Fenotipizzazione corporea umana e test delle prestazioni diurne nel mondo reale

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per studiare i ritmi diurni nelle prestazioni seguendo una categorizzazione accurata dei partecipanti in gruppi di fenotipi circadiani basati sul questionario chronoType di Monaco, biomarcatori di fase circadiana standard d'oro e misure actigrafiche.

Abstract

Nella nostra società in continuo sviluppo '24 ore su 24', c'è la necessità di aumentare la nostra comprensione di come i cambiamenti in biologia, fisiologia e psicologia influenzano la nostra salute e le nostre prestazioni. Incorporato all'interno di questa sfida, è la crescente necessità di tenere conto delle differenze individuali nel sonno e nei ritmi circadiani, nonché di esplorare l'impatto dell'ora del giorno sulle prestazioni nel mondo reale. Ci sono diversi modi per misurare il sonno e i ritmi circadiani da metodi soggettivi basati su questionari al monitoraggio oggettivo sonno/veglia, attività e analisi di campioni biologici. Questo documento propone un protocollo che combina più tecniche per classificare gli individui in gruppi di fenotipi circadiani early, Intermediate o late (ECP/IP/LCP) e raccomanda come condurre test di performance diurni sul campo. I risultati rappresentativi mostrano grandi differenze nei modelli di attività di riposo derivati dall'attivigrafia, fase circadiana (insorgenza di luce dim e tempo di picco della risposta di risveglio del cortisolo) tra i fenotipi circadiani. Inoltre, differenze significative nei ritmi di prestazione diurni tra ECP e LCP sottolineano la necessità di tenere conto del fenotipo circadiano. In sintesi, nonostante le difficoltà nel controllare i fattori di influenza, questo protocollo consente una valutazione reale dell'impatto del fenotipo circadiano sulle prestazioni. Questo documento presenta un metodo semplice per valutare il fenotipo circadiano sul campo e supporta la necessità di considerare l'ora del giorno durante la progettazione di studi di prestazioni.

Introduzione

A livello comportamentale, la valutazione dei modelli individuali di riposo/attività può essere effettuata utilizzando metodi soggettivi basati su questionari o un monitoraggio oggettivo attraverso l'attivigrafia del polso. I dati attivici sono stati convalidati contro la polisonnografia (PSG) per vari parametri di sonno, tra cui: tempo totale di sonno, efficienza del sonno e veglia dopo l'inizio del sonno¹. Anche se il PSG è noto come il gold standard per misurare il sonno, è difficile da usare per periodi prolungati al di fuori del laboratorio del sonno². Pertanto, le attività sono destinate a fornire un'alternativa semplice e più conveniente al PSG e consentire il monitoraggio del modello di riposo/attività di 24 ore. Le misure soggettive di auto-segnalazione possono definire il proprio "cronotipo" utilizzando il questionario MCTType (MCTQ)³di Monaco utilizzando il questionario Morningness-Eveningness Questionnaire (MEQ)⁴. I gruppi alle due estremità di questo spettro possono essere indicati come fenotipi circadiani primitivi (ECP) e fenotipi circadiani tardivi (LCP) con quelli intermedi come fenotipi circadiani intermedi (IP).

Sebbene eCP e LCP siano chiaramente distinguibili attraverso il loro comportamento (cioè i modelli di sonno/veglia), queste differenze individuali sono anche in parte guidate da variazioni nella fisiologia⁵ e nella predisposizione genetica^6,7. I biomarcatori fisiologici sono spesso utilizzati per determinare la fase/timing circadiano di un individuo. Due dei principali ormoni indicativi di tempista circadiano sono la melatonina, che sale la sera per raggiungere un picco nel bel mezzo della notte, e cortisolo, che raggiunge il picco al mattino⁸. Utilizzando questi marcatori di fase circadiana, le differenze individuali nei modelli sonno-veglia sono in grado di essere identificate. Ad esempio, l'insorgenza di melatonina dim luce (DLMO)^9,10 e il tempo di risposta al risveglio del cortisolo^11,12 picco più indietro in ECP, che è rispecchiato dal ritmo circadiano della temperatura corporea del nucleo¹³. La saliva consente una raccolta facile, sicura e non invasiva da cui questi ormoni possono essere analizzati mediante radioimmunoassay (RIA) o analisi immunosorbenaria legata agli enzimi (ELISA) senza la necessità di estrarre alcun materiale cellulare. RIA ed ELISA sono saggi sensibili e specifici che rilevano concentrazioni di antigeni in campioni biologici (ad esempio, sangue, plasma o saliva), attraverso reazioni antigene-anticorpo che coinvolgono isotopi radioetichettati (ad esempio, iodio (¹²⁵I) o anticorpi collegati agli enzimi¹⁴).

Protocolli di laboratorio rigorosamente controllati come la routine costante (CR) e la desynchrony forzata (FD) sono il gold standard nel campo della cronobiologia per studiare i ritmi circadiani endogeni¹⁵. Tuttavia, c'è una crescente necessità di studiare gli individui nel loro ambiente domestico al di fuori delle impostazioni di laboratorio artificiali per raccogliere dati contestuali e aumentare la validità esterna dei risultati. Pertanto, abbiamo bisogno di modi migliori per classificare, misurare e valutare le differenze individuali nel campo. Inoltre, le variazioni diurne in varie misure di fisico (capacità aerobica, forza muscolare) e cognitivo (tempo di reazione, attenzione sostenuta, funzione esecutiva) prestazioni sono state scoperte con ECP che svolgono meglio in precedenza nel corso della giornata e LCP in serata^16,17. Questo sottolinea che l'ora del giorno e il fenotipo circadiano dovrebbero essere fattori che vengono considerati quando si effettuano test di prestazioni in studi di ricerca.

Il numero di diverse misure e protocolli utilizzati negli studi di laboratorio consente di implementare condizioni altamente controllate. Gli studi sul campo tendono ad essere più impegnativi a causa del numero di fattori di influenza. Pertanto, utilizzando un approccio più olistico combinando più tecniche può fornire una maggiore precisione durante il monitoraggio del comportamento, della psicologia e delle prestazioni di un individuo nel loro ambiente domestico¹⁸. Qui, discutiamo di un metodo che può essere facilmente implementato nel campo per identificare le differenze individuali nei fenotipi circadiani utilizzando il MCTQ, l'attivigrafia e i biomarcatori fisiologici. Ipotizziamo che queste variabili differiranno in modo significativo tra i gruppi di fenotipi circadiani e saranno significativamente correlate con il cronotipo (o corretto a metà sonno nei giorni liberi (MSF_sc) raccolti dall'MCTQ). Inoltre, suggeriamo modi per misurare le prestazioni diurne, evidenziando la necessità di analizzare i dati separatamente per ogni gruppo di fenotipi circadiano. Ipotizziamo che le differenze nei ritmi delle prestazioni diurne saranno oscurate se i dati vengono analizzati solo a livello di popolazione.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato Etico di ricerca dell'Università di Birmingham.

1. Screening dei partecipanti e progettazione sperimentale

1. Eseguire tutti i metodi seguendo le approvazioni etiche appropriate, in conformità con la dichiarazione di Helsinki e ottenere il consenso informato scritto da tutti i partecipanti prima di qualsiasi coinvolgimento.
2. Recluta recome i partecipanti senza diagnosi precedenti di sonno, disturbi neurologici o psichiatrici, e senza prendere farmaci che influenzano il sonno, melatonina o ritmi cortisolo.
3. Assicurarsi che nessun partecipante sia turnista, che i partecipanti non abbiano viaggiato più di due fusi orari nell'ultimo mese e siano liberi di partecipare allo studio (vale a dire, in grado di impegnarsi a indossare l'actiwatch, dare campioni di saliva in un "giorno libero" ed essere presenti per il test delle prestazioni in orari specifici (vedi sezione 2.1)).
4. Invitare i partecipanti che superano i criteri di inclusione a partecipare a una riunione iniziale per ottenere il consenso, raccogliere i dati del questionario, ricevere formazione nella raccolta di campioni di saliva a casa ed essere istituiti con un dispositivo actigrafico e un diario del sonno. In questa riunione, familiarizza i partecipanti con i protocolli di campionamento fisiologico per assicurarsi che comprendano ciò che è necessario (vedi sezione 3).
5. Chiedere ai partecipanti di completare il questionario di Monaco chronoType (MCTQ), che valuta le differenze individuali nelle variabili sonno/veglia e l'esposizione alla luce sul lavoro e nei giorni liberi³. Ciò consente il calcolo dei tempi di sonno medio corretti nei giorni liberi (MSF_sc), utilizzato come marcatore del cronotipo.

2. Agrafia e diari del sonno

1. Per almeno due settimane¹⁹ (possono essere periodi di tempo più lunghi a seconda degli obiettivi dello studio), chiedere ai partecipanti di indossare un monitor per l'attività del polso o un "actigraph", per raccogliere modelli di riposo/attività e dati di luce (1-32.000 lux) durante tutto il periodo di studio.
2. Fornire a ogni partecipante i dettagli su come utilizzare gli attivi, inclusa la rimozione per la balneazione / doccia (se non impermeabile) e la prevenzione delle maniche che li coprono per consentire la raccolta di dati leggeri. Assicurarsi che gli attivi siano indossati sul polso non dominante.
3. In combinazione con l'attività e per facilitare l'analisi sonno/veglia derivata dai dati attivi, dare a ogni partecipante un diario del sonno per completare su base giornaliera. Assicurati che le domande poste includano l'ora di andare a dormire, i tempi di sonno, i risvegli notturni, gli orari di sveglia, la qualità del sonno, i sonnellini e gli orari in cui gli attivi sono stati rimossi.
4. Raccogliere i dati di attività per l'analisi di riposo/attività che esegono i parametri in base a quanto richiesto (questo studio ha utilizzato una frequenza di campionamento a 30 Hz e un'impostazione di sensibilità media). Estrarre i dettagli dell'ora di coricarsi quotidianamente e alzarsi i tempi dai diari del sonno e l'input al software del produttore o all'alternativa (ad esempio, codice convalidato open source per ottenere variabili attigrafiche rilevanti per lo studio).

3. Campionamento fisiologico

1. Pre-preparare i pacchetti di campionamento etichettando i tubi di raccolta del polipropilene o le salivette (utilizzare bijou di plastica da 7 mL in questo studio). Etichettare i tubi con il numero ID del partecipante, la mattina o la sera e i singoli numeri di campionamento. Includere un tubo "spare" da utilizzare in caso di errori.
2. Preparare un foglio di registrazione della raccolta di esempio per entrambi i protocolli mattutini e serali per consentire ai partecipanti di utilizzare il timestamp quando vengono prelevati i campioni (ad esempio, Esempio di mattina 1, Tempo prelevato: hh:mm, Esempio di mattina 2, Tempo impiegato: hh:mm). Includere il numero ID del partecipante, la data per le informazioni stagionali e la posizione per il calcolo del fotoperiodo.
   NOTA: È fondamentale che il tempo militare venga utilizzato per garantire che non vi siano problemi con AM/PM. Etichette colorate diverse per tubi di campionamento mattutini e serali possono essere utilizzati anche per distinguere tra i campioni.
3. Fornire ai partecipanti i protocolli pertinenti per il campionamento fisiologico e i pacchetti pre-fatti durante l'allenamento di come prelevare campioni di saliva nel loro ambiente di casa/lavoro.
4. Informare il partecipante che i campioni devono essere raccolti in un giorno libero in cui i partecipanti sono in grado di andare a letto e svegliarsi agli orari preferiti (cioè senza la necessità di un allarme). Per garantire un calcolo affidabile del DLMO, i partecipanti non devono eseguire il protocollo di campionamento della saliva serale il giorno prima del test delle prestazioni a causa della necessità di rimanere svegli oltre l'ora di andare a dormire abituale.
5. Chiedere ai partecipanti di assegnare una mattina e una sera (lo stesso giorno) durante la seconda settimana dello studio quando sono in grado di impegnarsi a dare i campioni di saliva. Consiglia ai partecipanti di raccogliere campioni mattutini seguiti da campioni serali nello stesso giorno.
   NOTA: L'ordine di campionamento (mattina e sera) deve essere seguito per garantire che eventuali cambiamenti nella tempistica del sonno non influiscano sui risultati (se i campioni serali vengono prelevati prima che richiedono di rimanere svegli oltre l'ora di andare a dormire abituale, questo potrebbe influenzare i campioni mattutini se prelevati il giorno successivo).
6. Protocollo di campionamento mattutino per la risposta al risveglio del cortisolo
   1. Assicurarsi che i campioni di saliva siano raccolti al punto di prima risveglio (mentre sono ancora a letto), ogni 15 min per la prima ora e poi ogni 30 min per i prossimi 1 a 2 h. Raccogliere campioni di saliva sputando nella fiala opportunamente etichettata (a partire da N. 1, 2, 3, ecc.).
   2. Durante questo periodo, assicurarsi che i partecipanti: astenersi da bevande alcoliche, bevande contenenti coloranti artificiali e cibo per il periodo di test e astenersi dalla pulizia dei denti, con o senza dentifricio durante il periodo di campionamento.
   3. Una volta che tutti i campioni sono stati forniti, assicurarsi che i partecipanti memorizzino i loro campioni nel loro congelatore a -20 gradi centigradi fino alla raccolta da parte del team di ricerca.
      NOTA: È meglio conservare i campioni congelati se possibile, ma rimarranno vitali se conservati in frigorifero fino alla raccolta del giorno successivo. Ai sensi dell'Human Tissue Act (HTA) 2004, i campioni devono essere raccolti ed elaborati entro sette giorni dalla raccolta per renderli acellulari, a meno che l'Istituzione non sia detenuta da una licenza HTA da parte dell'Istituzione che esegue l'analisi.
7. Protocollo di campionamento serale per l'insorgenza di melatonina dim luce
   1. Assicurarsi che i campioni di saliva vengano raccolti ogni 30 min da 3 a 4 h prima dell'ora di andare a dormire abituale fino a 1 a 2 h dopo l'ora di andare a dormire abituale (ad esempio, se l'ora di andare a dormire abituale è 22:00 h, il partecipante inizierà alle 18:00/19:00 h fino alle 23:00:00 h). Raccogliere campioni di saliva sputando nella fiala opportunamente etichettata (a partire da n. 1 poi 2, 3, ecc.).
   2. Durante questo periodo, assicurarsi che i partecipanti astenersi da bevande contenenti caffeina (ad esempio, tè, caffè, coca-cola) da 6 h prima dell'ora di andare a dormire abituale (ad esempio, se l'ora di dormire abituale è 22:00 h, il consumo di caffeina dovrebbe fermarsi alle 16:00 h del giorno di raccolta).
   3. Assicurarsi che i partecipanti rimangano seduti all'interno in luce fioca (< 10 lux, ad esempio, una singola lampada da tavolo preferibilmente luce rossa, dall'altra parte della stanza, senza luci aeree, senza schermi elettronici, tende chiuse). Assicurarsi che i partecipanti evitino di bere bevande contenenti alcool o coloranti artificiali e si astengano dalla pulizia dei denti, con o senza dentifricio, durante il periodo di campionamento.
   4. Se i partecipanti desiderano mangiare qualcosa, andare in bagno o fare una bevanda senza caffeina, assicurarsi di farlo subito dopo la raccolta di un campione e cercare di essere seduti di nuovo per 15 min prima che il campione successivo deve essere raccolto. Se il cibo viene consumato tra i campioni, assicurarsi che i partecipanti si lavano la bocca con acqua 15 minuti prima della raccolta del campione successivo.
   5. Assicurarsi che tutte le altre stanze abbiano le stesse condizioni di luce in modo che il partecipante rimanga in condizioni di scarsa illuminazione (preferibilmente a luci rosse) per tutta la durata del periodo di campionamento.
   6. Una volta che tutti i campioni sono stati forniti, assicurarsi che i partecipanti memorizzino i loro campioni nel loro congelatore a -20 gradi centigradi fino alla raccolta da parte del team di ricerca.
      NOTA: È fondamentale che i partecipanti aderiscano al protocollo della luce fioca. Ove possibile, i ricercatori dovrebbero misurare le condizioni di luce al fine di monitorare l'intensità e la composizione spettrale.

4. Radioimmunoassay

1. Eseguire RIA o ELISA di melatonina e cortisolo nella saliva umana per determinare le concentrazioni relative ad ogni punto di tempo.
   NOTA: La procedura descritta in questi risultati rappresentativi ha utilizzato RIA con un tracciante radioattivo⁽¹²⁵I) e separazione di fase solida. Questo protocollo è impiegato regolarmente nel Laboratorio di Cronobiologia, Università del Surrey, UK²⁰.
2. Calcolare i singoli DLMO come punto temporale in cui la concentrazione di melatonina supera due deviazioni standard delle tre misure di base (i primi tre campioni).
   NOTA: questo metodo viene regolato in base alle differenze di base individuali rispetto all'utilizzo di una concentrazione forfettaria¹⁴. Altri metodi possono essere utilizzati a seconda dei punti temporali utilizzati nel campionamento (ad esempio, per un periodo di 24 ore per un profilo completo¹⁴).
3. Calcolare il picco di cortisolo come il momento della più alta concentrazione di cortisolo registrato durante la risposta di risveglio del cortisolo del mattino.

5. Test delle prestazioni diurne

NOTA: Le misure utilizzate in questo protocollo sono la Psicomotoria Vigilance Task (PVT)²¹e la Karolinska Sleepiness Scale (KSS)²². Tuttavia, altri test potrebbero essere utilizzati mantenendo lo stesso disegno a seconda dello scopo dello studio (ad esempio, se lo studio stava studiando l'impatto del fenotipo circadiano sulla memoria di lavoro, sarebbe necessario un compito di memoria).

1. Chiedere ai partecipanti di eseguire almeno uno (a seconda del compito) prova pratica durante la settimana prima di testare se stessi con la configurazione.
   NOTA: le prove di pratica possono essere eseguite in remoto se monitorate. Il numero di prove pratiche deve essere adattato in base ai compiti utilizzati nello studio. Ad esempio, un'attività di funzione esecutiva più complessa può richiedere una serie di test di pratica per raggiungere un plateau rispetto a un'attività più semplice.
2. Organizzare le sessioni di test in base alle ipotesi di studio in base al numero di punti temporali studiati in orari specifici.
   NOTA: A seconda del progetto dello studio, i test delle prestazioni possono essere condotti a casa o in laboratorio. A causa della natura sensibile al tempo del protocollo, se il test delle prestazioni viene eseguito nell'ambiente domestico, la conformità deve essere monitorata per garantire che i partecipanti lo conducano da soli, oltre a essere contrassegnati con data e ora.
3. Condurre test su un dispositivo rilevante (questo studio ha utilizzato un processore DQ67OW, i7-2600, 4 GB di RAM, desktop a 32 bit con una tastiera e un mouse standard).
   NOTA: se per il test sono necessari un laptop, un iPad o un altro dispositivo, assicurarsi che lo stesso dispositivo e le stesse impostazioni vengano utilizzate in tutto lo studio per tutti i partecipanti e per ogni sessione di test a causa della potenziale variabilità delle risposte da un mouse rispetto al track pad rispetto al touch screen.

6. Analisi

1. Classificare i gruppi di fenotipi circadiani in base al loro valore per le cinque variabili raccolte: MSF_sc, tempo di veglia, ora di punta della risposta al risveglio del cortisolo, DLMO e sospensione (le sezioni sono riportate nella tabella 1).
2. Allocare un punteggio per variabile per ogni partecipante. Una variabile viene allocata 0 se rientra nella categoria ECP, 1 se rientra nella categoria ICP e 2 se rientra nella categoria LCP. Ad esempio, se un partecipante fa parte della categoria LCP per tutte le variabili, accumulerebbe un punteggio pari a 10. Su un punteggio totale da 0-10 identificano i partecipanti come ECP (0-3), IP (4-6) e LCP (7-10).
3. Dal punteggio totale, le sottocategorie dei fenotipi circadiani possono essere determinate come segue: 0 , Extreme ECP, 1 , ECP definito, 2 , ECP moderato, 3 , Lieve ECP, 4 - ICP precoce, 5 - ICP, 6 - ICP tardivo, 7 - Lieto LCP, 8 - LCP moderato, 9 - definito.
   NOTA: L'analisi statistica deve essere determinata sulla base delle domande di ricerca per i singoli studi. I test non parametrici devono essere utilizzati quando i dati non seguono una distribuzione normale. I test post hoc devono essere eseguiti per determinare gli effetti dell'ora del giorno. Quando si misura un certo numero di parametri, devono essere eseguite ulteriori correzioni di confronti multipli (ad esempio, la correzione FDR dei valori p).

Risultati

Questi risultati in ECP e LCP sono stati precedentemente pubblicati da Facer-Childs, Campos, et al.²³. Tutte le autorizzazioni sono state ottenute dal server di pubblicazione. Per gli studi che richiedono un'indagine di tutti e tre i gruppi (Early, Intermediate e Late), possono essere utilizzati gli stessi metodi e tagli.

Fenotipizzazione circadiana (tabella 1, tabella 2 e figura 1)
La prima ipotesi presentata in questo articolo è che i gruppi differirebbero in modo significativo nelle variabili circadiane e del sonno. Dai partecipanti (n - 22) che hanno partecipato a questo studio, quelli che sono stati classificati come ECP avevano un punteggio compreso tra 0-1 e tutti i LCP tra 8-10 (tagli forniti nella tabella 1). Per confermare questi risultati, le medie di gruppo sono state confrontate per ogni variabile. MSF_sc era 02:24 - 00:10 h h per gli ECP rispetto a 06:52 - 00:17 h in LCP (t(36) - 12.2, p < 0.0001). Anche i marcatori fisiologici differivano in modo significativo tra i due gruppi. DLMO si è verificato alle 20:27 x alle 00:16 h negli ECP e alle 23:55 , alle 00:26 h in LCPS (t(30) - 6,8 , p < 0.0001). L'ora di punta della risposta di risveglio del cortisolo si è verificata alle 07:04 x 00:16 h negli ECP e alle 11:13 x 00:23 h negli LCP (t(36) - 8,0, p < 0,0001). Le stesse relazioni sono state osservate con variabili actigrafiche per l'esordio del sonno e per l'esordio del sonno con esordio medio del sonno che si verificano a 22:57 x 00:10 h negli ECP e 02:27 - 00:19 h in LCP (t(34) - 8,9, p < 0.0001) e il tempo di riattivazione che si trova alle 06:33 , 0,10 h negli ECP e alle 10:13 , 00:18 h negli LCP (t(34) - 9,9, p < 0,0001). Altre variabili di sospensione, tra cui durata, efficienza e latenza, non differivano in modo significativo tra i gruppi(Tabella 2).

La seconda ipotesi è che MSF_sc raccolto dal MCTQ sarebbe significativamente correlato con i biomarcatori di fase agiscografici e circadiani standard d'oro. La figura 1 mostra che MSF_sc era significativamente correlata con dLMO (R² - 0,65, p < 0.0001), ora di punta della risposta di risveglio del cortisolo (R² - 0,75, p < 0.0001), sospensione (R² - 0,80, p < 0.0001) e tempo di riattivazione (R² - 0,86, p < 0.0001).

Questi risultati rappresentativi mostrano che i diversi gruppi di fenotipi circadiani hanno chiare differenze nell'inizio/offset del sonno (cioè il tempo di veglia), nonché nelle variabili fisiologiche (DLMO e ora di punta del cortisolo mattutino).

Test diurni (Figura 2)
È stato ipotizzato che testando più volte nel corso della giornata, i ritmi diurni nella sonnolenza soggettiva e nelle prestazioni sarebbero stati in grado di essere identificati in ogni gruppo (ECP/LCP). Inoltre, si ipotizzava che se i fenotipi circadiani non fossero considerati e i dati fossero analizzati solo a livello di gruppo, le variazioni diurne sarebbero state travisate.

Variazioni diurne significative sono state rilevate a tutto il livello di gruppo per il PVT e il KSS. Le prestazioni del PVT nella sessione di test 08:00 h sono state significativamente più lente rispetto al test di 14:00 h (p - 0,027), così come sonnolenza soggettiva (p - 0,024). Sono state rilevate anche prestazioni PVT significativamente più lente tra le 08:00 h e le 20:00 h (p - 0,041).

Quando ogni gruppo è stato analizzato separatamente, sono state rilevate variazioni significative delle prestazioni PVT negli LCP, ma non negli ECP. Gli LCP sono stati significativamente peggiori alle 08:00 h rispetto alle 14:00 h (p s 0,0079) e migliori a 20:00 h rispetto alle 08:00 h(p - 0,0006). La sonnolenza soggettiva ha mostrato variazioni diurne significative all'interno di ogni gruppo. Gli ECP hanno segnalato una sonnolenza maggiore a 20:00 h rispetto alle 08:00 h (p x 0,0054). L'opposto è stato osservato negli LCP che hanno riportato la più alta sonnolenza a 08:00 h e più basso a 20:00 h. Sonnolenza a 08:00 h era significativamente superiore a 14:00 h e 20:00 h in LCP (entrambi p < 0.0001).

Figura 1: Analisi di regressione lineare per mostrare le relazioni tra variabili sonno/veglia utilizzando l'attivigrafia e biomarcatori fisiologici. Corretto durante il sonno nei giorni liberi (MSF_sc) viene visualizzato come ora del giorno (h) sull'asse x. I primi fenotipi circadiani (ECP) sono mostrati nella casella blu, i fenotipi circadiani tardivi (LCP) nella casella rossa. (a) Tempo di picco della risposta di risveglio del cortisolo (h), (b) Tempo di sveglia (h), (c) Dim luce di uscita della melatonina (DLMO) (h), (d) Tempo di esordio del sonno (h). Il valore R² viene visualizzato nell'angolo in basso a p destra con il livello di significatività visualizzato in corrispondenza del valore di importanza . Questa cifra è stata modificata, con il permesso, da Facer-Childs, et^al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Variazioni diurne delle curve nella scala Karolinska Sleepiness e nelle prestazioni di Psychomotor Vigilance Task (PVT). L'ora del giorno (h) viene visualizzata sull'asse x. I risultati dell'intero gruppo sono mostrati nella prima colonna, i fenotipi circadiani primitivi (ECP) nella seconda colonna e i fenotipi circadiani tardivi (LCP) nella terza colonna. (a) Punteggio soggettivo sonnolenza (KSS),(b) Tempo di reazione da PVT (s). Sono state montate curve di regressione polinomiale di secondo ordine. Il livello di significatività viene visualizzato come ns (non significativo), (p < 0,05), s (p < 0,01), s (p < 0,001) e ) ( p < 0,001) e ) (p < 0,0001). Questa cifra è stata modificata, con il permesso, da Facer-Childs, et^al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Variabile misurata	Categoria ECP	Categoria ICP	Categoria LCP
Tempo di riattivazione attiva	< 07:30 h	07:31 - 08:29 h	> 08:30 h
Ora di punta del cortisolo mattutino	< 08:00	08:01 - 08:59 h	> 09:00 h
Insorgenza di melatonina dim luce (DLMO)	< 21:30 h	21:31 - 22:29 h	> 22,30 h
Insorgenza actigrafica del sonno	< 23:30 h	23:31 - 00:29 h	> 00:30 h
Corretto a metà del sonno nei giorni liberi (MSFsc)	< 04:00 h	04:01 - 04:59 h	> 05:00 h
Punteggio per variabile	0	1	2
PUNTEGGIO TOTALE	0 - 3	4 - 6	7 - 10
Sottocategorie	0 - ECP estremo 1 - ECP definito 2 - ECP moderato 3 - ECP lieve	4 - ICP anticipato 5 - ICP 6 - ICP in ritardo	7 - LCP lieve 8 - LCP moderato 9 - LCP definito 10 - LCP estremo

Tabella 1: Categorizzazione taglia i tagli per la fenotipizzazione circadiana in gruppi iniziali (ECP), intermedi (ICP) e tardivi (LCP). A ogni variabile viene assegnato un punteggio per partecipante in base al risultato e ai punteggi totali (0-10) che consentono la categorizzazione in ogni gruppo e in ogni sottocategoria.

Variabile misurata	ECP	LCP	Significato
Dimensione del campione	N - 16	N - 22	n/a
Numero di maschi/femmine	M - 7	M - 7	p - 0,51c
	N. F - 9	F - 15
Età (anni)	24,69 x 4,60	21,32 x 3,27 anni	p - 0,028a
Altezza (cm)	171.30 - 1,97	171,10 x 2,38	p - 0,97a
Peso (kg)	66,44 x 2,78	67,05 x 2,10	p - 0,88a
MSFsc (hh:mm)	02:24 - 00:10	06:52 - 00:17	p < 0.0001a
Insorgenza di sonno (hh:mm)	22:57 - 00:10	02:27 - 00:19	p < 0.0001a
Tempo di riattivazione (hh:mm)	06:33 - 0,10	10:13 - 00:18	p < 0.0001a
Durata del sonno (h)	7.59 x 0,18	7,70 x 0,14	p - 0,72a
Efficienza del sonno (%)	79,29 x 1,96	77,23 x 1,14	p - 0,46a
Latenza insorgenza della sospensione (hh:mm)	00:25 - 00:06	00:25 - 00:03	p - 0,30b
Angolo di fase (hh:mm)	02:28 - 00:16	02:34 - 00:18	p - 0,84a
Insorgenza di melatonina dim light (hh:mm)	20:27 : 00:16	23:55 : 00:26	p < 0.0001a
Ora di punta del cortisolo (hh:mm)	07:04 - 00:16	11:13 - 00:23	p < 0.0001a

Tabella 2: studiare le variabili per i gruppi di fenotipi circadiani; Primi (ECP) e tardivi (LCP). I valori sono indicati come media : SEM a parte l'età che viene indicato come media - SD. Corretto a metà sospensione nei giorni liberi (MSFsc) viene calcolato dal MCTQ. I tipi di test statistici utilizzati sono mostrati in apice; test parametrici^a, test non parametrici^b e il test esatto di Fisher^c. L'angolo di fase è determinato dalla differenza (h) tra l'esordio della melatonina dim luce (DLMO) e l'esordio del sonno. Tutti i valori p sono FDR corretti²⁴. Questa Tabella è stata modificata, con il permesso, da Facer-Childs, et^al.

Discussione

A causa della complessa interazione delle influenze circadiane e dipendenti dal sonno sul comportamento, esplorare i contributi relativi di ciascuno è impegnativo. I protocolli basati su laboratorio sono in gran parte irrealistici e costosi, quindi hanno una validità esterna più scadente quando si collegano i risultati al funzionamento quotidiano²⁵. Pertanto, è sempre più necessario studiare gli individui nel loro ambiente domestico per promuovere la generalizzabilità ai contesti del mondo reale. Anche se gli studi sul campo non consentono il controllo delle influenze esogene, un approccio integrato può aiutare a far luce su come i fattori biologici e ambientali influenzano la salute, la fisiologia e le prestazioni^23,26,27. Questo protocollo è stato progettato specificamente per essere in grado di monitorare gli individui nel loro ambiente domestico mentre seguono le loro routine abituali. Questi protocolli di campionamento della saliva sono stati intrapresi con successo in contesti impegnativi come l'Amazzonia²⁸ e l'Antartide²⁹ che supportano la facilità di conduzione di questo protocollo.

I questionari sono uno strumento utile negli studi di sonno e circadiano in quanto consentono un modo semplice e veloce per raccogliere una vasta gamma di informazioni. Tuttavia, le discrepanze tra misure soggettive e oggettive possono creare difficoltà quando si tenta di studiare le differenze individuali. Pertanto, essere in grado di raccogliere più misure soggettive e oggettive può rafforzare la categorizzazione dei gruppi di fenotipi circadiani. Questa combinazione di metodi - MCTQ, attività, campionamento fisiologico e test delle prestazioni - ha evidenziato come i risultati possano essere male interpretati se non vengono considerate differenze individuali nei fenotipi circadiani. La misurazione di tutte queste variabili fornisce la categorizzazione più affidabile dei gruppi di fenotipi circadiani, tuttavia, c'è il potenziale per sviluppare ulteriormente il metodo per consentire meno requisiti. Ad esempio, anche se l'affidabilità rimane da studiare, per ridurre i costi, i ricercatori potrebbero rimuovere la fase di campionamento del cortisolo o utilizzare un questionario diverso. Vale la pena notare, tuttavia, che poiché dLMO è un marcatore standard d'oro attuale per la tempistica e l'attivigrafia circadiana è un metodo standard per il monitoraggio dei modelli di riposo/attività, questo sarebbe un fattore essenziale da includere nelle valutazioni.

La pianificazione dei test delle prestazioni in base agli orari dell'orologio invece di basare i tempi rispetto all'individuo (tempo biologico interno) aumenta la fattibilità e consente di applicare il protocollo nelle impostazioni del mondo reale. Una limitazione di questo progetto, tuttavia, è l'incapacità di determinare l'influenza del sistema circadiano rispetto alle influenze omeostatiche. Questo diventa una sfida in quanto non vi è modo di confermare meccanismi specifici che contribuiscono ai risultati. Tuttavia, poiché lo scopo di questo protocollo è analizzare questi gruppi in uno scenario reale, la riduzione dei meccanismi dipendenti dal sonno ridurrebbe al minimo la validità esterna dei risultati. Si potrebbe quindi sostenere che l'utilizzo di un metodo integrato è più applicabile e più fattibile per gli studi sul campo.

Le misure dirette delle prestazioni sono molto rilevanti per la società, ma sembra che senza prendere in considerazione i molteplici fattori di influenza, in particolare la necessità di raggruppare gli individui in base al loro fenotipo circadiano e alla pressione del sonno, gli studi potrebbero mancare i risultati chiave.

Come discusso, il PVT e il KSS sono stati ampiamente utilizzati in molti campi di ricerca. La semplicità del PVT e la flessibilità nella durata delle attività lo rendono un test attraente da utilizzare in studi circadiani e di restrizione del sonno che richiedono più tempi di test, e ha dimostrato di essere un marcatore sensibile della privazione del sonno^30,31. Anche se la precisione del test e i tempi di reazione complessivi aumentano con la durata dell'attività, le attività PVT di 2 min, 5 min e 10 min mostrano tutte l'ora del giorno di relazioni³².

La nostra progettazione del protocollo potrebbe essere implementata utilizzando una serie di diverse attività di prestazioni e in momenti più frequenti, se necessario. Studi precedenti hanno dimostrato gli effetti dell'ora del giorno in metriche di prestazioni fisiche e cognitive come la capacità aerobica¹⁵ e la funzione esecutiva²⁵. L'attuazione di questo protocollo e la contabilità delle differenze individuali aumenterà la comprensione di come studiare i meccanismi che contribuiscono alle prestazioni, soprattutto in ambienti più di nicchia come gli sport d'elite. In sintesi, questo protocollo consente una valutazione reale del fenotipo circadiano e fornisce una visione su come misurare l'impatto del tempo del giorno sulle prestazioni.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Actiwatch Light	Cambridge Neurotech Ltd		Various different validated actigraph devices can be used depending on what is required
Sleep Analysis 7 Software	Cambridge Neurotech Ltd		Various different validated software can be used depending on what is required
7 ml plastic bijous			Various different tubes or salivettes can be used depending on what is required
DQ67OW, Intel Core i7-2600 processor, 4GB RAM, 32-bit Windows 7			Various different devices can be used depending on what is required