Fenotipagem circadiana humana e testes de desempenho diurno no mundo real

Resumo

Aqui, apresentamos um método para investigar ritmos diurnos em desempenho após categorização precisa dos participantes em grupos fenótipos circadianos com base no Questionário cronotipo de Munique, biomarcadores de fase circadiana padrão ouro e medidas actigráficas.

Resumo

Em nossa sociedade continuamente em desenvolvimento "24 horas por dia", é necessário aumentar nossa compreensão de como as mudanças na biologia, fisiologia e psicologia influenciam nossa saúde e desempenho. Embutido nesse desafio, está a necessidade crescente de explicar as diferenças individuais no sono e ritmos circadianos, bem como explorar o impacto da hora do dia no desempenho no mundo real. Existem várias maneiras de medir o sono e os ritmos circadianos desde métodos subjetivos baseados em questionários até monitoramento objetivo do sono/vigília, actigrafia e análise de amostras biológicas. Este artigo propõe um protocolo que combina múltiplas técnicas para categorizar indivíduos em grupos fenótipos circadianos precoces, intermediários ou tardios (ECPs/ICPs/LCPs) e recomenda como realizar testes de desempenho diurno no campo. Os resultados representativos mostram grandes diferenças nos padrões de repouso derivados da actigrafia, fase circadiana (início da melatonina de luz fraca e tempo de pico da resposta ao despertar do cortisol) entre fenótipos circadianos. Além disso, diferenças significativas nos ritmos de desempenho diurno entre ECPs e LCPs enfatizam a necessidade de levar em conta o fenótipo circadiano. Em resumo, apesar das dificuldades em controlar fatores de influência, este protocolo permite uma avaliação real do impacto do fenótipo circadiano no desempenho. Este artigo apresenta um método simples para avaliar o fenótipo circadiano no campo e apoia a necessidade de considerar a hora do dia ao projetar estudos de desempenho.

Introdução

No nível comportamental, a avaliação dos padrões individuais de repouso/atividade pode ser feita utilizando métodos subjetivos baseados em questionários ou monitoramento objetivo por meio de actigrafia de pulso. Os dados actigráficos foram validados contra a polissonografia (PSG) para vários parâmetros de sono, incluindo: tempo total de sono, eficiência do sono e vigília após o início do sono¹. Embora o PSG seja conhecido como o padrão-ouro para medir o sono, é desafiador usar por períodos prolongados fora do laboratório do sono². Portanto, os actigrafos destinam-se a fornecer uma alternativa simples e mais econômica ao PSG e permitir o monitoramento do padrão de descanso/atividade de 24 horas. As medidas subjetivas de auto-relato podem definir o "cronótipo" de Munique usando o Questionário cronotipo de Munique (MCTQ)³, ou preferência diurna usando o Questionário de Morningness-Eveningness (MEQ)⁴. Os grupos em ambas as extremidades deste espectro podem ser referidos como fenótipos circadianos precoces (ECPs) e fenótipos circadianos tardios (LCPs) com aqueles entre os fenótipos circadianos intermediários (ICPs).

Embora os ECPs e lcps sejam claramente distinguíveis através de seu comportamento (ou seja, padrões de sono/vigília), essas diferenças individuais também são parcialmente impulsionadas por variações na fisiologia⁵ e predisposição genética^6,7. Biomarcadores fisiológicos são frequentemente usados para determinar a fase circadiana/tempo de um indivíduo. Dois dos principais hormônios indicativos do tempo circadiano são a melatonina, que sobe à noite para atingir um pico no meio da noite, e o cortisol, que atinge o pico na manhã⁸. Usando esses marcadores de fase circadianos, diferenças individuais nos padrões de sono-vigília são capazes de ser identificadas. Por exemplo, início de melatonina fraca (DLMO)^9,10 e o tempo de resposta ao despertar do cortisol^11,12 pico mais cedo em ECPs, que é espelhado pelo ritmo circadiano da temperatura corporal do núcleo¹³. A saliva permite uma coleta fácil, segura e não invasiva a partir da qual esses hormônios podem ser analisados por radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA) sem a necessidade de extrair qualquer material celular. RIA e ELISA são ensaios sensíveis e específicos que detectam concentrações de antígenos em amostras biológicas (por exemplo, sangue, plasma ou saliva), através de reações de antígenos-antígenos envolvendo isótopos rotulados por rádio (por exemplo, iodo (¹²⁵I) ou anticorpos ligados à enzima¹⁴).

Protocolos laboratoriais estritamente controlados, como rotina constante (CR) e dessincronização forçada (DF) são o padrão-ouro no campo da cronobiologia para estudar ritmos circadianos endógenos¹⁵. No entanto, há uma necessidade crescente de estudar indivíduos em seu ambiente doméstico fora de ambientes artificiais de laboratório para coletar dados contextuais e aumentar a validade externa dos resultados. Por isso, exigimos melhores formas de categorizar, medir e avaliar as diferenças individuais no campo. Além disso, variações diurnas em várias medidas de desempenho físico (aeróbico, força muscular) e cognitiva (tempo de reação, atenção sustentada, função executiva) foram descobertas com ECPs com melhor desempenho no início do dia e LCPs na noite^{de 16,17}. Isso enfatiza que a hora do dia e o fenótipo circadiano devem ser fatores que são considerados na realização de testes de desempenho em estudos de pesquisa.

O número de diferentes medidas e protocolos utilizados em estudos laboratoriais permite a implementação de condições altamente controladas. Estudos de campo tendem a ser mais desafiadores devido ao número de fatores influenciadores. Portanto, o uso de uma abordagem mais holística, combinando múltiplas técnicas, pode proporcionar mais precisão ao monitorar o comportamento, a psicologia e o desempenho de um indivíduo em seu ambiente doméstico¹⁸. Aqui, discutimos um método que pode ser facilmente implementado no campo para identificar diferenças individuais em fenótipos circadianos usando o MCTQ, actigrafia e biomarcadores fisiológicos. Temos a hipótese de que essas variáveis diferem significativamente entre grupos de fenótipo circadiano e estarão significativamente correlacionadas com o cronótipo (= corrigido no meio do sono em dias livres (MSF_sc) recolhidos do MCTQ). Além disso, sugerimos formas de medir o desempenho diurno, destacando a necessidade de analisar os dados separadamente para cada grupo de fenótipo circadiano. Temos a hipótese de que as diferenças nos ritmos de desempenho diurno serão obscurecidas se os dados forem analisados apenas em todo o nível populacional.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Birmingham.

1. Triagem participante e design experimental

1. Executar todos os métodos seguindo as aprovações éticas apropriadas, de acordo com a Declaração de Helsinque e obter consentimento informado por escrito de todos os participantes antes de qualquer envolvimento.
2. Recrutar participantes sem diagnóstico prévio de sono, distúrbios neurológicos ou psiquiátricos, e sem tomar nenhum medicamento que afete o sono, a melatonina ou os ritmos de cortisol.
3. Certifique-se de que nenhum participante seja trabalhador de turno, os participantes não viajaram mais de dois fusos horários no último mês e estão livres para participar do estudo (ou seja, capazes de se comprometer a usar o actiwatch, dar amostras de saliva em um "dia livre" e estar presentes para testes de desempenho em horários específicos (ver seção 2.1)).
4. Convide os participantes que passam por critérios de inclusão para participar de uma reunião inicial para obter consentimento, coletar dados do questionário, receber treinamento na coleta de amostras de saliva em casa e ser configurado com um dispositivo actigráfico e diário do sono. Nesta reunião, familiarize os participantes com os protocolos de amostragem fisiológica para garantir que eles entendam o que é necessário (ver seção 3).
5. Peça aos participantes que preencham o Munique ChronoType Questionnaire (MCTQ), que avalia diferenças individuais nas variáveis de sono/vigília e exposição à luz no trabalho e dias livres³. Isso permite o cálculo dos tempos de sono médio corrigidos em dias livres (MSF_sc),usado como marcador de cronótipo.

2. Diários de actigrafia e sono

1. Durante pelo menos duas semanas¹⁹ (podem ser períodos de tempo mais longos, dependendo dos objetivos do estudo), peça aos participantes que usem um monitor de atividade de pulso ou "actigrama", para coletar padrões de repouso/atividade e dados leves (1-32.000 lux) durante o período de estudo.
2. Dê a cada participante detalhes de como usar os actígrafos, incluindo a remoção para banho/banho (se não à prova d'água) e a prevenção de mangas que os cubram para permitir que dados leves sejam coletados. Certifique-se de que os actígrafos são usados no pulso não dominante.
3. Em combinação com a actigrafia e para facilitar a análise de sono/vigília derivada dos dados actigráficos, dê a cada participante um diário de sono para completar diariamente. Certifique-se de que as perguntas feitas incluem horários de dormir, horários de sono, despertar, acordar tempos, qualidade do sono, cochilos e momentos em que os actígrafos foram removidos.
4. Coletar dados de actigrafia para análise de repouso/atividade, de acordo com o que é necessário (este estudo utilizou uma configuração de frequência amostral de 30Hz e média sensibilidade). Extrair detalhes da hora diária de dormir e levantar tempos de diários de sono e entrada para o software ou alternativa do fabricante (por exemplo, código validado de código aberto, a fim de obter variáveis actigráficas relevantes para o estudo).

3. Amostragem fisiológica

1. Pré-preparar embalagens de amostragem rotulando tubos de coleta de polipropileno ou salivetas (use bijous plásticos de 7 mL neste estudo). Rotular os tubos com número de ida do participante, número de amostragem de manhã ou à noite e amostragem individual. Inclua um tubo 'sobressalente' para usar em caso de erros.
2. Prepare uma folha de registro de coleta de amostras para protocolos matutino e vespertino para permitir que os participantes marquem o tempo quando as amostras forem colhidas (por exemplo, Amostra da Manhã 1, Tempo tomado = hh:mm, Amostra da Manhã 2, Tempo tomado = hh:mm). Inclua o número de identificação do participante, a data para informações sazonais e o local para o cálculo do fotoperíodo.
   NOTA: É crucial que o tempo militar seja usado para garantir que não haja problemas com am/PM. Diferentes etiquetas coloridas para tubos de amostragem matinal vs. à noite também podem ser usados para distinguir entre amostras.
3. Dar aos participantes os protocolos relevantes para amostragem fisiológica e embalagens pré-fabricadas durante o treinamento de como colher amostras de saliva em seu ambiente doméstico/de trabalho.
4. Informe ao participante que as amostras devem ser coletadas em um dia livre quando os participantes podem ir para a cama e acordar nos horários preferidos (ou seja, sem a necessidade de alarme). Para garantir um cálculo confiável do DLMO, os participantes não devem realizar o protocolo de amostragem de saliva noturna no dia anterior ao teste de desempenho devido à necessidade de ficar acordado após a hora habitual de dormir.
5. Peça aos participantes para alocar uma manhã e uma noite (no mesmo dia) durante a segunda semana do estudo quando eles são capazes de se comprometer a dar as amostras de saliva. Aconselhar os participantes a coletar amostras matinais seguidas de amostras noturnas no mesmo dia.
   NOTA: A ordem de amostragem (manhã e noite) deve ser seguida para garantir que quaisquer alterações no tempo de sono não impactem os resultados (se as amostras noturnas forem colhidas primeiro exigindo ficar acordado após a hora habitual de dormir, isso pode influenciar as amostras da manhã se colhidas no dia seguinte).
6. Protocolo de amostragem matinal para resposta ao despertar de cortisol
   1. Certifique-se de que as amostras de saliva sejam coletadas no ponto de primeiro despertar (ainda na cama), a cada 15 minutos durante a primeira hora e, em seguida, a cada 30 minutos para as próximas 1 a 2 h. Colete amostras de saliva cuspindo no frasco devidamente rotulado (começando com o nº 1, 2, 3, etc.).
   2. Durante esse período, certifique-se de que os participantes: abstenham-se de bebidas alcoólicas, bebidas contendo corante artificial e alimentos durante o período de teste e abstenham-se de limpar os dentes, com ou sem pasta de dente durante o período de amostragem.
   3. Uma vez fornecidas todas as amostras, certifique-se de que os participantes armazenem suas amostras em seu freezer a -20 °C até a coleta pela equipe de pesquisa.
      NOTA: É melhor armazenar as amostras congeladas, se possível, mas elas permanecerão viáveis se armazenadas na geladeira até a coleta no dia seguinte. De acordo com a Lei do Tecido Humano (HTA) de 2004, as amostras devem ser coletadas e processadas no prazo de sete dias de coleta para torná-las acelulares, a menos que uma licença de HTA seja mantida pela Instituição que realiza a análise.
7. Protocolo de amostragem noturna para início de melatonina fraca
   1. Certifique-se de que as amostras de saliva sejam coletadas a cada 30 min de 3 a 4h antes da hora habitual de dormir até 1 a 2 h após a hora habitual de dormir (por exemplo, se a hora de dormir habitual é 22:00 h, o participante começaria às 18:00/19:00 h até 23:00/00:00 h). Coletar amostras de saliva cuspindo no frasco devidamente rotulado (começando com o nº 1 e depois 2, 3, etc.).
   2. Durante esse período, certifique-se de que os participantes: abstenham-se de bebidas com cafeína (por exemplo, chá, café, coca-cola) a partir das 6h antes da hora habitual de dormir (por exemplo, se a hora de dormir habitual é 22:00h, o consumo de cafeína deve parar às 16:00 h no dia da coleta).
   3. Certifique-se de que os participantes permaneçam sentados em ambientes fechados com luz fraca (< 10 lux, por exemplo, uma única lâmpada de mesa preferencialmente vermelha, do outro lado da sala, sem luzes aéreas, sem telas eletrônicas, cortinas fechadas). Certifique-se de que os participantes evitem beber bebidas que contenham álcool ou corantes artificiais e abstenham-se de limpar os dentes, com ou sem pasta de dente, durante o período de amostragem.
   4. Se os participantes desejarem comer algo, vá ao banheiro ou faça uma bebida não cafeína, certifique-se de que o façam imediatamente após a coleta de uma amostra e tente se sentar novamente por 15 min antes que a próxima amostra seja coletada. Se o alimento for consumido entre as amostras, certifique-se de que os participantes lavem a boca com água 15 min antes da coleta da próxima amostra.
   5. Certifique-se de que todas as outras salas tenham as mesmas condições de luz para que o participante permaneça em luz fraca (preferencialmente luz vermelha) durante o período de amostragem.
   6. Uma vez fornecidas todas as amostras, certifique-se de que os participantes armazenem suas amostras em seu freezer a -20 °C até a coleta pela equipe de pesquisa.
      NOTA: É fundamental que os participantes aderam ao protocolo dim light. Sempre que possível, os pesquisadores devem medir as condições de luz para monitorar a intensidade e a composição espectral.

4. Radioimunoensaio

1. Realize RIA ou ELISA de melatonina e cortisol na saliva humana para determinar concentrações relativas em cada ponto de tempo.
   NOTA: O procedimento nestes resultados representativos utilizou RIA com um rastreador rotulado radioativo⁽¹²⁵I) e separação de fase sólida. Este protocolo é empregado rotineiramente no Laboratório de Cronobiologia, Universidade de Surrey, Reino Unido²⁰.
2. Calcule os DLMOs individuais como o ponto de tempo em que a concentração de melatonina excede dois desvios padrão das três medidas de linha de base (as três primeiras amostras).
   NOTA: Este método ajusta-se para diferenças individuais de linha de base em comparação com o uso de uma concentração de taxa fixa¹⁴. Outros métodos podem ser utilizados dependendo dos pontos de tempo utilizados na amostragem (por exemplo, durante um período de 24 h para um perfil completo¹⁴).
3. Calcule o pico de cortisol como o tempo de maior concentração de cortisol registrado durante a resposta de despertar de cortisol da manhã.

5. Testes de desempenho diurno

NOTA: As medidas utilizadas neste protocolo são a Tarefa de Vigilância Psicomotora (PVT)²¹, e a Escala de Sonolência Karolinska (KSS)²². No entanto, outros testes poderiam ser usados mantendo o mesmo desenho dependendo do objetivo do estudo (por exemplo, se o estudo estivesse investigando o impacto do fenótipo circadiano na memória de trabalho, uma tarefa de memória seria necessária).

1. Peça aos participantes que realizem pelo menos um teste de prática (dependendo da tarefa) durante a semana anterior ao teste para se familiarizarem com a configuração.
   NOTA: Os ensaios práticos podem ser feitos remotamente se monitorados. O número de testes práticos deve ser adaptado com base nas tarefas utilizadas no estudo. Por exemplo, uma tarefa de função executiva mais complexa pode exigir uma série de testes práticos para chegar a um patamar em comparação com uma tarefa mais simples.
2. Organizar as sessões de teste de acordo com as hipóteses do estudo com base no número de pontos de tempo que estão sendo investigados em horários específicos do relógio.
   NOTA: Dependendo do desenho do estudo, os testes de desempenho podem ser realizados em casa ou em laboratório. Devido à natureza sensível ao tempo do protocolo, se o teste de desempenho for feito no ambiente doméstico, a conformidade deve ser monitorada para garantir que os participantes estejam conduzindo-o eles mesmos, bem como a hora e a data carimbadas.
3. Realizar testes em um dispositivo relevante (este estudo usou um DQ67OW, processador i7-2600, MEMÓRIA RAM de 4 GB, desktop de 32 bits com teclado e mouse padrão).
   NOTA: Se um laptop, iPad ou outro dispositivo for necessário para testes, certifique-se de que o mesmo dispositivo e as configurações sejam usados durante todo o estudo para todos os participantes e cada sessão de teste devido à potencial variabilidade nas respostas de um mouse vs. track pad vs. tela sensível ao toque.

6. Análise

1. Categorize grupos de fenótipo circadiano com base no seu valor para as cinco variáveis coletadas: MSF_sc, tempo de vigília, tempo de pico de resposta ao despertar do cortisol, DLMO e início do sono (cortes são dados na Tabela 1).
2. Aloque uma pontuação por variável para cada participante. Uma variável é alocada 0 se estiver na categoria ECP, 1 se estiver na categoria ICP e 2 se estiver na categoria LCP. Por exemplo, se um participante estiver na categoria LCP para todas as variáveis, ele acumularia uma pontuação de 10. De uma pontuação total de 0 a 10, identificam os participantes como ECPs (0-3), ICPs (4-6) e LCPs (7-10).
3. A partir do escore total, as subcategorias de fenótipos circadianos podem ser determinadas da seguinte forma: 0 = ECP extremo, 1 = ECP definido, 2 = ECP moderado, 3 = ECP leve, 4 = ICP precoce, 5 = ICP, 6 = ICP tardio, 7 = LCP leve, 8 = LCP moderado, 9 = definitivo.
   NOTA: A análise estatística deve ser determinada com base nas questões de pesquisa para estudos individuais. Os testes não paramétricos devem ser utilizados quando os dados não seguem uma distribuição normal. Os testes pós-hoc devem ser executados para determinar a hora dos efeitos do dia. Ao medir uma série de parâmetros, devem ser feitas correções adicionais de múltiplas comparações (por exemplo, correção de valores p do FDR).

Resultados

Esses resultados em ECPs e LCPs já foram publicados anteriormente por Facer-Childs, Campos, et al.²³. Todas as permissões foram obtidas do editor. Para estudos que exijam uma investigação dos três grupos (Precoce, Intermediário e Tardio), os mesmos métodos e cortes podem ser utilizados.

Fenotipagem circadiana (Tabela 1, Tabela 2 e Figura 1)
A primeira hipótese apresentada neste artigo é que os grupos difeririam significativamente no sono e nas variáveis circadianas. Dos participantes (n = 22) que participaram deste estudo, aqueles que foram categorizados como ECPs tiveram pontuação entre 0-1 e todos os LCPs entre 8-10 (cortes dado na Tabela 1). Para confirmar esses resultados, foram comparadas as médias de grupo para cada variável. O valor_de 02:24 ± 00:10 h para ECPs em comparação com 06:52 ± 00:17 h em LCPs (t(36) = 12,2, p < 0,0001). Os marcadores fisiológicos também diferem significativamente entre os dois grupos. O DLMO ocorreu às 20:27 ± 00:16 h em ECPs e às 23:55 ± 00:26 h em LCPS (t(30) = 6,8, p < 0,0001). O horário máximo da resposta ao despertar do cortisol ocorreu às 07:04 ± 00:16 h em ECPs e 11:13 ± 00:23 h em LCPs (t(36) = 8,0, p < 0,0001). As mesmas relações foram observadas com variáveis actigráficas para início do sono e tempo de vigília com início médio do sono ocorrendo às 22:57 ± 00:10 h em ECPs e 02:27 ± 00:19 h em LCPs (t(34) = 8,9, p < 0,0001) e acordar ocorrendo às 06:33 ± 0,10 h em ECPs e 10:13 ± 00:18 h em LCPs (t(34) = 9,9, p < 0,0001). Outras variáveis de sono, incluindo duração, eficiência e latência, não diferiram significativamente entre os grupos(Tabela 2).

A segunda hipótese é que o_SC cestou do MCTQ estaria significativamente correlacionado com os biomarcadores de fase actigráfica e circadiana padrão-ouro. A Figura 1 mostra que_{o SC do} MSF foi significativamente correlacionado com o DLMO (R² = 0,65, p < 0,0001), horário de pico da resposta ao despertar do cortisol (R² = 0,75, p < 0,0001), início do sono (R² = 0,80, p < 0,0001) e tempo de vigília (R² = 0,86, p < 0,0001).

Esses resultados representativos mostram que os diferentes grupos de fenótipo circadiano têm diferenças claras no início/deslocamento do sono (ou seja, hora de acordar), bem como em variáveis fisiológicas (DLMO e horário de pico do cortisol matinal).

Teste diurno(Figura 2)
Foi hipótese de que, ao testar várias vezes ao longo do dia, ritmos diurnos em sonolência subjetiva e desempenho poderiam ser identificados em cada grupo (ECPs/LCPs). Além disso, foi hipótese de que se os fenótipos circadianos não fossem considerados e os dados fossem analisados apenas em um nível de grupo inteiro, então as variações diurnas seriam deturpadas.

Variações diurnas significativas foram encontradas em todo o nível de grupo para o PVT e KSS. O desempenho do PVT na sessão de teste das 08:00h foi significativamente mais lento do que o teste das 14:00h(p = 0,027), assim como sonolência subjetiva (p = 0,024). O desempenho de PvT significativamente mais lento também foi encontrado entre 08:00 h e 20:00 h (p = 0,041).

Quando cada grupo foi analisado separadamente, variações diurnas significativas no desempenho de TP foram encontradas em LCPs, mas não em ECPs. Os LCPs foram significativamente piores às 08:00h em comparação com 14:00h(p = 0,0079) e melhores às 20:00 h em comparação às 08:00 h(p = 0,0006). A sonolência subjetiva apresentou variações diurnas significativas dentro de cada grupo. Os ECPs relataram maior sonolência às 20:00h em comparação com as 08:00h (p = 0,0054). O oposto foi observado nos LCPs que relataram maior sonolência às 08:00h e menor às 20:00 h. A sonolência às 08:00h foi significativamente maior que as 14:00h e 20:00 h nos LCPs (ambos p < 0,0001).

Figura 1: Análise de regressão linear para mostrar relações entre variáveis de sono/vigília utilizando actigrafia e biomarcadores fisiológicos. O sono médio corrigido em dias livres (MSF_sc) é exibido como hora do dia (h) no eixo x. Os primeiros fenótipos circadianos (ECPs) são mostrados na caixa azul, fenótipos circadianos tardios (LCPs) na caixa vermelha. (a) Tempo de pico da resposta ao despertar do cortisol (h),(b)Tempo de vigília (h),(c)Início de melatonina de luz fraca (DLMO) (h),(d) Tempo de início do sono (h). O valor de R² é mostrado no canto inferior direito com nível de significância exibido em **** = p < 0,0001. Esta figura foi modificada, com permissão, do Facer-Childs, et al.²³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Curvas de variações diurnas em Escala de Sonolência Karolinska e Trabalho de Vigilância Psicomotora (PVT). A hora do dia (h) é mostrada no eixo x. Os resultados do grupo inteiro são mostrados na primeira coluna, fenótipos circadianos iniciais (ECPs) na segunda coluna e fenótipos circadianos tardios (LCPs) na terceira coluna. (a) Pontuação de sonolência subjetiva (KSS),(b)Tempo de reação de PVT (s). Foram instaladas curvas de regressão polinomial de segunda ordem não-lineares. O nível de significância é mostrado como ns (não significativo), * (p < 0,05), **(p < 0,01), ***(p < 0,001) e ****(p < 0,0001). Esta figura foi modificada, com permissão, do Facer-Childs, et al.²³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Variável medida	Categoria ECP	Categoria ICP	Categoria LCP
Hora de acordar actigráfico	< 07:30 h	07:31 - 08:29 h	> 08:30 h
Horário de pico do cortisol matinal	< 08:00	08:01 - 08:59 h	> 09:00 h
Início de melatonina de luz fraca (DLMO)	< 21:30 h	21:31 - 22:29 h	> 22.30 h
Início do sono actigráfico	< 23:30 h	23:31 - 00:29 h	> 00:30 h
Sono médio corrigido em dias livres (MSFsc)	< 04:00 h	04:01 - 04:59 h	> 05:00 h
Pontuação por variável	0	1	2
PONTUAÇÃO TOTAL	0 - 3	4 - 6	7 - 10
Subcategorias	0 = PCE extrema 1 = ECP definido 2 = PCE moderada 3 = PcE leve	4 = ICP precoce 5 = ICP 6 = ICP tardio	7 = LCP leve 8 = LCP moderado 9 = LCP definido 10 = LCP extremo

Tabela 1: Cortes de categorização para fenotipagem circadiana em grupos Early (ECP), Intermediário (ICP) e Late (LCP). Cada variável é alocada uma pontuação por participante, dependendo do resultado e os escores totais (0-10) permitem a categorização em cada grupo e em cada subcategoria.

Variável Medida	Pces	LCPs	Significado
Tamanho da amostra	N = 16	N = 22	n/a
Número de machos/fêmeas	M = 7	M = 7	p = 0,51c
	F = 9	F = 15
Idade (anos)	24,69 ± 4,60	21,32 ± 3,27 anos	p = 0,028a
Altura (cm)	171,30 ± 1,97	171,10 ± 2,38	p = 0,97a
Peso (kg)	66,44 ± 2,78	67,05 ± 2,10	p = 0,88a
MSFsc (hh:mm)	02:24 ± 00:10	06:52 ± 00:17	p < 0,0001a
Início do sono (hh:mm)	22:57 ± 00:10	02:27 ± 00:19	p < 0,0001a
Hora de despertar (hh:mm)	06:33 ± 0,10	10:13 ± 00:18	p < 0,0001a
Duração do sono (h)	7,59 ± 0,18	7,70 ± 0,14	p = 0,72a
Eficiência do sono (%)	79,29 ± 1,96	77,23 ± 1,14	p = 0,46a
Latência de início de sono (hh:mm)	00:25 ± 00:06	00:25 ± 00:03	p = 0,30b
Ângulo de fase (hh:mm)	02:28 ± 00:16	02:34 ± 00:18	p = 0,84a
Início de melatonina dim light (hh:mm)	20:27 ± 00:16	23:55 ± 00:26	p < 0,0001a
Tempo de pico de cortisol (hh:mm)	07:04 ± 00:16	11:13 ± 00:23	p < 0,0001a

Tabela 2: Variáveis de estudo para grupos fenótipos circadianos; Precoces (ECPs) e Atrasados (LCPs). Os valores são mostrados como média ± SEM além da idade que é mostrada como média ± SD. O sono médio corrigido em dias livres (MSFsc) é calculado a partir do MCTQ. Os tipos de testes estatísticos utilizados são mostrados em sobrescrito; testes paramétricos^a,testes não paramétricos^b e teste exato de Fisher^c. O ângulo de fase é determinado pela diferença (h) entre o início da melatonina de luz fraca (DLMO) e o início do sono. Todos os valores p são FDR corrigidos²⁴. Esta tabela foi modificada, com permissão, do Facer-Childs, et al.²³.

Discussão

Devido à complexa interação das influências circadianas e dependentes do sono no comportamento, explorar as contribuições relativas de cada um é desafiador. Os protocolos baseados em laboratório são em grande parte irrealistas e caros, portanto, possuem pior validade externa ao relacionar resultados com o funcionamento diário²⁵. Portanto, há uma necessidade crescente de estudar os indivíduos em seu ambiente doméstico para promover a generalização de contextos do mundo real. Embora os estudos de campo não permitam o controle de influências exógenas, uma abordagem integrada pode ajudar a esclarecer como fatores biológicos e ambientais afetam a saúde, a fisiologia e o desempenho^23,26,27. Este protocolo foi projetado especificamente para ser capaz de monitorar os indivíduos em seu ambiente doméstico enquanto segue suas rotinas habituais. Esses protocolos de amostragem de saliva foram realizados com sucesso em cenários desafiadores como o Amazon²⁸ e o Antártico^29, apoiando a facilidade de condução deste protocolo.

Os questionários são uma ferramenta útil no sono e estudos circadianos, pois permitem uma maneira rápida e simples de reunir uma ampla gama de informações. No entanto, as discrepâncias entre medidas subjetivas e objetivas podem criar dificuldades na tentativa de estudar diferenças individuais. Portanto, ser capaz de coletar múltiplas medidas subjetivas e objetivas pode fortalecer a categorização de grupos fenótipos circadianos. Essa combinação de métodos - MCTQ, actigrafia, amostragem fisiológica e testes de desempenho - tem destacado como os resultados podem ser mal interpretados se as diferenças individuais nos fenótipos circadianos não forem consideradas. A medição de todas essas variáveis fornece a categorização mais confiável dos grupos de fenótipo circadiano, no entanto, há potencial para desenvolver o método ainda mais para permitir menos requisitos. Por exemplo, embora a confiabilidade ainda seja investigada, para reduzir o custo, os pesquisadores poderiam remover a etapa de amostragem de cortisol ou usar um questionário diferente. Vale ressaltar, no entanto, que como o DLMO é um marcador padrão-ouro atual para o tempo circadiano e a actigrafia é um método padrão para monitorar padrões de repouso/atividade, essas seriam variáveis essenciais para incluir nas avaliações.

Agendar testes de desempenho com base nos tempos de relógio em vez de basear tempos relativos ao indivíduo (tempo biológico interno) aumenta a viabilidade e permite que o protocolo seja aplicado em configurações do mundo real. Uma limitação deste desenho, no entanto, é a incapacidade de determinar a influência do sistema circadiano versus influências homeostáticas. Isso se torna um desafio, pois não há como confirmar mecanismos específicos que contribuam para os resultados. No entanto, uma vez que o objetivo deste protocolo é investigar esses grupos em um cenário real, a redução dos mecanismos dependentes do sono minimizaria a validade externa dos resultados. Pode-se argumentar, portanto, que o uso de um método integrado é mais aplicável e mais viável para estudos de campo.

As medidas diretas de desempenho são altamente relevantes para a sociedade, mas parece que, sem levar em consideração os múltiplos fatores influenciadores, especialmente a necessidade de agrupar os indivíduos de acordo com seu fenótipo circadiano e pressão do sono, estudos podem estar perdendo resultados-chave.

Como discutido, o PVT e o KSS têm sido amplamente utilizados em muitos campos de pesquisa. A simplicidade do PVT e a flexibilidade na duração da tarefa torna-o um teste atraente para usar em estudos circadianos e de restrição do sono que requerem múltiplos tempos de teste, e tem se mostrado um marcador sensível de privação do sono^30,31. Embora a precisão do teste e os tempos gerais de reação aumentem com a duração da tarefa, as tarefas pvt de 2 min, 5 min e 10 min mostram a hora semelhante das relações diárias³².

Nosso design de protocolo pode ser implementado usando uma gama de diferentes tarefas de desempenho e em pontos de tempo mais freqüentes, se necessário. Estudos anteriores mostraram efeitos do tempo do dia em métricas de desempenho físico e cognitivo, como capacidade aeróbica¹⁵ e função executiva²⁵. A implementação desse protocolo e a contabilização das diferenças individuais aumentarão a compreensão de como estudar os mecanismos que contribuem para o desempenho, especialmente em ambientes mais nichos, como esportes de elite. Em resumo, este protocolo permite uma avaliação real do fenótipo circadiano e fornece uma visão sobre como medir o impacto da hora do dia no desempenho.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actiwatch Light	Cambridge Neurotech Ltd		Various different validated actigraph devices can be used depending on what is required
Sleep Analysis 7 Software	Cambridge Neurotech Ltd		Various different validated software can be used depending on what is required
7 ml plastic bijous			Various different tubes or salivettes can be used depending on what is required
DQ67OW, Intel Core i7-2600 processor, 4GB RAM, 32-bit Windows 7			Various different devices can be used depending on what is required