Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Riepilogo

La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).

Abstract

Le cellule tumorali circolanti (CTC) derivate dal tumore primario vengono versate nel flusso sanguigno o nel sistema linfatico. Queste cellule rare (1,10 cellule per mL di sangue) giustificano una prognosi infamabile e sono correlate con una sopravvivenza complessiva più breve in diversi tipi di cancro (ad esempio, seno, prostata e colorettale). Attualmente, il sistema di cattura CTC basato su perline magnetico anti-EpCAM è il test standard d'oro approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per enumerare i CTC nel flusso sanguigno. Questo test si basa sull'uso di perline magnetiche rivestite con marcatori anti-EpCAM, che colpiscono specificamente le cellule tumorali epiteliali. Molti studi hanno dimostrato che epCAM non è il marcatore ottimale per il rilevamento CTC. Infatti, i CTC sono una sottopopolazione eterogenea di cellule tumorali e sono in grado di subire una transizione epiteliale-mesenferica (EMT) associata alla proliferazione metastatica e all'invasione. Questi CTC sono in grado di ridurre l'espressione del marcatore epiteliale della superficie cellulare EpCAM, aumentando al contempo marcatori mesenchymici come la vimentina. Per affrontare questo ostacolo tecnico, sono stati sviluppati altri metodi di isolamento basati sulle proprietà fisiche dei CTC. Le tecnologie microfluidiche consentono un approccio privo di etichette all'arricchimento del CTC da campioni di sangue intero. La tecnologia microfluidica a spirale utilizza le forze di trascinamento inerziali e Decano con flusso continuo in canali curvi generati all'interno di un chip microfluidico a spirale. Le cellule sono separate in base alle differenze di dimensioni e plasticità tra le cellule del sangue normali e le cellule tumorali. Questo protocollo descrive in dettaglio i diversi passaggi per caratterizzare l'espressione programmata death-ligand 1 (PD-L1) dei CTC, combinando un dispositivo microfluidico a spirale con set di marcatori immunofluorescenza (IF) personalizzabili.

Introduzione

I TL (TL) specifici dell'antigene tumorale svolgono un ruolo cruciale nella risposta ai tumori attraverso un processo noto come "sorveglianza immunitaria" del cancro. Le loro funzioni antitumorali sono potenziate da anticorpi di blocco del checkpoint immunitario come gli inibitori ctLA-4 e gli inibitori PD-1/PD-L1. Nel cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), le terapie anti-PD-1/PD-L1 si traducono in tassi di risposta che vanno dallo 0%-17% nei pazienti con tumori PD-L1-negativi e 36%-100% in quelli che esprimono PD-L1. Le risposte robuste al blocco PD-1/PD-L1 osservate nel melanoma e nel NSCLC sono mostrate da prove di un miglioramento del tasso di risposta globale (RR), dei benefici clinici duraturi e della sopravvivenza senza progressione (PFS). Attualmente, i trattamenti anti-PD1 sono lo standard di cura nel trattamento NSCLC di seconda linea con nivolumab indipendentemente dall'espressione PD-L1 e con pembrolizumab in pazienti che esprimono PD-L1 1%. Nel trattamento di prima linea, standard di cura è pembrolizumab da solo in pazienti con NSCLC che esprimono PD-L1 -50% e può essere potenzialmente migliorato con la chemioterapia (platin e doublet drug a seconda del sottotipo istologico)^1,2.

Tuttavia, un tale approccio alla gestione del paziente è discutibile³, poiché l'espressione PD-L1 nelle cellule tumorali per immunohistochimica (IHC) probabilmente non è il biomarcatore compagno più ideale. Altri come il carico di mutazione tumorale⁴ (TMB), l'instabilità dei microsatelliti (MSI) e/o il microbiota sono probabilmente interessanti in questo ambiente da soli o in combinazione. NSCLC sono noti per essere tumori eterogenei, sia spazialmente (da un sito tumorale a un altro) o temporalmente (dalla diagnosi alla ricorrenza). I pazienti con NSCLC sono solitamente fragili e le biopsie iterative dei tessuti possono essere un problema. Infatti, il tasso di ri-biopsia alla prima progressione varia dal 46%-84% a seconda della serie, e la ri-biopsia di successo (che significa con analisi molecolare istologica e completa) varia dal 33%-75%. Ciò significa che il 25%-67% dei pazienti non può ricevere un'analisi di ribio completa durante la prima progressione^5,6,7,8.

L'avvento delle "biopsie liquide" ha quindi generato un notevole entusiasmo in questo particolare contesto, in quanto consente una rivalutazione cruciale delle alterazioni molecolari durante la progressione della malattia esaminando il DNA libero circolante (cfDNA) derivato dalla circolazione cellule tumorali (CTC). Queste cellule vive vengono rilasciate dal tumore nel flusso sanguigno, dove circolano liberamente. Sebbene non venga utilizzata regolarmente, l'analisi dei CTC sembra essere molto promettente nel caso della caratterizzazione molecolare e fenotipica, della prognosi e del significato predittivo nel cancro del polmone(tramite DNAseq, RNAseq, miRNA e analisi delle proteine). Infatti, le CTC probabilmente ospitano caratteristiche fenotipiche della malattia attiva piuttosto che i marcatori iniziali (rilevati sulle biopsie dei tessuti alla diagnosi). Inoltre, i CTC bypassano il problema dell'eterogeneità spaziale del tessuto tumorale, che può essere un problema cruciale nelle piccole biopsie. Di conseguenza, l'espressione PD-L1 sui CTC può potenzialmente far luce sulle discrepanze derivate dal suo uso come biomarcatore predittivo utilizzando il tessuto tumorale.

Recentemente, l'espressione PD-L1 è stata testata nei CTC di NSCLC. Quasi tutti i pazienti testati⁹ erano PD-L1 positivo, complicando l'interpretazione del risultato e il suo uso clinico. Complessivamente, sono stati rilevati CTC PD-L1 positivi nel 69,4% dei campioni da una media di 4,5 cellule/mL¹⁰. Dopo l'inizio della radioterapia, la percentuale di CTC PD-L1-positivi è aumentata in modo significativo, indicando l'upregolazione dell'espressione PD-L1 in risposta alle radiazioni¹¹. Di conseguenza, l'analisi dei CTC PD-L1 può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti dinamici del tumore e della risposta immunitaria, che possono riflettere la risposta alla chemioterapia, alle radiazioni e ai probabili trattamenti di immunoterapia (IT).

Ad oggi, l'isolamento CTCs e la caratterizzazione PD-L1 si basano su vari metodi come l'acquisizione CTC basatasu perline magnetiche anti-EpCAM, l'analisi basata sull'arricchimento e i saggi di acquisizione 12^,13 CTC basati sulle dimensioni. Tuttavia, le CTC sono state rilevate solo nel 45%-65% dei pazienti con NSCLC metastatico, limitando così la loro capacità di fornire informazioni per più della metà dei pazienti con NSCLC metastatico. Inoltre, il numero di CTC era basso nella maggior parte di questi studi utilizzando l'approccio basato sulle dimensioni¹⁰. Inoltre, questo metodo ha portato a discrepanze come la rilevazione di cellule CD45(-)/DAPI() con "modelli citomorfologici di malignità" nel flusso sanguigno di donatori sani. Queste preoccupazioni evidenziano la necessità di un metodo altamente sensibile di raccolta CTC associato con immuno-fenotyping di cellule atipiche CD45 (-) da sangue intero sano utilizzando ulteriori biomarcatori del cancro (cioè, TTF1, Vimentin, EpCAM, e CD44) in NSCLC.

Di conseguenza, abbiamo valutato un dispositivo microfluidico a spirale che utilizza forze di trascinamento inerziali e Decano per separare le cellule in base alle dimensioni e alla plasticità attraverso un chip microfluidico. La formazione del vortice Dean scorre presente nel chip microfluidico si traduce in CTC più grandi situati lungo la parete interna e cellule immunitarie più piccole lungo la parete esterna del chip. Il processo di arricchimento si completa sifonando le cellule più grandi nella presa di raccolta come frazione CTC arricchita. Questo metodo è particolarmente sensibile e specifico (rilevamento di circa 1 CTC/mL di sangue intero)¹⁴ e può essere associato ad analisi di immunofluorescenza personalizzate (IF). Questi strumenti consentiranno di stabilire una soglia positiva per l'interpretazione clinica. Viene quindi descritto un flusso di lavoro che consente ai biologi di isolare e i CTC immunofenotipi con un alto tasso di recupero e specificità. Il protocollo descrive l'uso ottimale del dispositivo microfluidico a spirale per raccogliere CTC, i saggi IF ottimizzati che possono essere personalizzati in base al tipo di cancro e l'uso di software open source gratuito per la misurazione e l'analisi delle immagini cellulari per eseguire un numerazione delle cellule in base alla colorazione fluorescente. Inoltre, il multiplexing al microscopio può essere effettuato a seconda del numero di filtri/marcatori fluorescenti disponibili.

Protocollo

I campioni sono stati raccolti prospetticamente nell'ambito della coorte CIRCAN ("CIRculating CANcer") con sede presso l'Ospedale Universitario di Lione in seguito al consenso scritto del paziente. Questo studio è stato integrato nella coorte CIRCAN_ALL. Lo studio CIRCAN_ALL è stato riconosciuto come non interventistico dal CPP South-East IV datato 04/11/2015 con il riferimento L15-188. Una versione modificata è stata riconosciuta come non interventista il 20/09/2016 sotto il riferimento L16-160. Lo studio CIRCAN_ALL è stato dichiarato al corrispondente IT e alla libertà dell'Hospice civils de Lyon il 01/12/2015, con il riferimento 15-131. La raccolta del sangue è stata eseguita quando i medici hanno osservato la prima indicazione di progressione del tumore.

NOT: Utilizzare tutti i reagenti e i materiali descritti nella Tabella dei Materiali con le rispettive condizioni di conservazione per la preparazione pre-analitica del campione e il test dell'immunofluorescenza. La sostituzione dei reagenti e/o la modifica delle condizioni di archiviazione potrebbe comportare prestazioni di analisi non ottimali.

1. Decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale

NOT: La decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale è un requisito per rimuovere tutto lo sfondo di immunofluorescenza generato dalla contaminazione batterica, esplorare la citomorfologia dei CTC ed essere in grado di differenziarli dalle normali cellule immunitarie. Il protocollo è ottimizzato per i campioni di sangue raccolti in tubi K₂EDTA entro 6 h dopo il campionamento del sangue e arricchito utilizzando il dispositivo microfluidico a spirale in condizioni pulite. L'utilizzo di questo test per altri tipi di campioni (altri fluidi biologici) può richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Questo protocollo di decontaminazione deve essere eseguito una volta alla settimana.

1. Preparazione dei reagenti
   1. Preparazione del buffer diluente
      1. Sterilizzare 20 mL di reagente additivo diluente utilizzando un filtro di siringa 0,22 m e aggiungere direttamente a 1 L di 1x fosfato buffer salina (PBS) di grado ultra-puro (Tabella dei materiali).
   2. Sterilizzazione dei reagenti e della paglia di ingresso
      1. Sterilizzare il buffer di lisi RBC e il buffer di sospensione (RSB; Tabella dei materiali) utilizzando un filtro di siringa da 0,22 m e stoccate in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 mL per ogni soluzione.
      2. Sterilizzare la paglia di ingresso incubando a temperatura ambiente (RT) per 1 h nel reagente di pulizia per tutti gli usi (Tabella dei materiali). Trasferire la cannuccia all'addetto alla pulizia a base di candeggina (Tabella dei materiali) e incubare a RT per 1 ora.
      3. Sciacquare la cannuccia di ingresso due volte con PBS sterile per 1 h ciascuno e conservare la cannuccia di ingresso sterilizzata in un sacchetto chirurgicamente sterile (Tabella dei materiali).
2. Decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale
   1. Disinfezione con il reagente di pulizia per tutti gli scopi
      1. Scollegare il tappo della bottiglia diluente dalla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale svitando la vite marrone. Sotto un armadietto di sicurezza microbiologico, trasferire fino a 250 mL di reagente di pulizia per tutti gli scopi (Tabella dei materiali) in una nuova bottiglia vuota.
      2. Svitare il tappo di bottiglia diluente e la paglia alla bottiglia di 250 mL di reagente di pulizia per tutti gli usi sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Attaccare questa bottiglia alla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale avvitando indietro la vite marrone.
      3. Trasferire fino a 100 mL di candeggina (1% di concentrazione finale; Tabella dei materiali) al contenitore dei rifiuti fornito nel kit di esecuzione (Figura 1A).
      4. Caricare una nuova cannuccia di ingresso sterile sul dispositivo microfluidico a spirale (Tabella dei materiali) nella porta di ingresso. Caricare un nuovo tubo di centrifuga di 50 mL nella porta di ingresso. Caricare un nuovo tubo di centrifuga di 50 mL nella porta di uscita.
      5. Procedere per innescare il dispositivo microfluidico a spirale facendo clic su Prime sul dispositivo microfluidico a spirale (3 min). Rimuovere il tubo di ingresso dopo il completamento del primo.
      6. Trasferire fino a 15 mL di reagente per la pulizia per tutti gli scopi in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL con una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico e collegare il tubo alla porta di ingresso del dispositivo microfluidico a spirale.
      7. Prima di iniziare la corsa, verificare che la soluzione sia priva di bolle eccessive. Se sono presenti bolle, rimuoverle per aspirazione lenta con una pipetta.
      8. Caricare un chip microfluidico di decontaminazione nel dispositivo microfluidico a spirale. Eseguire un programma 3 sul dispositivo microfluidico a spirale facendo clic su Esegui e selezionando il programma 3 (31 min).
         NOTA: il programma 3 del dispositivo microfluidico a spirale consente un rapido arricchimento dei CTC in 31 min.
      9. Continuare con la fase di pulizia del dispositivo microfluidico a spirale utilizzando il volume rimanente del reagente di pulizia per tutti gli scopi nel tubo di ingresso.
      10. Eliminare il tubo di ingresso dopo il completamento della fase di pulizia, lasciando dietro di sé la cannuccia di ingresso.
   2. Decontaminazione con l'agente di pulizia a base di candeggina
      1. Scollegare il tappo della bottiglia di riagiscamento per la pulizia per tutti gli usi dalla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale svitando la vite marrone. Sotto un armadietto di sicurezza microbiologico, trasferire fino a 250 mL di cleaning agent a base di candeggina (Tabella dei materiali) in una nuova bottiglia vuota ( Figura1A).
      2. Allestire il tappo della bottiglia di risanamento per la pulizia per tutti gli usi e la paglia alla bottiglia contenente l'agente di pulizia a base di candeggina sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Attaccare questa bottiglia alla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale avvitando indietro la vite marrone.
      3. Trasferire fino a 15 mL di saldatore a base di candeggina in un nuovo tubo di ingresso centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Caricare la posizione di ingresso del tubo di centrifugatura da 50 mL. Caricare un tubo vuoto nella posizione di uscita.
      4. Prima di elaborare la corsa, verificare che il campione sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle aspirandole lentamente con una pipetta.
      5. Eseguire il programma 3 facendo clic su Esegui e selezionando il programma 3 (31 min). Dopo la corsa, procedere direttamente alla fase di pulizia utilizzando il volume rimanente dell'agente di pulizia a base di candeggina nel tubo di ingresso.
      6. Eliminare i tubi di ingresso e di uscita.
   3. Risciacquare il dispositivo microfluidico a spirale.
      1. Scollegare il tappo della bottiglia dell'agente di pulizia a candeggina dalla porta diluente del dispositivo microfluidico a spirale svitando la vite marrone. Sotto un armadietto di sicurezza microbiologico, trasferire la paglia dalla bottiglia contenente l'agente di pulizia a base di candeggina alla nuova bottiglia contenente il tampone diluente. Svitare la bottiglia al dispositivo microfluidico a spirale.
      2. Trasferire fino a 15 mL di acqua sterilizzata (Tabella dei materiali) in un nuovo tubo di ingresso centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Caricare la posizione di ingresso del tubo di centrifugatura da 50 mL. Caricare un tubo vuoto nella posizione di uscita.
      3. Prima di elaborare la corsa, verificare che il campione sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle aspirandole lentamente con una pipetta.
      4. Eseguire il programma 3 facendo clic su Esegui e selezionando il programma 3 (31 min). Dopo la corsa, procedere direttamente alla fase di pulizia utilizzando il volume rimanente di acqua sterilizzata nel tubo di ingresso.
      5. Eliminare i tubi di ingresso e di uscita.

2. Manutenzione per mantenere la spirale microfluidica dispositivo batteri-free

NOT: La manutenzione di routine deve essere eseguita alla fine della giornata durante l'ultima fase di pulizia.

1. Trasferire fino a 7 mL di saldatore a base di candeggina nel nuovo tubo centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico. Al vite il tubo di pulizia a base di candeggina nella porta di ingresso del dispositivo microfluidico a spirale.
2. Prima di elaborare la corsa pulita, verificare che il campione di ingresso sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle aspirandole lentamente con una pipetta.
3. Eseguire il pulito sul dispositivo microfluidico a spirale.

3. Arricchimento pre-analitico del CTC da campioni di sangue del paziente

1. Raccogliere 7,5 mL di sangue nel tubo K₂EDTA e tenere sotto agitazione delicata per evitare la sedimentazione cellulare e la coagulazione. Processo entro 6 ore.
   NOT: Se il sangue viene raccolto in un tubo di raccolta del sangue del DNA privo di cellule contenente conservanti, conservare a 4 gradi centigradi fino all'elaborazione. Assicurarsi che il campione di sangue, il buffer di lisi RBC e il buffer RBS siano in RT prima di procedere con la fase di arricchimento.
2. Trasferire fino a 7,5 mL di sangue intero in un nuovo tubo di ingresso per centrifugare da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sotto un armadietto di sicurezza microbiologico.
3. Centrifuga a 1.600 x g per 10 min a RT. Raccogliere la frazione di plasma con una pipetta senza disturbare il cappotto buffy. Sostituire la frazione plasma con l'aggiunta di volume direttamente equivalente di PBS fino a 7,5 mL.
4. Aggiungere delicatamente il buffer di lisi RBC (Tabella dei materiali) al campione di sangue a un volume finale di 30 mL (per un tubo K₂EDTA) o 37,5 mL (per un tubo di raccolta del sangue di DNA privo di cellule). Invertire delicatamente il tubo di raccolta del sangue 10x e incubare per 10 min a RT.
   NOT: Il campione di sangue diventa rosso più scuro durante la lisi RBC. Se non si osserva alcun cambiamento (dal rosso scuro e opaco) dopo 10 min, invertire delicatamente il tubo 3x e lasciare riposare per altri 5 min massimo. Non lasciare il campione nel buffer di lisi RBC per più di 15 min perché può compromettere la qualità del campione e le prestazioni di analisi.
5. Centrifugare il campione di sangue lisminato a 500 x g per 10 min a RT, con freni centrifugati (o velocità di decelerazione più alta). Utilizzare una pipetta Pasteur o una pipetta sierologica per rimuovere delicatamente il supernatante fino a quando il volume non raggiunge il segno di 4-5 mL. Quindi, utilizzare punte micropipette filtrate per rimuovere il rimanente super-natante.
6. Utilizzando una micropipetta P1000 con una punta filtrata, aggiungere 1,0 mL di RSB alla parete del tubo di ingresso della centrifuga da 50 mL. Per evitare di introdurre bolle nel mix, risospendere il pellet cellulare pipetting su e giù fino a quando il campione è omogeneo.
7. Aggiungere altri 3 mL di RSB alla parete del tubo di ingresso della centrifuga 50 mL (volume totale 4 mL). Evitare di introdurre bolle nel mix. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare pipettando su e giù.
   NOT: Nell'improbabile caso in cui la pipettatura regolare non sia in grado di abbattere i grumi delle cellule (definiti dalla visibilità o dal blocco della punta della pipetta), filtrare il campione attraverso un colino a 40 celle per rimuovere eventuali grumi. Aggiungere 150 L di RSB al campione per compensare la perdita di volume dovuta al filtraggio. Si noti che questo metodo deve essere utilizzato con parsimonia e solo quando si osservano grumi di grandi dimensioni.
8. Prima di procedere alla fase di arricchimento, verificare che il campione sia privo di bolle eccessive e, se presenti, rimuovere le bolle e fare attenzione a non scartare alcun campione. Se sono presenti piccole bolle, la loro rimozione non è necessaria.
9. Elaborare il campione sul dispositivo microfluidico a spirale.

4. Arricchimento dei CTC dal sangue intero del paziente con il dispositivo microfluidico a spirale

1. Caricare un nuovo chip microfluidico a spirale. Caricare due tubi di centrifuga vuoti da 50 mL nelle porte di ingresso e di uscita.
2. Eseguire un numero primo facendo clic su Prime sul dispositivo microfluidico a spirale (3 min). Rimuovere i tubi di ingresso e di uscita e caricare il campione da elaborare nella porta di ingresso.
3. Caricare un tubo conico da 15 mL chiaro nella porta di uscita per raccogliere CTC arricchiti.
4. Scaricare il tubo di uscita e centrifugare a 500 x g per 10 min (accelerazione: 9; decelerazione: 5). Con una pipetta sierologica da 5 mL, rimuovere l'arresto supernatale al punto 2 mL sul tubo conico 15 mL. Con una micropipetta, rimuovere il supernatante fermandosi a 100. Elaborare direttamente il campione arricchito per l'colorazione dell'immunofluorescenza.

5. Immunofluorescenza Colorazione

1. Enumerare su una diapositiva a camera con una griglia di tipo emocitometro il numero di celle per mL. Diluire il campione arricchito con una soluzione anti-rilegatura dello 0,2% (Tabella dei materiali) a una concentrazione che raggiunge le 100.000 cellule/100 l per citospin.
2. Inumidire il contorno della camera campione utilizzando cotone (Table of Materials) con una soluzione anti-legante di 50 -L dello 0,2%. Mettere uno scivolo di vetro di polisina nella camera campione e chiudere.
3. Coprire una punta con una soluzione anti-legante dello 0,2% pipettando su e giù 3x. Risospendere il campione arricchito e trasferire la soluzione cellulare nella camera campione. Centrifuga con una centrifuga dedicata (Tabella dei materiali) a 400 rpm per 4 min (accelerazione bassa).
4. Posizionare un isolatore di silicio intorno all'area di deposizione. Lasciare asciugare il vetrine di vetro sotto un armadietto di sicurezza microbiologico per 2 min.
5. Preparare la soluzione di fissazione diluindo 1 mL di 16% paraformaldeide (PFA) con 3 mL di PBS sterile. Aggiungere 100 l di soluzione di fissazione (4% PFA) per campione e incubare a RT per 10 min. Rimuovere la soluzione di fissaggio ed eseguire tre lavature con 200 l di PBS e incubare a RT ciascuno per 2 min.
   ATTENZIONE: Utilizzare pFA sotto un armadietto di sicurezza chimica per prevenire l'inalazione.
6. Preparare la soluzione di saturazione diluindo il siero bovino fetale (FBS) al 5%, il reagente di blocco del recettore Fc (FcR) al 5% e l'albumina del siero bovino (BSA) all'1% in PBS sterile (Tabella dei materiali). Aggiungere 100 l di soluzione di saturazione per campione e incubare per 30 min a RT. Rimuovere la soluzione di saturazione.
7. Aggiungere 100 l di soluzione anticorpale per campione (anticorpo CD45 1/20; Anticorpo PanCK 1/500; PD-L1 anticorpo 1/200; Soluzione di saturazione Qsp 100 - L) (Tabella dei materiali). Collocare la vetrata di polisina in una parabola Petri da 100 mm x 15 mm. Inumidire una carta assorbente con 2 mL di acqua sterile e chiudere la piastra Petri con il coperchio. Collocare a 4 gradi centigradi e proteggere dalla luce.
8. Rimuovere la miscela di anticorpi ed eseguire 3 lavaggi con 200 l di PBS incubando ogni lavaggio per 2 min. Lasciare asciugare il campione per 5 min e proteggerlo dalla luce. Collocare 10 - L di soluzione di montaggio (Table of Materials) nell'area di deposizione e coprire con un coperchio del microscopio senza fare una bolla. Sigillare la coverslip con smalto.

6. Acquisizione di immagini immunofluorescenti con microscopio fluorescente lineare e software associato

1. Utilizzare un microscopio fluorescente dritto con una piattaforma motorizzata X/Y. Utilizzare un obiettivo di 20 volte per scattare immagini tiff RGB a 8 bit in quattro canali corrispondenti a coloranti DNA (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), tintura PanCK (fluorescein isothiocyanate [FITC]), tintura PD-L1 (CY3) e colorante CD45 (CY5). Accendere la lampada al mercurio 15 min prima dell'uso e adattare il microscopio e il software associato alle riprese semi-automate.
2. Posizionare lo scivolo in vetro sulla piattaforma.
3. Nel menu acquisizione, definire i quattro canali e impostare il tempo di esposizione (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1.000 ms). Definire le tessere da scansionare. Fare clic su Riquadri. In Esperimento avanzato, definire l'area da scansionare.
4. Regolare la messa a fuoco sullo schermo. Fare clic su Avvia esperimento.
5. Esportare i file TIF di ogni canale e denominare in modo specifico il file di immagine con queste informazioni: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (ad esempio, Sample1_TR1_c1m01). Nome dye come segue: il canale DAPI è c1, canale FITC è c2, canale CY3 è c3 e canale CY5 è c4.

7. Analisi delle immagini immunofluorescenti con il software di analisi delle immagini

1. Scaricare e installare il software di analisi delle immagini gratuito dal sito Web Broad Institute. Accettare tutte le impostazioni predefinite durante l'installazione. Aprire il software di analisi delle immagini e fare clic su File Pipeline da file Analysis_4channels_CTC.cppipe.
   NOT: La pipeline converte le immagini a colori RGB in scala di grigi, rimuove gli artefatti levigando le immagini con un filtro mediano, identifica i nuclei e il citoplasma, quantifica le intensità di fluorescenza di ogni canale e le esporta in un file Excel.
2. Eliminare i file nell'elenco dei file. Aggiornare i metadati per raggruppare i file in base ai riquadri.
   NOT: Tutte le istruzioni per raggruppare le immagini sono specificate nel software. I file dei nomi visualizzati nel modulo NamesAndTypes e i file vengono raggruppati in base al numero di riquadri e canali per esempi.
3. Fare clic su Visualizza impostazioni output e specificare un output predefinito corretto. Fare clic su Analizza immagini. Aprire il file del foglio di calcolo corrispondente ai parametri measure_intensity.

Risultati

Il primo prerequisito era quello di ottenere raccolte incontaminate (senza agenti infettive) di CTC per la coltura dei tessuti ed evitare il background IF generato. Il protocollo di decontaminazione ha permesso la pulizia di tutti i tubi e pompe, e ha portato alla raccolta di CTC con un buon tasso di recupero senza contaminazione batterica. I campioni arricchiti sono stati confrontati senza e con il flusso di lavoro del protocollo di decontaminazione del dispositivo microfluidico a spirale. Per convalidare il protocollo ...

Discussione

Nel presente studio sono stati sollevati due punti principali, il primo per quanto riguarda l'esecuzione del flusso di lavoro per il suo trasferimento ad applicazioni cliniche e il secondo relativo alla diminuzione della soggettività per l'analisi delle immagini a fluorescenza ottenute.

Un flusso di lavoro performante e ottimizzato per l'enumerazione CTC è stato inizialmente determinato utilizzando un saggio IF personalizzabile dopo l'arricchimento delle celle tramite un sistema microfluidic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Ozyme	BLE 422801	Storage conditions: +4 °C
BD Facs Clean – 5 L	BD Biosciences	340345	Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL	Biolidics	CBB-F016012	Bleach. Storage conditions: Room temperature
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5%	Sigma	A8412	Storage conditions: +4 °C
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647	BioLegend	BLE304020	Storage conditions: +4 °C
CellProfiler Software	Broad Institute		Image Analysis Software
Centrifuge device	Hettich	4706	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge tube 50 mL	Corning	430-829	Storage conditions: Room temperature
Centrifuge Tube 15 mL	Biolidics	CBB-F001004-25	Storage conditions: Room temperature
ClearCell FX-1 System	Biolidics	CBB-F011002	Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L	Beckman Coulter	8448222	All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature
CTChip FR1S	Biolidics	CBB-FR001002	Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature
Cytospin 4	ThermoFisher	A78300003	Storage conditions: Room temperature
Diluent Additive Reagent – 20 mL	Biolidics	CBB-F016009	Storage conditions: +4 °C
EZ Cytofunnels	ThermoFisher	A78710003	Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature
FcR blocking Agent	Miltenyi Biotec	130-059-901	Storage conditions: +4 °C
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco	10270-106	Storage conditions: +4 °C
Fluoromount	Sigma	F4680	Mounting solution. Storage conditions: Room temperature
Fungizone - 50 mg	Bristol-Myers-Squibb	90129TB29	Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C
FX1 Input Straw with lock cap	Biolidics	CBB-F013005	Straw. Storage conditions: Room temperature
KovaSlide	Dutscher	50126	Chambered slide. Storage conditions: Room temperature
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488	ThermoFisher	53-9003-80	Storage conditions: +4 °C
Paraformaldehyde 16%	ThermoFisher	11490570	Fixation solution. Storage conditions: +4 °C
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin	BioLegend	BLE329706	Storage conditions: +4 °C
Petri Dish	Dutscher	632180	Storage conditions: Room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Ozyme	BE17-512F	Storage conditions: +4 °C
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L	1st Base Laboratory	BUF-2040-1X1L	Storage conditions: Room temperature
Pluronic F-68 10%	Gibco	24040-032	Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature
Polylysine slides	ThermoFisher	J2800AMNZ	Storage conditions: Room temperature
Polypropylene Conical Tube 50 mL	Falcon	352098	Storage conditions: Room temperature
RBC Lysis Buffer – 100 mL	G Biosciences	786-649	Storage conditions: +4 °C
RBC Lysis Buffer – 250 mL	G Biosciences	786-650	Storage conditions: +4 °C
Resuspension Buffer (RSB)	Biolidics	CBB-F016003	Storage conditions: +4 °C
Shandon Cytopsin4 centrifuge	ThermoFisher	A78300003	Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature
Silicon Isolator	Grace bio-Labs	664270	Storage conditions: Room temperature
Sterile Deionized Water – 100 mL	1st Base Laboratory	CUS-4100-100ml	Storage conditions: Room temperature
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1	Zeiss		Storage conditions: Room temperature
Surgical Sterile Bag	SPS Laboratoires	98ULT01240	Storage conditions: Room temperature
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile	BD Biosciences	300296	Storage conditions: Room temperature
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile	ClearLine	51732	Storage conditions: Room temperature
Zen lite 2.3 Lite Software	Zeiss		Microscope associated software