Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas

Resumo

Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.

Resumo

Os nanocápsulas do liposome foram aplicados para muitas finalidades nas indústrias farmacêuticas, cosméticas, e do alimento. Os atributos dos lipossomas incluem sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-imunogenicidade, não-toxicidade, e capacidade de aprisionação de compostos hidrófilos e hidrofóbicos. A hidratação clássica de películas lipídicas finas em um solvente orgânico é aplicada nisto como uma técnica para encapsular a Tarina, uma lectina vegetal, em nanoliposomas. O tamanho de nanoliposome, a estabilidade, a eficiência do aprisionamento, e a caracterização morfológica são descritos em detalhe. Os nanolipossomas são preparados com 1,2-dioleoilo-SN-glicerol-3-Fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[amino (polietileno glicol)-2000] (sal de amônio; DSPE-MPEG 2000), e cholesterylhemisuccinate (CHEMS) como os constituintes principais. Os lipídios são primeiro dissolvidos em clorofórmio para obter um filme lipídico fino que é subsequentemente rehidratado em solução de sulfato de amônio contendo a proteína a ser aprisionada e incubadas durante a noite. Em seguida, técnicas de sonicação e extrusão são aplicadas para gerar vesículas unilamelares nanodimensionadas. O índice do tamanho e do polidispersão dos nanovesicles é determinado pelo espalhamento claro dinâmico, quando a morfologia do nanovesicle for avaliada pela microscopia de elétron de varredura. A eficiência de aprisionamento é determinada pela proporção da quantidade de proteína não encapsulada à quantidade original de proteína inicialmente carregada. Os lipossomas homogêneos são obtidos com um tamanho médio de 155 nm e valor de índice de polidispersidade de 0,168. Uma eficiência elevada do armadilha de 83% é conseguida.

Introdução

O número de estudos que investigam sistemas eficientes de entrega de medicamentos aumentou nos últimos anos. Entretanto, as limitações tais como o afastamento rápido, a biodistribuição pobre, e a solubilidade no pH fisiológico e a captação celular insuficiente ainda precisam de ser ultrapassada. O uso de nanosistemas surgiu como recente progresso na terapêutica oncológica, aplicada para aumentar a concentração intracelular de drogas dentro de células cancerosas, minimizando a toxicidade em células saudáveis. Além disso, as nanopartículas obtidas a partir de uma gama diferente de materiais (ou seja, polímeros, dendrímeros, lipossomas, vírus, nanotubos de carbono e metais como óxido de ferro e ouro) estão atualmente sendo aplicados para aumentar os efeitos anticâncer e reduzir o sistêmicos toxicidade¹. Os nanocápsulas do liposome em particular foram aplicados para muitas finalidades nas indústrias farmacêuticas, cosméticas, e do alimento. Nos últimos anos, vários produtos nutracêuticos, como vitaminas, enzimas e extratos de ervas, foram formulados usando a tecnologia lipossomas².

Os lipossomas são vesículas esféricas constituídas por um ou mais bicamadas lipídico concêntrico espontaneamente formados pela dispersão de fosfolipídios em meios aquosos^3,4. As cabeças polares dos fosfolipídeos estão localizadas nas superfícies externa e interna das membranas, em contato com o ambiente aquoso. Em contraste, as cadeias de ácidos graxos formam o núcleo hidrofóbico das membranas e são protegidas da água⁵. Alguns atributos de lipossomas que os tornam atraentes sistemas de entrega de medicamentos incluem a sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-imunogenicidade, não-toxicidade, e capacidade de aprisionação de compostos hidrofílicos e hidrofóbicos⁶.

Os lipossomas podem ser preparados usando vários processos de etapas, tais como agitação, sonicação, extrusão, liofilização, congelamento, e thawing. Os métodos clássicos incluem evaporação de fase reversa, injeção de solvente e diálise em detergente. O método mais aplicado é a hidratação fina do filme lipídico, também conhecido como método de Bangham, que é utilizado para a obtenção de formas vesicular-lipídicas^7,8,9,10,11. O lamellarity (o número de bilayers do fosfolipídeo) e o tamanho de partícula são os parâmetros clássicos usados para caracterizar lipossomas como 1) vesículas unilamelares (ULVs), formados por um BICAMADA original do fosfolipídeo e variando no tamanho como segue: i) unilamelares pequeno vesículas (SUVs, ~ 0,02-0,20 μm), II) grandes vesículas unilamelares (LUVs, ~ 0,2-1,0 μm) e III) vesículas unilamelares gigantes (GUVs, > 1 μm); ou 2) vesículas multilamelares (mlvs, > 0,1 μm)^3,12. O tamanho da vesícula é um parâmetro importante quando se considera para uso terapêutico, como no tratamento do câncer, em que os tamanhos de < 200 nm são ideais para permitir que nanovesicles cruzem a barreira endotelial e alcancem os tecidos tumorais⁴.

Neste documento, o procedimento de encapsulamento após a hidratação clássica de uma técnica fina de filme lipídico⁷ foi descrito utilizando-se Tarin, uma lectina vegetal caracterizada como proteína globular hidrofílica^13,14,15 . Vesículas nanodimensionadas são produzidas pela inclusão de sonicação e etapas de extrusão na técnica principal, resultando em nanovesicículos lipossomal estáveis com alta eficiência de aprisionamento¹⁶.

Protocolo

1. preparação de nanocápsulas lipossomal Tarin¹⁶

Nota: todas as preparações devem ser preparadas em triplicado, a fim de obter um volume maior (7 mL) e permitir que a amostra a ser centrifugada em um ultracentlee (ver detalhes abaixo).

1. Pesar os componentes do lipossomas usando um contrapeso analítico, como mostrado na tabela 1.
2. Dissolva os componentes lipídicos em clorofórmio usando um balão volumétrico de 250 mL que se encaixa em um evaporador rotativo para evitar a perda de material.
3. Mexa a mistura em 150 rpm por 15 min.
4. Retire o clorofórmio utilizando um evaporador rotativo nas seguintes condições:
   1. Ajuste a boca volumétrica do balão à posição padrão (25 °) para a eficiência óptima, quando em contacto com a água do banho de aquecimento.
      Nota: o braço do equipamento deve ser inclinado a 25 ° para manter o contacto entre o balão volumétrico e o banho de água, sem afectar a eficiência de evaporação ou danificar a amostra. A posição padrão pode variar de acordo com a marca do equipamento.
   2. Ajuste a temperatura do condensador a um mínimo de 3 ° c.
   3. Ajuste a temperatura do banho de aquecimento a 40 ± 1 ° c.
   4. Defina a rotação para 120 rpm.
   5. Ajuste o vácuo para 207 mbar e ponto de ebulição a 20 ° c.
   6. Após ~ 25 min, retire o balão e descarte o solvente evaporado, permanecendo no condensador, apropriadamente.
      Nota: uma película fina e opaca, consistindo nos componentes do lipossomas, é dada forma nesta etapa e pode facilmente ser visualizada. O solvente evaporado remanescente no condensador deve ser armazenado em recipientes de descarte (clorados) a serem manipulados por uma empresa especializada para descarte apropriado.
5. Hidratar o filme lipídico para atingir uma concentração lipídica de 0, 1 M em 0,3 M solução de sulfato de amônio (pH = 7,4) contendo Tarina em 1 mg/mL para um volume final de 10 mL.
   1. Mexa a mistura por 40 min e incubar durante a noite a 4 ° c.
      Nota: esta etapa pode ser considerada um ponto de parada. A incubação durante a noite não é obrigatória.
6. Após a incubação, proceda a suspensão por 1 min a 25 ° c (temperatura ambiente; RT) para reduzir o tamanho da vesícula e evitar a agregação.
   Nota: a redução de tamanho foi realizada em um sonicador ultra-sônico as seguintes condições: 130 W e 40 kHz.
7. Realize uma extrusão de 12 ciclos através de uma membrana de poros de policarbonato de 0,2 μm.
   Nota: antes do processo de extrusão, teste o conjunto da miniextrusora usando água para evitar vazamento de amostra. Uma membrana de poros de 0,1 μm também é adequada. Neste caso, Pre-aqueça o suporte da mini-extrusora acima da temperatura da transição do lipido para facilitar a extrusão, ao manter as características físico-químicas de lipídios e de proteínas.
   1. Coloque as peças da mini extrusora, conforme descrito no manual do fabricante.
   2. Coloque a membrana de policarbonato entre duas sustentações pré-molhadas do filtro e coloque-a no suporte.
   3. Insira uma seringa vazia de 1 mL no dispositivo, encha a outra seringa ao seu volume total com a suspensão lipossómica e insira-a no lado oposto.
   4. Realize uma extrusão de 12 ciclos através de uma membrana de poros de policarbonato de 0,2 μm. Empurre a amostra de uma seringa para outra, lentamente. Colete a suspensão expulsa em um tubo pre-cooled.
      Nota: a membrana do policarbonato deve ser substituída apenas quando a transferência da amostra de uma seringa para outra se torna difícil. A suspensão lipossómica deve tornar-se clara durante o processo de extrusão como resultado da redução de tamanho devido à formação de SUVs. Cerca de 0,2 mL da amostra podem ser perdidos durante esta etapa.
8. Separe os lipossomas por ultracentlee.
   Nota: manter as amostras em um banho de gelo até que o ultracentlee está pronto para ser usado. SUVs separados dos restantes componentes e sulfato de amônio por ultracentlee usando um ultracentlee com um rotor swing-balde (ver detalhes abaixo).
   1. Pesar a amostra no tubo de titânio que se encaixa o rotor e equilibrar os tubos. Verifique o volume mínimo exigido de acordo com o rotor usado para evitar danificar os tubos, e ajustar o volume de suspensão lipossómica com sulfato de amônio, se necessário.
      Nota: o balde oscilante deve ser sempre apoiado no suporte quando fora da centrífuga para evitar riscar as "listras de zebra" (ou seja, as listras pretas e brancas na parte inferior), que são usadas pela centrífuga para determinar a velocidade de rotação.
   2. Gire sobre o vácuo antes de usar o centrifugador para permitir que refrigerate.
   3. Encaixe os tubos de titânio na caçamba de balanço.
      Nota: Levante os tubos para a posição que assumem ao correr para garantir que estão perfeitamente equipados.
   4. Libere o vácuo, abra a porta do centrifugador, e coloc o rotor para dentro.
      Nota: Preste atenção à marca do círculo na parte inferior do rotor, que deve caber na direção oposta da mesma marca de círculo na centrífuga em si.
   5. Feche a porta do centrifugador, pressione o vácuo e espere até que o vácuo alcangue de 200 a < 20 mícrons ou de 26 pa a < 3 PA.
   6. Ajuste os parâmetros na exposição do ultracentlee a 150.000 x g (o equivalente a 29.600 rpm para a cubeta acima mencionada do balanço) para 90 minutos em 4 ° c (aceleração: máximo, retardação: máximo).
      Nota: sempre converta a velocidade para x g se a centrífuga específica for ajustada em RPM. Use o site de centrifugação para converter a unidade de acordo com o rotor utilizado.
   7. Pressione recall, verifique as condições e pressione Iniciar para executar.
      Nota: Aguarde até que a centrífuga atinja a velocidade desejada.
   8. Após 90 min, solte o aspirador pressionando o botão Vacuum e abra a porta centrífuga quando o vácuo atinge 200-700 mícrons (equivalente a 26-93 PA).
   9. Desligue a centrífuga, retire o rotor do interior, e deixe-o no banco com os baldes para secar.
   10. Mantenham as amostras ultracentadas no gelo.
9. Com cuidado, separe o sobrenadante do pellet girando o tubo de cabeça para baixo em um tubo de centrífuga descartável de 15 mL para separar o sobrenadante e o pellet.
   Nota: conservar o sobrenadante contendo a proteína não encapsulada a 4 ° c. Ele será usado para determinar a eficiência de encapsulamento. A pelota aparece como uma geléia translúcida.
10. Suspender a pelota contendo a proteína encapsulada em soro fisiológico tamponado HEPES (3 mL de 1x HBS).
    Nota: o HBS 2x (solução de ações) é preparado diluindo as seguintes quantidades de reagentes em água destilada: 140 mM NaCl, 1,5 mM na₂HPO₄, 50 mm HEPES, em seguida, ajustando o pH para 7,4 e volume final para 100 ml. Na₂HPO₄ pode ser substituído por NaHCO₃ou omitido para evitar a interferência se a concentração do lipossomas deve ser determinada. A solução de ações HBS 2x deve ser diluída em água destilada para obter HBS 1x antes da utilização.

2. eficiência de encapsulamento

Nota: Determine a eficiência do encapsulamento usando o protocolo de Peterson¹⁷a fim evitar a interferência do lipido na quantificação da proteína. Todas as amostras (padrões de BSA e sobrenadante lipossomas) devem ser analisadas em triplicado. Também Prepare um tubo em branco.

1. Preparação de reagentes e soluções de trabalho¹⁷
   1. Para reagentes de estoque, prepare o cobre-tartarato-carbonato (CTC) misturando 10 mL de carbonato de sódio a 20%, 200 μL de sulfato de cobre 0,1%, 200 μL de tartarato de potássio a 0,2% com 9,6 mL de água destilada. Prepare 100 mL de sulfato de dodecilo de sódio a 10% (SDS) e hidróxido de sódio 0,8 N (NaOH).
   2. Para soluções de trabalho, prepare 10 mL de 0,15% de desoxicolato de sódio (DOC) e 72% de ácido tricloroacético (TCA). Dissolver 10 mg de albumina sérica bovina (BSA) em 10 mL de água destilada para obter uma solução padrão de 1 mg/mL. Prepare O reagente a adicionando partes iguais de CTC, de NaOH, de SDS, e de H₂O. Prepare O Reagente B diluindo O reagente de fenol Folin-Ciocalteu 1:5 em água destilada.
      Nota: o reagente A requer 1 mL para cada tubo de reacção, enquanto o reagente B requer 0,5 mL. Para determinar os volumes finais dos reagentes a e B, primeiro defina o número de tubos de reação a serem utilizados, considerando três concentrações distintas de BSA, em branco, e amostras em triplicado. O reagente A deve ser bem homogeneizado antes da utilização e pode ser conservado a 25 ° c (RT) durante 2 semanas. O reagente B também é estável a 25 ° c (RT) se armazenado em um frasco de âmbar.
2. Precipitação
   Nota: esta etapa é realizada em tubos de microcentrífuga.
   1. Diluir o sobrenadante lipossomas com água para um volume final de 1 ml contendo 5-100 μg de proteína.
      Nota: o tubo em branco deve ser preenchido com 1 mL de água destilada.
   2. Adicionar 0,1 mL de 0,15% DOC, homogeneizar por vortexing, e incubar por 10 min em RT.
   3. Adicione 0,1 mL de 72% de TCA, misture bem e centrifugue a 3.000 x g e RT durante 15 min.
      Nota: DOC-TCA promove precipitação protéica, formando duas fases distintas. A proteína alvo pode ser recuperada por centrifugação, evitando interferência lipídica.
   4. Elimine cuidadosamente o sobrenadante ao o o tubo para baixo e colocando-o sobre um papel absorvente. Guarde o pellet para a etapa subsequente.
      Nota: a pelota pode ser muito difícil de ver, mas o tubo deve ser virado de cabeça para baixo, mesmo que não seja visível.
3. Espectrofotometria
   1. Suspender o pellet obtido a partir do passo 2.2.4 em 1 mL de água destilada. Misture cuidadosamente para se certificar de que a pelota é dissolvida e transfira a amostra para um novo tubo de ensaio.
   2. Prepare diluições de padrões de albumina (BSA) para um volume final de 1 mL.
      Nota: os padrões proteicos devem ser preparados entre 5-100 μg/mL.
   3. Adicionar 1 mL de reagente a aos tubos do passo 2.3.1 e 2.3.2 sem excepção, misturar bem e incubar durante 10 min em RT.
      Nota: SDS pode aliviar possíveis interferências lipídicas, enquanto auxiliando na solubilização de proteínas.
   4. Adicionar 0,5 mL de Reagente B aos tubos a partir do passo 2.3.1 e 2.3.2, misturar bem e incubar durante 30 min em RT enquanto estiver protegido da luz.
      Nota: o reagente de fenol Follin-Ciocalteu é uma mistura de foshomolisbdate e fosfoungstate utilizados para ensaios colorimétricos de alguns compostos contendo azoto, tais como proteínas. A complexação de cobre aumenta a reatividade de fenóis em direção a este reagente, produzindo um complexo azul/roxo de acordo com a concentração proteica.
   5. Determine absorvância a 750 nm usando um espectrofotômetro.
   6. Calcule a concentração de proteínas no sobrenadante com base na curva padrão da seguinte forma.
      1. Valor da absorvência do lote (ABS) versus concentração de BSA (mg/ml) para obter o coeficiente angular (k) Considerando uma linha de tendência linear.
      2. Determine a concentração de proteína sobrenadante (C) pela razão entre o valor da absorvência e o coeficiente angular (k), em seguida, multiplicar pelo volume total da seguinte forma:
         
4. Determine a eficiência de encapsulamento de acordo com a seguinte fórmula:
   
5. onde a proteína carregada = 10 mgs, proteína paratireoidiano = valor de C obtido na etapa 2.3.6.2.
   Nota: neste caso, um total de 10 mg de Tarina dissolvida em solução de sulfato de amónio (1 mg/ml) é utilizado para realizar o procedimento de encapsulamento, uma vez que esta concentração é suficiente para obter efeitos in vitro satisfatórios^13,16, de ^{18 anos}.

3. determinação do tamanho e da estabilidade

Nota: a distribuição do tamanho e o índice de polidispersão (PdI) das preparações lipossómicas são avaliados por espalhamento de luz dinâmico (DLS). Um PdI perto de 0,1 indica uma preparação homogênea. Para a determinação da estabilidade, armazene lipossomas a 4 ° c e verifique a distribuição do tamanho e a média do tamanho regularmente.

1. Ligue o equipamento DLS 30 min antes de utilizar para aquecer a lâmpada laser.
2. Transfira a preparação lipossomal obtida na etapa 1,10 a uma cubeta descartável do dimensionamento.
3. Definir os parâmetros do equipamento da seguinte forma: dispersante tipo = água (RI = 1,33); material = lipídios (RI = 1,45); e RT.
4. Pressione Iniciar e aguarde enquanto o equipamento termina sua leitura.
5. Retire a cubeta e desligue o equipamento.
   Nota: Transfira a amostra da cubeta de volta ao tubo descartável do centrifugador de 15 mL para análises subseqüentes, ou descarte-a se há uma quantidade suficiente para leituras novas.

4. caracterização morfológica

Nota: a caracterização liposome é realizada de acordo com Murtey e Ramasamy¹⁹. Amostras contendo nanoliposomas obtidas na etapa 1,10 são preparadas em triplicado.

1. Fixar as coberturas de vidro (13 mm de diâmetro) na parte inferior de uma placa de Petri com fita dupla face. Corte a fita em pedaços pequenos (tamanho apropriado para fixar os lamínulas), retire o papel protetor embaixo, e fixe-o na parte inferior da placa de Petri. Com o auxílio de pinças, retire o papel protetor em cima da fita e fixar as coberturas sobre ele.
   Observação: tenha cuidado nas etapas a seguir para não liberar os COVERSLIP e usar uma fita forte.
2. Cubra os lamínulas com poli-L-lisina. Coloque papéis de filtro molhados dentro da placa de Petri para manter a umidade e incubar por 1 h em RT (25 ° c).
3. Após o revestimento, enxágüe as coberturas com água destilada.
4. Encha as lamelas com uma gota da amostra da etapa 1,10 e deixe-as secar por 1 h em RT.
5. Para fixar as amostras, cubra-as com glutaraldeído a 4% preparada em tampão fosfato 0,1 M, pH = 7,2. Coloc papéis de filtro molhados dentro do prato de Petri e sele o prato para manter níveis da umidade. Incubar a 4 ° c por 48 h.
6. Enxague os lamínulas 3x durante 5 min com o mesmo tampão fosfato.
7. Desidrata as amostras da seguinte forma: 35% etanol 1x por 15 min, 50% etanol 1x por 15 min, 75% etanol 1x por 15 min, 95% etanol 2x por 15 min, e etanol absoluto 3x por 20 min.
8. Secar quimicamente as amostras por imersão 2x em 1 − 2 ml de hexametildissilazano (HMDS) por 10 min.
   Nota: o HMDS deve ser manipulado com cuidado dentro de uma capa das emanações. As amostras devem ser permitidas secar durante a noite dentro de um dessecador ou dentro da capa das emanações em RT.
9. Monte as amostras secas em um topo com uma fita adesiva condutora de carbono.
10. Sputter a superfície da lamínula em um vácuo com uma camada eletricamente condutora (20 nm de espessura) de ouro-paládio.
11. Gravar imagens com um microscópio eletrônico de varredura (SEM) no modo de baixo vácuo e baixa tensão (20 kV).

Resultados

A Figura 1 descreve a preparação do nanoliposome^16,20,21. Fosfolipídios, 1,2-dioleoilo-SN-glicerol-3-Fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[amino (polietileno glicol)-2000] (sal de amônio; Dspe-MPEG 2000), e cholesterylhemisuccinate (Chems), os constituintes lipossomas principais, foram dissolvidos primeiramente no clorofórmio para obter a película do lipido. O filme lipídico foi então rehidratado em solução de sulfato de amônio contendo a proteína hidrofílica (Tarina) a ser aprisionada, e a incubação foi realizada durante a noite. Em seguida, foram aplicadas técnicas de sonicação e extrusão para gerar pequenas vesículas unilamelares. A etapa do ultracentlee separou a preparação lipossomal dos lípidos livres e da proteína unencapsulated, quando o sobrenadante foi usado para a determinação da eficiência do aprisionamento.

Os nanolipossomas produzidos utilizando a metodologia supracitada exibiram uma distribuição de tamanho variando de 51 − 396 nm e um tamanho médio de 155 nm (tabela 2). A preparação foi homogênea, uma vez que o índice de polidispersão foi 0,168. Uma alta eficiência de aprisionamento de 83% pode ser alcançada se os lipossomas forem extrudados através de uma membrana de tamanho de poros de 0,2 μm (tabela 2).

As características morfológicas do nanoliposome foram avaliadas por MEV. a Figura 2a, B apresenta vesículas lipossómicas em forma redonda na faixa de 121 nm e analisada a 20 kV, enquanto a Figura 2C, D apresenta inadequadamente preparados Amostras. Os nanolipossomas foram simplesmente secos ao ar sem fixação prévia ou qualquer outro tratamento descrito neste estudo. Como resultado, observaram-se vesículas maiores e danificadas na faixa de 332 μm e analisadas a 5 kV.

Figura 1: representação esquemática da preparação de nanolipoalguns. O dope, o Peg, e os Chems, os constituintes lipossomas principais, foram dissolvidos primeiramente no clorofórmio para obter a película do lipido (1, 2, 3). O filme lipídico foi então rehidratado em um tampão fisiológico contendo a proteína hidrofílica (Tarina) a ser aprisionada, e a incubação foi realizada durante a noite (4). Em seguida, foram aplicadas técnicas de sonicação e extrusão para gerar SUVs (5,6). O passo de ultracentilação separou a preparação lipossómica de lipídios livres e proteínas não encapsuladas, enquanto o sobrenadante foi utilizado para a determinação da eficiência de aprisionamento (7). Este número foi modificado de Correa et al.¹⁶. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fotomicroscopia de Nanolipoalguns por MEV. (A, B) Imagens de vesículas lipossómicas em forma redonda na faixa de 121 nm e analisadas a 20 kV. (C, D) Imagens de amostras inadequadamente preparadas. Amostras maltratadas permitiram a observação de vesículas maiores e/ou danificadas, que não resistem a condições de vácuo e/ou tensão a 5 kV. Este número foi modificado de Correa et al.¹⁶. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componentes do liposome	Peso (g)	Concentração (milímetro)	Volume final
Droga	0, 420	5,7	10 mL de
MPEG 2000-DSPE	0,1059	3,8
Chems	0, 24	0,5

DOPE-1,2-dioleoilo-SN-glicerol-3-Fosfoetanolamina); MPEG 2000-DSPE-1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[amino (polietileno glicol)-2000] (sal de amônio); CHEMS – cholesterylhemisuccinate.

Tabela 1: preparação de nanocapsules lipossomal Tarin.

Tamanho do poro da membrana (μm)	Distribuição de tamanho (nm)	Tamanho médio (nm)	Índice de polidispersidade (PdI)	Pico (nm)	Eficiência de encarceramento
0,2	51-396	155	0.168	94 ± 39	0,83

O índice de tamanho e de polidispersão foi avaliado por dispersão de luz dinâmica, enquanto a eficiência de encapsulamento foi determinada de acordo com Peterson¹⁷.

Tabela 2: tamanho, índice do polidispersity, e eficiência do aprisionamento da preparação do nanoliposome.

Discussão

O protocolo aqui descrito foi testado por Correa et al.¹⁶ para encapsular a Tarina, uma lectina imuno-modulatória e antitumoral purificada da Colocasia esculenta²². A metodologia produziu resultados bem-sucedidos, permitindo a produção de nanoliposomas estáveis de tamanho adequado para aplicações terapêuticas. A formulação apresenta liberação controlada em diferentes níveis de pH em condições fisiológicas. Também potenciora as propriedades farmacológicas da Tarina, como a inibição do glioblastoma humano U-87 MG e o câncer de mama MDA-MB-231 linhas celulares e estimulação de células de medula óssea de camundongos. A preparação lipossomal não exibiu nenhuns efeitos tóxicos em pilhas saudáveis¹⁶dos ratos.

O método clássico, descrito pela primeira vez por Bangham et al.⁷, permite a produção de grandes vesículas lipoalgas multilamelares, heterogêneas em tamanho e forma. As adaptações deste método, como relatado no presente estudo, são aplicadas com sucesso, incluindo etapas adicionais, como sonicação e extrusão através de uma membrana de policarbonato de 0,2 μm. Isto permite a produção de uma dispersão mais homogênea em relação ao tamanho na faixa de nanômetro^16,23,24. Conseqüentemente, para assegurar resultados bem sucedidos, o protocolo do encapsulamento e a formulação lipossomal descritas aqui devem estritamente ser seguidas.

A composição do nanoliposome foi selecionada com cuidado a fim assegurar a formação de uma membrana do BICAMADA com dope, MPEG 2000-dspe, e Chems como os constituintes principais. Estes são constituintes de BICAMADA de membrana animal natural e este último pode conferir fluidez à arquitetura nanoliposome, garantindo ampla aplicação para a entrega de compostos bioativos em seres humanos.

A peguilação de nanoliposome é essencial para garantir a estabilidade da estrutura lipossomas. A ausência de Peg conduz ao alargamento do tamanho, a um índice elevado do polidispersão, e à baixa eficiência do aprisionamento. Os resultados óptimos podem ser obtidos com o dope como o componente principal do lipossomas. No entanto, este é um fosfolípido de alto custo. Os custos financeiros da produção de nanoliposome podem ser conseguidos substituindo o NARCÓTICO com outros lipídios similares tais como o DOPC (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-fosfocolina). O CHEMS é uma molécula de colesterol encontrada naturalmente em membranas de células animais, que não devem ser excluídas da formulação, uma vez que é importante garantir a fluidez e maleabilidade do bicayer lipídico¹⁶.

Outros aspectos do protocolo de encapsulamento também podem ser adaptados. O clorofórmio utilizado para dissolver os componentes lipossomal pode ser facilmente substituído por metanol sem efeitos na média de tamanho, homogeneidade e eficiência de aprisionamento. No entanto, alguns vazamentos de proteínas podem ocorrer no armazenamento 4 ° c¹⁶. O passo de incubação durante a noite com solução de sulfato de amônio contendo Tarina não é obrigatório; no entanto, por conveniência, pode ser realizada sem prejuízo para as características biofísicas nanoliposomáticas, encapsulação ou perdas de eficiência de estabilidade, como demonstrado por Correa et al.¹⁶. A etapa da extrusão é executada na temperatura ambiente, que pode diminuir a taxa de fluxo entre as seringas se uma membrana do tamanho de poro de 0,1 μm é usada.

Para superar esse problema, o uso de uma membrana de tamanho de poros de 0,2 μm ou o aquecimento do suporte da extrusora acima da temperatura de transição lipídica devem ser considerados. O analista deve ter cuidado para não danificar os lipídios ou proteínas que podem ser inativados e perder a atividade biológica. Alternativamente, a preparação lipossomal pode ser diafiltrado de encontro a HBS em vez da ultracentilgação, usando uma membrana do corte de acordo com o peso molecular da proteína. A escolha da natureza química do tampão em que os em são suspendidos depois que o ultracentlee está diretamente relacionado a sua aplicação subseqüente. Como as perspectivas deste estudo incluem ensaios in vivo e in vitro, a suspensão em soro fisiológico tamponado de HEPES foi adequada para garantir que não houvesse efeitos citotóxicos e um intervalo de pH próximo às condições fisiológicas.

Os lipossomas devem ser tratados finamente, semelhantes às células vivas, para obter imagens SEM maior qualidade. Os procedimentos de fixação e secagem são importantes para garantir a visualização de vesículas intactas menores que suportam valores superiores a 20 kV condições de vácuo. Figura 2 A, B apresenta vesículas nanodimensionadas compatíveis com o procedimento de extrusão. A visualização de vesículas variando de 51-396 nm é possível se a preparação adequada da amostra após este procedimento for realizada. As etapas incluem fixação, secagem por aumento das concentrações de etanol e desidratação química para evitar a formação de agregados e vesículas rompidas causadas pelo vácuo e feixe de elétrons. Por outro lado, a Figura 2C, D mostra vesículas liofilizadas secas temperatura ambiente e não submetidas a quaisquer tratamentos aqui descritos, o que significa que eles foram preparados de forma inadequada. Como resultado do procedimento inadequado, as vesículas gigantes são formadas, mesmo após a extrusão através de uma membrana de tamanho de poros de 0,2 μm. Vesículas rupcionadas também são observadas em ambos os painéis como resultado de danos causados por vácuo e feixe de elétrons.

As vesículas de nanoliposome têm sido exploradas como um sistema de encapsulamento e entrega de moléculas hidrofóbicas, incluindo o resveratrol (3, 5, 4 '-trihidroxistilbene), um composto Bioativo contra células cancerosas Colorretais. O procedimento de encapsulamento pode superar a solubilidade pobre de compostos lipofílicos, além de fornecer biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-imunogenicidade, e características de não-toxicidade inerentes a liposoma nanocápsulas²⁵. As adaptações do protocolo devem ser levadas em consideração, dependendo da via de administração e da finalidade, como o desenvolvimento de novas formulações de lipoalgumas para administração oral.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Sulfate	Sigma-Aldrich Co	A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw	Mettler Inc.	417870
Beckman DU-640 Spectrophotometer	Beckman Coulter	8043-30-1090
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich Co	5470
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump	Thermo Fischer Scientific	05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate)	Sigma-Aldrich Co	C6512
Chloroform	Sigma-Aldrich Co	48520-U	CAUTION
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate)	Sigma-Aldrich Co	209198
Coverslips (13mm diameter)	Thermo Scientific Nunc	EW-01839-00
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine)	Lipoid GMBH	565600.1
Ethanol Absolute	Sigma-Aldrich Co	32205
Folin -Ciocalteu phenol reagent	Sigma-Aldrich Co	F9252
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich Co	G5882
HEPES	Sigma-Aldrich Co	H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich Co	440191	CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope	JEOL LTD
Mini Extruder 7	Avanti Polar Lipids	610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)	Lipoid GMBH	588200.1
Optima L-90k Ultracentrifuge	Beckman Coulter	PN LL-IM-12AB
Phosphate Buffer	Sigma-Aldrich Co	P3619
Poli-L-lysine	Sigma-Aldrich Co	P8920
Potassium L-tartrate monobasic	Sigma-Aldrich Co	243531
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich Co	S7795
Sodium chloride	Sigma-Aldrich Co	S7653
Sodium Deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich Co	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich Co	L3771
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich Co	S8045
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Sigma-Aldrich Co	RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope	Tescan	#657874
Trichloroacetic Acid (TCA)	Sigma-Aldrich Co	91230
Zetasizer Nano ZSP	Malvern Panalytical LTD
Ultrasonic cleaning bath model 2510	Branson