de 50 mL dans les ports d'entrée et de sortie.
2. Exécutez un prime en cliquant sur Prime sur l'appareil microfluidique en spirale (3 min). Retirez les tubes d'entrée et de sortie et chargez l'échantillon à traiter dans le port d'entrée.
3. Chargez un tube conique clair de 15 ml dans le port de sortie pour recueillir les CTC enrichis. Exécuter le programme 3 en cliquant sur Run et en sélectionnant le programme 3 (31 min).
4. Décharger le tube de sortie et la centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min (accélération : 9 ; décélération : 5). Avec une pipette sérologique de 5 ml, retirez l'arrêt de supernatant à la marque de 2 ml sur le tube conique de 15 ml. À l'occasion d'une micropipette, retirer l'arrêt du supernatant à 100 oL sur le tube conique de 15 ml. Traiter l'échantillon enrichi directement pour la coloration immunofluorescence.

5. Staining immunofluorescence

1. Énumérer sur une glissière chambrée avec une grille de type hémocytomètre le nombre de cellules par mL. Diluer l'échantillon enrichi avec une solution anticontraignante de 0,2 % (Tableau des matériaux) à une concentration atteignant 100 000 cellules/100 L par cytospin.
2. Humidifiez le contour de la chambre d'échantillon à l'aide de coton (Tableaudes matériaux) avec une solution anticontraignante de 50 l à 0,2 %. Placer un lacet en verre en polylysine dans la chambre d'échantillon et fermer.
3. Enrober une pointe d'une solution anticontraignante de 0,2 % en faisant monter et descendre 3 fois. Resuspendre l'échantillon enrichi et transférer la solution cellulaire dans la chambre de l'échantillon. Centrifugeuse avec centrifugeuse dédiée (Table des Matériaux) à 400 tr/min pour 4 min (accélération basse).
4. Placez un isolateur de silicium autour de la zone de dépôt. Laisser sécher le verre-glisser sous une armoire de sécurité microbiologique pendant 2 min.
5. Préparer la solution de fixation en diluant 1 ml de 16% de paraformaldéhyde (PFA) avec 3 ml de PBS stérile. Ajouter 100 L de solution de fixation (4 % de PFA) par échantillon et incuber à RT pendant 10 min. Enlevez la solution de fixation et effectuez trois lavages avec 200 L de PBS et incubez à RT chacun pendant 2 min.
   MISE EN GARDE: Utilisez pfA sous un coffret de sécurité chimique pour prévenir l'inhalation.
6. Préparer la solution de saturation en diluant le sérum bovin fœtal (FBS) à 5%, le récepteur Fc (FcR) bloquant le réactif à 5%, et l'albumine de sérum bovin (BSA) à 1% en PBS stérile (Tableaudes Matériaux). Ajouter 100 L de solution de saturation par échantillon et incuber pendant 30 min à RT. Supprimer la solution de saturation.
7. Ajouter 100 l de solution d'anticorps par échantillon (anticorps CD45 1/20; Anticorps PanCK 1/500; Anticorps PD-L1 1/200; Solution de saturation Qsp 100 l) (Tableau des Matériaux). Placer la glissière en verre en polylysine dans un plat Petri de 100 mm x 15 mm. Humidifiez un papier absorbant avec 2 ml d'eau stérile et fermez le plat Petri avec le couvercle. Placer à 4 oC pendant la nuit et protéger de la lumière.
8. Retirer le mélange d'anticorps et effectuer 3 lavages avec 200 L de PBS incuber chaque lavage pendant 2 min. Laisser sécher l'échantillon pendant 5 min et le protéger de la lumière. Placez 10 l de solution de montage (Tableaudes matériaux) dans la zone de dépôt et recouvrez-la d'un bordereau de microscope sans faire de bulle. Scellez la couverture avec du vernis à ongles.

6. Acquisition d'images immunofluorescentes avec microscope fluorescent droit et logiciel associé

1. Utilisez un microscope fluorescent droit avec une plate-forme motorisée X/Y. Utilisez un objectif 20x pour prendre des images de tiff 8 bits RGB dans quatre canaux correspondant à la teinture d'ADN (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), le colorant PanCK (isothiocyanate de fluorescéine [FITC]), le colorant PD-L1 (CY3) et le colorant CD45 (CY5). Allumez la lampe au mercure 15 min avant utilisation et adaptez le microscope et le logiciel associé à la pousse semi-automatisée.
2. Placez le toboggan en verre sur la plate-forme.
3. Dans le menu d'acquisition, définissez les quatre canaux et configurez le temps d'exposition (DAPI : 15 ms, FITC [PanCK] : 500 ms ; CY3 [PD-L1] : 800 ms; CY5 [CD45] : 1 000 ms). Définir les tuiles à la scan. Cliquez sur Tuiles. Dans l'expérience avancée, définir la zone à scanner.
4. Ajuster la mise au point sur l'écran. Cliquez sur Démarrer l'expérience.
5. Exporttisez les fichiers TIF de chaque canal et nommez spécifiquement le fichier d'image avec cette information : Sample-NumberofTilesRegion-dye-NumberOfSubtiles.tif (p. ex., Sample1-TR1-c1m01). Nom colorant comme suit: le canal DAPI est c1, le canal FITC est c2, le canal CY3 est c3, et le canal CY5 est c4.

7. Analyse d'images immunofluorescentes avec logiciel d'analyse d'images

1. Téléchargez et installez le logiciel d'analyse d'images gratuit à partir du site Web du Broad Institute. Accepter tous les défauts pendant l'installation. Ouvrez le logiciel d'analyse d'images et cliquez sur Fichier Pipeline à partir du fichier . Analyse 4channels-CTC.cppipe.
   REMARQUE: Le pipeline convertit les images couleur RGB en échelle grise, supprime les artefacts en lissant les images avec un filtre médian, identifie les noyaux et le cytoplasme, quantifie les intensités de fluorescence de chaque canal, et les exporte dans un fichier Excel.
2. Déposez les fichiers dans la liste de fichiers. Mettre à jour les métadonnées pour regrouper les fichiers par tuiles.
   REMARQUE: Toutes les instructions pour regrouper les images sont spécifiées dans le logiciel. Les fichiers nominaux sont apparus dans le module NamesAndTypes et les fichiers sont regroupés en fonction du nombre de la tuile et du canal par échantillon.
3. Cliquez sur Afficher les paramètres de sortie et spécifier une sortie par défaut correcte. Cliquez sur Analyser les images. Ouvrez le fichier de feuille de calcul correspondant aux paramètres d'intensité de mesure.

Résultats

La première condition préalable était d'obtenir des collections non contaminées (sans agent infectieux) de CTC pour la culture tissulaire et d'éviter les antécédents de FI générés. Le protocole de décontamination a permis le nettoyage de tous les tuyaux et pompes, et il a abouti à la collecte des CTC avec un bon taux de récupération sans contamination bactérienne. Les échantillons enrichis ont été comparés sans et avec le flux de travail de protocole de décontamination du dispositif microfluidique en ...

Discussion

Deux points majeurs ont été soulevés dans la présente étude, le premier en ce qui concerne la performance du flux de travail pour son transfert à des applications cliniques, et le second concernant la diminution de la subjectivité pour l'analyse des images de fluorescence obtenues.

Un flux de travail performant et optimisé pour l'énumération de la CCT a d'abord été déterminé à l'aide d'un analyse FI personnalisable après enrichissement cellulaire par l'intermédiaire d'un syst?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4 °C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4 °C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software