Análise em multiescala do crescimento bacteriano tratamentos de estresse

Resumo

Este protocolo permite uma descrição resolvida pelo tempo do crescimento bacteriano condições de estresse nos níveis de população unicelular e celular.

Resumo

A análise da capacidade bacteriana de crescer e sobreviver condições de estresse é essencial para uma ampla gama de estudos de microbiologia. É relevante caracterizar a resposta das células bacterianas a tratamentos indutores de estresse, como exposição a antibióticos ou outros compostos antimicrobianos, irradiação, pH não fisiológico, temperatura ou concentração de sal. Diferentes tratamentos de estresse podem perturbar diferentes processos celulares, incluindo divisão celular, replicação de DNA, síntese de proteínas, integridade da membrana ou regulação do ciclo celular. Estes efeitos são geralmente associados com fenótipos específicos na escala celular. Portanto, compreender a extensão e a causalidade das deficiências de crescimento ou viabilidade induzidas pelo estresse requer uma análise cuidadosa de vários parâmetros, tanto na célula única quanto nos níveis populacionais. A estratégia experimental aqui apresentada combina os ensaios tradicionais de monitoramento e revestimento de densidade óptica com técnicas de análise de células únicas, como citometria de fluxo e imagens de microscopia em tempo real em células vivas. Esta estrutura multiescala permite uma descrição resolvida pelo tempo do impacto das condições de estresse sobre o destino de uma população bacteriana.

Introdução

O objetivo geral deste protocolo é analisar o comportamento das células bacterianas expostas a tratamentos de estresse na população e nos níveis unicelulares. O crescimento bacteriano e a viabilidade são tradicionalmente abordados no nível populacional usando monitoramento de densidade óptica (OD_600nm),que é um proxy da síntese de massa celular bacteriana, ou por ensaios de revestimento para determinar a concentração de células viáveis na cultura (unidade de formação de colônia por mililitro, CFU/mL). Em condições normais (não estressadas) de crescimento, as medições OD_600nm e CFU/mL estão estritamente correlacionadas porque o tempo de duplicação bacteriana depende diretamente do aumento da massa celular^1,2. No entanto, essa correlação é muitas vezes interrompida condições que afetam a síntese de massa celular^3,divisão celular^4,ou que desencadeiam a lyse celular. Um exemplo simples é fornecido por tratamentos de estresse que inibem a divisão celular, o que resulta na formação de células bacterianas filamentosas^5,6. As células filamentosas alongam normalmente porque a síntese de massa celular não é afetada, mas são incapazes de se dividir em células viáveis. Consequentemente, a densidade óptica cultural aumentará ao longo do tempo a uma taxa normal, mas não a concentração de células viáveis determinadas por ensaios de revestimento (CFU/mL). Neste caso, como em muitos outros, a densidade óptica e as medições de revestimento são informativas, mas não fornecem uma compreensão abrangente do efeito observado induzido pelo estresse. Esses ensaios conjunto sofram combinados com técnicas de análise de células únicas para permitir uma caracterização aprofundada das deficiências de crescimento induzidas pelo estresse.

Aqui, um procedimento que combina quatro abordagens experimentais complementares é descrito: (1) ensaios tradicionais de revestimento e monitoramento básico de densidade óptica para monitorar a viabilidade celular e a síntese de massa celular, respectivamente; (2) citometria de fluxo para avaliar o tamanho das células e parâmetros de conteúdo de DNA em um grande número de células; (3) microscopia instantâneo imagem para analisar a morfologia celular; e (4) imagens unicelulares de lapso de tempo em câmaras microfluídicas para exame da dinâmica temporal do destino celular. Esta estrutura em multiescala permite interpretar os efeitos globais sobre o crescimento celular e viabilidade à luz do comportamento das células individuais. Este procedimento pode ser aplicado para decifrar a resposta de diversas espécies bacterianas a praticamente qualquer estresse de interesse, incluindo o crescimento em condições particulares (ou seja, médio de crescimento, pH, temperatura, concentração de sal) ou exposição a antibióticos ou outros compostos antimicrobianos.

Protocolo

1. Cultura celular, indução de estresse e procedimento de amostragem

NOTA: Use copos cultura estéril, pontas de pipetas e médio de crescimento filtrado em 0,22 μm para evitar partículas de fundo. Aqui, as culturas celulares são cultivadas em baixo autofluorescência rica definido médio (ver Tabela de Materiais)^7,8.

1. Estria a cepa bacteriana de interesse de um estoque congelado de glicerol em uma placa de agarose Luria-Broth (LB) (com antibiótico seletivo, se necessário) e incubar a 37 °C durante a noite (17 h).
   NOTA: O exemplo experimento apresentado aqui usa Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Esta cepa produz a subunidade fluorescentemente marcada α da proteína associada ao nucleóide HU, permitindo assim a visualização de microscopia leve do cromossomo em células vivas⁹.
2. Inocular 5 mL de meio com uma única colônia e crescer a 37 °C com agitação a 140 rotação por minuto (rpm) durante a noite (17 h). Os tubos de ensaio de frascos (≥50 mL) ou de diâmetro grande (≥2 cm) devem ser usados para garantir uma aeração satisfatória da cultura agitada.
3. Na manhã seguinte, medir a densidade óptica em 600 nm (OD_600nm)e diluir a cultura em um tubo de ensaio contendo médio fresco para um OD_600nm de 0,01. O volume total da cultura precisa ser ajustado dependendo do número de pontos de tempo a serem analisados durante o experimento.
4. Carregue uma amostra de 200 μL da cultura em uma microplaca (0,2 mL por poço de volume de trabalho com um fundo transparente claro) e coloque-a em um leitor de placa automatizado (ver Tabela de Materiais)para monitoramento de OD_600nm durante a incubação a 37 °C.
5. Incubar o tubo de ensaio inoculado a 37 °C com agitação (140 rpm) a OD_600nm = 0,2, correspondendo à fase exponencial completa em meio rico.
   NOTA: É fundamental para crescer as células por pelo menos 4-5 gerações antes de alcançar um crescimento exponencial adequado. O inóculo inicial utilizado na etapa 1.3 (OD_600nm = 0,01) precisa ser adaptado no caso de crescimento em meio mais pobre (ou seja, onde a fase exponencial é alcançada abaixo da OD 0,2), ou se mais gerações são desejadas (por exemplo, para estudos fisiológicos específicos ou para tratamentos de estresse prolongados).
6. Em OD_600nm = 0.2, pegue as seguintes amostras de cultura correspondentes ao ponto de tempo t₀ (células que crescem exponencialmente antes da indução por estresse): (1) Uma amostra de 150 μL a ser imediatamente carregada no aparelho microfluídico para imagens de microscopia de lapso de tempo (ver seção 2); (2) Uma amostra de 200 μL para o ensaio de diluição e revestimento (ver seção 3); (3) Uma amostra de 250 μL a ser colocada no gelo para análise de citometria de fluxo (seção 4); (4) Uma amostra de 10 μL a ser depositada imediatamente em um slide montado em agarose para imagens instantâneas de microscopia (ver seção 5).
7. Expor a cultura celular restante no tubo de ensaio para o tratamento de estresse específico que você deseja investigar e incubar a 37 °C com agitação (140 rpm).
   NOTA: A cultura crescente no leitor de placas automatizadas para monitoramento de OD_600nm também deve ser submetida ao tratamento de estresse.
8. Em momentos relevantes após o tratamento de estresse (t_1,t₂, t_3,etc.), recolher as seguintes amostras celulares da cultura estressada: (1) A amostra de 200 μL para o ensaio de diluição e revestimento (ver seção 2); (2) Uma amostra de 250 μL para colocar gelo para análise de citometria de fluxo (seção 3); (4) Uma amostra de 10 μL a ser depositada imediatamente em um slide montado em agarose para imagens instantâneas de microscopia (ver seção 4).
   NOTA: Cada tratamento indutor de estresse tem uma eficiência que é dose e tempo-dependente. Assim, pode ser necessário fazer testes preliminares para determinar a dose e a duração do tratamento a serem utilizados para obter resultados ideais. Isso pode ser feito realizando monitoramento de Overdose usando um leitor de placa automatizado (potencialmente associado com ensaios de revestimento) de uma cultura celular tratada com uma série de doses e tempos de exposição. No experimento aqui apresentado, a cultura celular foi tratada com a cehalexina antibiótica inibidora da divisão celular (Ceph.) na concentração final de 5 μg/mL por 60 min. A cecilina foi então lavada por pelleting as células em um tubo de 15 mL usando centrífuga (475 g, 5 min), removendo o supernatant, resuspendendo a pelota celular em um volume igual de médio fresco por pipetting suave, e transferindo-se para um tubo limpo. As células lavadas foram incubadas a 37 °C com agitação (140 rpm) para permitir a recuperação. A amostra foi colhida em t₆₀ (60 min após adição de cehalexina correspondente à amostra 'cehalexin-60min-tratada'), t₁₂₀ (60 min após a lavagem) e t₁₈₀ (120 min após a lavagem).

2. Ensaio de revestimento

NOTA: O ensaio de revestimento permite medir a concentração de células capazes de gerar uma CFU nas amostras de cultura. Este procedimento revela a taxa em que uma célula se divide em duas células viáveis e permite detectar prisões de divisão celular (por exemplo, aumento do tempo de geração bacteriana de lyse celular).

1. Prepare diluições em série de 10 vezes até 10^-7 da amostra de 200 μL de cultura em meio fresco. Placa 100 μL da diluição apropriada em placas não seletivas da agarose do LB a fim obter entre 3−300 colônias após a incubação de noite em 37 °C.
   NOTA: Diluição em série em meio fresco deve ser realizada rapidamente para limitar as divisões bacterianas. Alternativamente, os pesquisadores podem considerar o uso de uma solução shinhosa sem uma fonte de carbono para evitar divisões celulares durante o processo de diluição.
2. No dia seguinte, conte o número de colônias para determinar a concentração de células viáveis (CFU/mL) em cada amostra de cultura. Traçar a CFU/mL em função do tempo para culturas celulares não tratadas e tratadas.

3. Citometria flow

NOTA: A seção a seguir descreve a preparação de amostras de células para análise de citometria de fluxo. Esta técnica de análise revela a distribuição do tamanho celular e conteúdo de DNA para um grande número de células. Quando possível, recomenda-se processar imediatamente as amostras de citometria de fluxo. Alternativamente, as amostras podem ser mantidas no gelo (por até 6 h) e analisadas simultaneamente no final do dia, uma vez que as imagens de revestimento e microscopia foram realizadas.

1. Diluir a amostra de 250 μL de cultura para obter 250 μL a uma concentração de ~15.000 células/μL (correspondente a um OD_600nm ~0,06) em médio fresco a 4 °C.
   NOTA: A incubação no gelo limitará o crescimento e a modificação morfológica das células. Alternativamente, o usuário pode considerar a realização de fixação das células em 75% de etanol, como geralmente recomendado para citometria de fluxo¹⁰.
2. Para coloração de DNA, misture a amostra bacteriana com uma solução de 10 μg/mL de corante fluorescente de DNA (proporção 1:1) e incubano no escuro por 15 min antes de analisar a amostra.
3. Passe a amostra para o citometro de fluxo com uma taxa de fluxo de ~ 120.000 células/min. Adquirir para a frente dispersa (FSC) e lado-dispersado (SSC) luz, bem como dna fluorescente tintura fluorescência sinal (FL-1) com as configurações adequadas.
4. Traçar os histogramas de densidade celular FSC e FL-1 para representar a distribuição do tamanho celular e conteúdo de DNA na população celular.

4. Imagens de microscopia instantâneo

NOTA: A seguinte parte descreve a preparação de slides de microscopia e aquisição de imagem para análise de instantâneos populacionais. Este procedimento fornecerá informações sobre a morfologia das células (comprimento celular, largura, forma) e a organização intracelular do DNA nucleóide.

1. Pré-aqueça a câmara de microscópio termodeclarado a 37 °C para estabilizar a temperatura antes de iniciar as observações. Esta câmara permite a modulação da temperatura da ótica do microscópio e o estágio da amostra durante experiências do time-lapse.
2. Prepare os slides montados em agarose, como descrito em Lesterlin e Dubarry⁷.
   1. Retire o filme de plástico da parte inferior do quadro azul (ver Tabela de Materiais),deixando o filme plástico oco do outro lado. Coloque o quadro azul em um slide de vidro microscópio.
   2. Pipette ~150 μL de 1% de solução média agarose derretida e despeje dentro do compartimento azul. Cubra rapidamente com um coverslip limpo para remover o excesso de líquido e esperar alguns minutos para a almofada de agarose para solidificar à temperatura ambiente.
   3. Quando a amostra celular estiver pronta, retire o coverslip e o filme plástico da moldura azul. Despeje 10 μL de amostra de célula na almofada de agarose e incline o slide de vidro suavemente para espalhar a gota. Quando todo o líquido tiver sido adsorbed, coloque um coverslip limpo no quadro azul para selar a amostra. O slide da microscopia está agora pronto para microscopia.
3. Coloque o slide no estágio do microscópio e realize a aquisição de imagem usando luz transmitida (com um objetivo de contraste de fase) e com excitação de fonte de luz nos comprimentos de onda apropriados (560 nm para mCherry).
4. Selecione campos de visão que contenham células isoladas, a fim de facilitar a detecção automatizada de células durante a análise de imagem. Certifique-se de que pelo menos 300 células são imagemdas para permitir uma análise estatística robusta da população celular.

5. Microfluidics time-lapse microscopia imagem

NOTA: A seguinte parte explica a preparação das placas microfluídicas (ver Tabela de Materiais),carregamento celular, programa de microfluídica e aquisição de imagem de lapso de tempo. Este procedimento de imagem revela o comportamento das células individuais em tempo real.

1. Retire a solução de conservação da placa microfluídica e substitua-a por um meio fresco pré-aquecido a 37 °C, conforme descrito no guia de usuário de software microfluídico.
2. Selar a placa microfluídica para o sistema repertário e clique no botão Priming.
3. Coloque a placa microfluídica com o sistema reperário no estágio do microscópio e pré-aqueça a 37 °C por ~ 2 h antes de iniciar a aquisição de microscopia.
   NOTA: Esta etapa de pré-aquecimento é fundamental para evitar a dilatação da câmara microfluídica, o que alteraria o foco do microscópio durante o experimento de lapso de tempo e comprometeria a aquisição de imagem.
4. Selar a placa microfluídica. Substitua o meio de bem 8 com 150 μL de amostra de cultura e substitua o meio de bem 1 a 5 pelo meio desejado com ou sem o reagente indutor de estresse.
5. Selar a placa microfluídica e colocá-lo no estágio do microscópio.
6. No software microfluídico (ver Tabela de Materiais)executar o procedimento de carregamento celular. Verifique se o carregamento das células é satisfatório, olhando o microscópio em luz transmitida. Executar o procedimento de carregamento celular uma segunda vez se a densidade celular na câmara é insuficiente.
7. Executar cuidadosamente o foco no modo de luz transmitida e selecionar vários campos de visão que mostram bactérias isoladas. É importante selecionar campos que não estão superlotados para ser capaz de monitorar o crescimento de células isoladas ao longo do tempo (~ 10-20 células por 100 μm² é recomendado). Isso também facilitará a detecção de células durante a análise de imagem.
8. No software microfluídico, clique no botão Criar um Protocolo. Programe a injeção de médio de crescimento para equivalentes de tempo de 1 a 2 geração para permitir que as células se adaptem (opcional). Em seguida, programe a injeção do meio indutor de estresse durante 10 min a 2 psi, seguido de injeção em 1 psi para a duração desejada do tratamento de estresse. Se você pretende analisar a recuperação das células após o estresse, programe a injeção de novo meio de crescimento para a duração desejada.
   NOTA: No experimento aqui apresentado, cephalexin foi injetado por 10 min em 2 psi, seguido por 50 min em 1 psi. Em seguida, o meio de crescimento fresco foi injetado em 2 psi por 10 min, seguido por 3 h em 1 psi.
9. Realize imagens de microscopia no modo time-lapse com 1 quadro a cada 10 min usando contraste de fase em luz transmitida e uma fonte de luz de excitação de 560 nm para o sinal mCherry, se necessário.
   NOTA: É importante iniciar a aquisição de imagem microscópica ao mesmo tempo que o início do protocolo de injeção microfluídica.

6. Análise de imagem

NOTA: Esta seção descreve brevemente as principais etapas do processamento e análise de instantâneos e imagens de microscopia de lapso de tempo. Abertura e visualização de imagens de microscopia é feito com o código aberto ImageJ / Fiji (https://fiji.sc/)¹¹. A análise quantitativa de imagem é realizada usando o software de código aberto ImageJ/Fiji, juntamente com o plugin MicrobeJ gratuito¹² (https://microbej.com). Este protocolo utiliza a versão MicrobeJ 5.13I.

1. Abra o software de Fiji e o plugin microbej.
2. Para análise instantâneo, solte todas as imagens correspondentes a um slide de microscópio (uma amostra) na barra de carregamento do MicrobeJ para concatenar imagens e salve o arquivo de pilhas de imagem obtida. Para obter dados de lapso de tempo, basta soltar a pilha de imagem na barra de carregamento do MicrobeJ.
3. Executar a detecção automatizada dos contornos das células com base na segmentação da imagem de contraste de fase e, se relevante, dos nucleóides com base na segmentação do sinal de fluorescência de DNA manchado. Verifique a precisão da detecção celular visualmente e use a ferramenta de edição do MicrobeJ para correção, se necessário. Salve o arquivo de resultado obtido.
   NOTA: As configurações utilizadas para a detecção de células De E. coli são indicadas na Tabela de Materiais (ver Coluna comentários/descrição do MicrobeJ). Para outras espécies bacterianas (especialmente para bactérias em forma de haste), o usuário deve refinar as configurações antes da detecção (veja o tutorial do MicrobeJ). Para imagens de lapso de tempo, a execução de uma detecção semi-automatizada das células usando a ferramenta de edição do MicrobeJ pode ser preferível permitir o foco no destino das células individuais (ver tutorial do MicrobeJ).
4. Clique no ícone ResultadoPara concluir a análise e obter a janela ResultadoJ. Muitos tipos diferentes de gráficos de saída podem ser gerados a partir desse ponto. Traçar os histogramas normalizados de forma/comprimento celular e número nucleóide médio por célula.

Resultados

O procedimento descrito foi utilizado para analisar o comportamento das células Escherichia coli K12 durante a exposição transitória à cehalexina, um antibiótico que inibe especificamente a divisão celular (Figura 1A)¹³. A cepa hupA-mCherry E. coli que produz a proteína HU fluorescentemente rotulada associada ao DNA cromossômico foi usada para investigar a dinâmica do cromossomo ao longo deste tratamento^8,9. As células hupA-mCherry E. coli de crescimento exponencial foram analisadas antes (t₀₎e 60 min após a incubação com cephalexin (t_60). Em seguida, o antibiótico foi lavado e a recuperação da população celular após 1 h (t₁₂₀₎e 2 h (t₁₈₀₎foi analisada(Figura 1B).

Figura 1: Procedimento para a análise da resposta bacteriana aos tratamentos de esforço. (A)Esquemático do método. (B) Cartoon ilustrando a morfologia celular durante o crescimento normal em meio rico e durante a exposição transitória à cehalexina (Ceph.), de adição em (t₀₎e após a lavagem cephalexin de (t₆₀₎para (t_180). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A evolução paralela do OD e da UE/mL é um primeiro indicador que ajuda a compreender o efeito dos tratamentos de estresse. Estes dois parâmetros são estritamente correlacionados durante o crescimento imperturbável, mas muitas vezes são desacoplados e evoluem de forma independente estresse. Culturas celulares que crescem na presença de cephalexin exibiu od semelhante_600nm aumenta como as culturas não estressadas (Figura 2A), mostrando que a droga não afetou a síntese de massa celular. No entanto, a concentração de células viáveis não aumentou quando a cecialexina estava presente devido à inibição rigorosa da divisão celular (Figura 2B). As células começaram a dividir novamente quando a cecialexina foi removida e, eventualmente, atingiu uma concentração equivalente à cultura não estressada em (t_180). Esses resultados refletem o efeito bacteriotático da cehalexina, que induz uma inibição totalmente reversível da divisão celular. Diferentes estresses resultarão em diferentes desacoplamento das curvas OD e CFU/mL, dependendo do efeito induzido (por exemplo, modificação da morfologia celular, como filamento ou abaulamento, morte celular com ou sem lúse). Uma lista não exaustiva de possíveis resultados indicativos de diferentes efeitos induzidos pelo estresse é apresentada na Figura 2C.

Figura 2: Monitoramento de crescimento bacteriano de células não tratadas e tratadas com cefaloina no nível populacional. (A)Monitoramento da densidade óptica (OD_600nm/mL). (B) Concentração de células viáveis (CFU/mL) dentro de culturas não tratadas e tratadas com cehalexina-60min. Barras de erro indicam o desvio padrão para um triplicado experimental. C) Esquemade possíveis resultados e efeitos de estresse associados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A análise unicelular é essencial para interpretar com precisão a resposta ao estresse observada no nível populacional. O fluxo de citometria permite o exame do tamanho celular e conteúdo de DNA de vários milhares de células^14,15 (Figura 3). A exposição à cehalexina provocou o aumento paralelo do tamanho das células e do conteúdo de DNA (t_60). Quando a cecialexina foi removida, o tamanho da célula populacional e o conteúdo de DNA diminuíram gradualmente para se tornar semelhante à população não estressada no t_180. Estes resultados mostram que a cehalexina não inibiu a replicação do ADN e provocou a formação de células filamentosas que continham vários equivalentes cromossôsos. Estes filamentos divididos em células com tamanho celular normal e conteúdo de DNA quando a droga foi lavada. Os resultados da citometria do fluxo seriam muito diferentes para os esforços que inibem a síntese do ADN, que conduzem à formação das pilhas filamentosque contêm somente um cromossoma não-replicando. Nesse caso, o tamanho da célula aumentaria de forma semelhante, mas não estaria associado ao aumento do conteúdo de DNA.

Figura 3: Análise representativa de citometria de fluxo de células não tratadas e cephalexin-60min. (A)Histogramas de distribuição de tamanho celular (FSC-H). (B) histogramas de conteúdo de DNA (FL1-SYTO9). n = 120.000 células analisadas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A imagem latente do microscopy do instantâneo foi usada para examinar a morfologia da pilha e a organização intracelular do ADN mostrado pela localização de HU-mCherry(figura 4A). Cephalexin provocou a formação de células longas com largura celular normal e sem septa divisão. Esses filamentos suaves continham estruturas de DNA espaçadas regularmente chamadas nucleóides, confirmando que a cethalexina não afetou a replicação e a segregação do cromossomo. A análise quantitativa de imagens confirmou em grande parte o tamanho da célula e o aumento do conteúdo de DNA previamente observado com citometria de fluxo(Figura 4B,C). Os resultados seriam muito diferentes para as tensões que induzem dano ao DNA, o que leva à formação de células filamentosas nas quais a replicação continua, mas a segregação é prejudicada. Nesse caso, o tamanho celular e o conteúdo de DNA aumentariam da mesma forma, mas as células abrigariam uma única massa não estruturada de DNA. Imagens instantâneas também podem revelar outro tipo de formas celulares aberrantes ou a presença de células mini, anucleadas ou lincadas (células fantasma).

Figura 4: Análise instantânea microscopia de células não tratadas e cecetafina-60min-tratadas. (A)Imagens representativas de microscopia mostrando contraste de fase (cinza) e sinal HU-mCherry (vermelho). (B)Histogramas de distribuição de comprimento celular. Barra de Escala = 5 μm. (C)Histogramas do número de nucleóides por célula. Entre 800 e 2.000 células foram analisadas para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A microscopia de lapso de tempo associada ao aparelho microfluídico¹⁶ ajudou a determinar os fenótipos observados anteriormente e fornece insights adicionais sobre o desenvolvimento e a causalidade da deficiência de crescimento. Imagens de lapso de tempo(Figura 5A e Filme 1)confirmaram que o alongamento celular (síntese de massa celular), e a replicação e segregação cromossôneas não foram inibidas pela exposição à cehalexina. Além disso, revelou o processo de recuperação quando a cehalexina foi removida. A análise da linhagem celular filamentosa mostrou que a divisão celular reinicia ~ 20 min depois de lavar a droga (Figura 5B). As células divididas resultantes eram viáveis, porque, por sua vez, se dividiram, eventualmente levando à formação de 33 células exibindo tamanho normal e conteúdo de DNA. Isso permitiu o cálculo de um tempo de geração global de ~ 31 min sobre os 180 min do experimento, o que é semelhante ao tempo de geração calculado para a população não estressada das medições de CFU/mL (~33 min).

Figura 5: Análise de lapso de tempo microscopia de células tratadas com cehalexina-60min. (A)Imagens representativas de microscopia mostrando contraste de fase (cinza) e sinal HU-mCherry (vermelho). A célula filamentosa monitorada é indicada pelo contorno branco e células divididas por cores diferentes. Barra de Escala = 5 μm. (B) Representação esquemática da linhagem celular filamentosa correspondente ao painel (A)e ao Filme 1. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Filme 1: Filme microfluídico de E. coli HU-mCherry tratado com cehalexina. A cehalexina foi injetada após 60 min, seguida pela injeção de médio fresco de RDM por 3 h. Tempo indicado em amarelo (1 quadro a cada 10 minutos). Scale Bar = 5 μm. Por favor, clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Discussão

É essencial prestar atenção ao estado de crescimento das células durante o procedimento. Crescer as células ao longo de várias gerações antes de atingir uma fase exponencial completa. Para o sucesso deste método, é importante que todas as amostras de células sejam coletadas simultaneamente, e é melhor analisar apenas uma cultura tratada e uma não tratada ao mesmo tempo. As amostras de células para microscopia devem ser mantidas na temperatura experimental durante todo o procedimento. Em seguida, é essencial para pré-aquecer a câmara do microscópio e câmara microfluídica antes do início do experimento. Se as amostras de células para citometria de fluxo não puderem ser analisadas prontamente, elas podem ser mantidas no gelo por até 6 h. A incubação no gelo limitará o crescimento e a modificação morfológica das células. Alternativamente, o usuário pode considerar o uso de fixação das células em etanol 75%, que geralmente é recomendado para citometria de fluxo¹⁰. Se o protocolo requer lavar o indutor de estresse do meio, centrífuga e células de pipetas com muito cuidado para evitar danificar as células aberrantes potenciais.

Tanto a citometria de fluxo quanto a análise instantânea dão acesso ao tamanho celular e aos parâmetros de conteúdo de DNA, com instantâneos fornecendo observação adicional da morfologia celular. A coloração do ADN com DAPI¹⁰ (4',6-diamidino-2-phenylindole) ou outras tinturas estáveis do ADN pode ser executada se nenhuma fusão fluorescente está disponível para observar os nucleoids no organismo do interesse. Se a análise da citometria do fluxo não pode ser realizada, é importante a imagem e analisar um grande número de células por microscopia.

A imagem latente da microscopia pode igualmente ser executada usando as tensões que carreg as fusões fluorescentes às proteínas envolvidas em caminhos específicos do interesse. Isso ajudaria a revelar o efeito do estresse em uma variedade de processos celulares, como replicação, transcrição, síntese de parede celular ou divisão celular. O método pode ser aplicado a uma variedade de espécies bacterianas, a única exigência é que o aparato microfluídico seja compatível com a morfologia das células. As placas microfluídicas padrão são convenientes para bactérias em forma de haste com uma largura celular entre 0,7 μm e 4,5 μm. No entanto, cocci, ovococos, ou outras cepas bacterianas com formas peculiares precisam ser testados. Alternativamente, se experimentos microfluídicos não podem ser realizados devido à indisponibilidade do equipamento ou cepas bacterianas incompatíveis, imagens de lapso de tempo podem ser realizadas em slides montados em agarose por uma duração máxima de 2h.

A vantagem geral desta análise em multiescala é fornecer uma visão global do efeito da indução de estresse em vários aspectos da capacidade de crescimento bacteriano (ou seja, síntese em massa, viabilidade celular, morfologia celular, integridade da membrana, conteúdo de DNA) e a maneira estes evoluem com o tempo em uma população bacteriana crescendo condições de estresse. Também permite analisar a restauração do crescimento normal no nível unicelular e no nível populacional. A abordagem é aplicável a uma ampla gama de espécies bacterianas e a praticamente qualquer tipo de tratamento de estresse, como a exposição a antibióticos ou outros compostos antimicrobianos, análise da influência da interação com outros organismos em multiespécies populações, ou o efeito da mutação genética.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	BioRad	1613100	Certified molecular biology agarose
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	ThermoFisher scientific	A24858	Cytometer
CellASIC ONIX Microfluidic System	Merck Millipore	CAX2-S0000	Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic	Merck Millipore	CAX2-MBC20	Manifold system
CytoOne 96-well plate with lid	Starlab	CC7672-7596	Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion			Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication
Gene Frame	Thermo Scientific	AB-0578	Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm)
Luria-Broth agarose medium	MP Biomedicals	3002232	Growth medium for plating assay
MicrobeJ	Imagej/Fiji plugin	https://www.microbej.com/	Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	Merck Millipore	B04A-03-5PK	Plate for Microfluidic system
Microscope Nikon eclipse Ti	Nikon		Fluorescence microscope
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)	Teknova	M2105	Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S34854	DNA fluorescent dye
TECAN Infinite M1000	TECAN	30034301	Automated plate reader