Analisi multiscala della crescita batterica sotto trattamenti di stress

Riepilogo

Questo protocollo consente una descrizione risolta nel tempo della crescita batterica in condizioni di stress a livello di popolazione a singola cellula e di popolazione cellulare.

Abstract

L'analisi della capacità batterica di crescere e sopravvivere in condizioni di stress è essenziale per una vasta gamma di studi di microbiologia. È rilevante caratterizzare la risposta delle cellule batteriche a trattamenti che inducono stress come l'esposizione ad antibiotici o altri composti antimicrobici, irradiazione, pH non fisiologico, temperatura o concentrazione di sale. Diversi trattamenti di stress potrebbero disturbare diversi processi cellulari, tra cui la divisione cellulare, la replicazione del DNA, la sintesi proteica, l'integrità della membrana o la regolazione del ciclo cellulare. Questi effetti sono di solito associati a fenotipi specifici su scala cellulare. Pertanto, comprendere l'entità e la causalità della crescita indotta da stress o delle carenze di vitalità richiede un'attenta analisi di diversi parametri, sia a livello di singola cellula che a livello di popolazione. La strategia sperimentale qui presentata combina i tradizionali saggi di monitoraggio e placcatura della densità ottica con tecniche di analisi a singola cellula come la citometria del flusso e l'imaging della microscopia in tempo reale nelle cellule vive. Questo quadro multiscala consente una descrizione risolta nel tempo dell'impatto delle condizioni di stress sul destino di una popolazione batterica.

Introduzione

Lo scopo generale di questo protocollo è quello di analizzare il comportamento delle cellule batteriche esposte a trattamenti di stress a livello di popolazione e a livello di singola cellula. La crescita batterica e la vitalità sono tradizionalmente affrontate a livello di popolazione utilizzando il monitoraggio della densità ottica (OD_600nm), che è un proxy di sintesi di massa cellulare batterica, o vacillando saggi per determinare la concentrazione di cellule vitali nella coltura (colonia che forma unità per millililatore, CFU/mL). In condizioni di crescita normali (non sollecitate), le misurazioni OD_600nm e CFU/mL sono strettamente correlate perché il tempo di raddoppio batterico dipende direttamente dall'aumento di massa cellulare^1,2. Tuttavia, questa correlazione viene spesso interrotta in condizioni che influenzano la sintesi di massa cellulare³, divisione cellulare⁴o che attivano la lisi cellulare. Un semplice esempio è fornito da trattamenti di stress che inibiscono la divisione cellulare, che portano alla formazione di cellule batteriche filamentose^5,6. Le cellule filamentose si allungano normalmente perché la sintesi della massa cellulare non è influenzata, ma non sono in grado di dividersi in cellule vitali. La densità ottica di coltura aumenterà quindi nel tempo a un ritmo normale, ma non la concentrazione di cellule vitali determinata da saggi plating (CFU/mL). In questo caso, come in molti altri, la densità ottica e le misurazioni della placcatura sono informative, ma non riescono a fornire una comprensione completa dell'effetto indotto dallo stress osservato. Questi saggi di insieme devono essere combinati con tecniche di analisi a singola cellula per consentire una caratterizzazione approfondita delle carenze di crescita indotta dallo stress.

In questo caso, viene descritta una procedura che combina quattro approcci sperimentali complementari: (1) saggi di placcatura tradizionali e monitoraggio della densità ottica di base per monitorare la vitalità cellulare e la sintesi della massa cellulare, rispettivamente; (2) citometria di flusso per valutare le dimensioni delle cellule e parametri del contenuto di DNA su un gran numero di cellule; (3) imaging snapshot microscopia per analizzare la morfologia cellulare; e (4) l'imaging unicellulare time-lapse in camere microfluidiche per l'esame delle dinamiche temporali del destino cellulare. Questo quadro multiscala permette di interpretare gli effetti globali sulla crescita cellulare e la vitalità alla luce del comportamento delle singole cellule. Questa procedura può essere applicata per decifrare la risposta di diverse specie batteriche a qualsiasi stress di interesse, compresa la crescita in particolari condizioni (ad esempio, mezzo di crescita, pH, temperatura, concentrazione di sale) o l'esposizione a antibiotici o altri composti antimicrobici.

Protocollo

1. Coltura cellulare, induzione dello stress e procedura di campionamento

NOTA: Utilizzare vetrerie sterili, punte di pipetta e mezzo di crescita filtrati a 0,22 m per evitare particelle di sfondo. Qui, le colture cellulari sono coltivate in bassa autofluorescenza ricca di mezzo definito (vedi Tabella dei materiali)^7,8.

1. Streak il ceppo batterico di interesse da uno stock di glicerolo congelato su una piastra di agarose Luria-Broth (LB) (con antibiotico selettivo se necessario) e incubare a 37 gradi durante la notte (17 h).
   NOTA: L'esperimento di esempio qui presentato utilizza Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Questo ceppo produce la sottounità fluorescente marcata della proteina associata al nucleoide HU, consentendo così la visualizzazione della microscopia leggera del cromosoma nelle cellule vive⁹.
2. Inoculare 5 mL di mezzo con una singola colonia e crescere a 37 gradi centigradi con agitazione a 140 rotazione al minuto (rpm) durante la notte (17 h). Per garantire un'aerazione soddisfacente della coltura agitata, è necessario utilizzare flaconci o provette di grande diametro (2 cm).
3. La mattina seguente misura la densità ottica a 600 nm (OD_600nm)e diluisce la coltura in una provetta contenente un nuovo mezzo a un OD_600nm di 0,01. Il volume totale della coltura deve essere regolato in base al numero di punti temporali da analizzare durante l'esperimento.
4. Caricare un campione di 200 l della coltura in una microplacca (0,2 mL per pozzo di lavoro con un fondo trasparente chiaro) e posizionarlo in un lettore di lamiere automatizzato (vedi Tabella dei materiali) per il monitoraggio OD_600nm durante l'incubazione a 37 .
5. Incubare la provetta inoculata a 37 gradi con agitazione (140 giri/min) fino a_{OD 600nm} , corrispondente alla fase esponenziale completa nel mezzo ricco.
   NOTA: È fondamentale far crescere le cellule per almeno 4/5 generazioni prima di raggiungere una corretta crescita esponenziale. L'inoculum iniziale utilizzato nel passaggio 1.3 (OD_600nm - 0,01) deve essere adattato nel caso della crescita nel mezzo più povero (cioè, dove la fase esponenziale è raggiunta al di sotto dell'OD 0,2), o se sono desiderate più generazioni (ad esempio, per studi fisiologici specifici o per trattamenti di stress prolungato).
6. All'OD_600nm 0,2, prendete i seguenti campioni di coltura corrispondenti al punto temporale t₀ (cellule in crescita esponenziale prima dell'induzione dello stress): (1) Un campione di 150 l da caricare immediatamente nell'apparato microfluidico per l'imaging di microscopia time-lapse (vedi sezione 2); (2) Un campione di 200 - L per il diluizione e il discorso di placcatura (vedi sezione 3); (3) Un campione di 250 -L da mettere sul ghiaccio per l'analisi della citometria di flusso (sezione 4); (4) Un campione di 10 L da depositare immediatamente su un vetrino montato su agarose per l'imaging snapshot della microscopia (cfr. sezione 5).
7. Esporre la coltura cellulare rimasta nella provetta al trattamento di stress specifico che si desidera analizzare e incubare a 37 gradi centigradi con agitazione (140 giri/min).
   NOTA: Anche la coltura nel lettore automatico di piastre per il monitoraggio OD_600nm deve essere sottoposta al trattamento dello stress.
8. Nei punti pertinenti successivi al trattamento di stress (t₁, t₂, t_3,ecc.), prendete i seguenti campioni cellulari della coltura stressata: (1) Un campione di 200 -L per il test di diluizione e placcatura (cfr. sezione 2); (2) Un campione da 250 l da mettere sul ghiaccio per l'analisi della citometria del flusso (sezione 3); (4) Un campione di 10 L da depositare immediatamente su un vetrino montato su agarose per l'imaging snapshot della microscopia (cfr. sezione 4).
   NOTA: ogni trattamento che induce stress ha un'efficienza che dipende dalla dose e dal tempo. Pertanto, potrebbe essere necessario eseguire test preliminari per determinare la dose e la durata del trattamento da utilizzare per ottenere risultati ottimali. Questo può essere fatto eseguendo il monitoraggio OD utilizzando un lettore di piastre automatizzato (potenzialmente associato a saggi placcatura) di una coltura cellulare trattata con una gamma di dosi e tempi di esposizione. Nell'esperimento qui presentato, la coltura cellulare è stata trattata con la cefalea antibiotica inibitrice della divisione cellulare (Ceph.) a 5 g/mL di concentrazione finale per 60 min. Le cellule lavate sono state incubate a 37 gradi centigradi con tremi (140 giri/min) per consentire il recupero. Il campione è stato prelevato a t₆₀ (60 min dopo l'aggiunta di cefalea corrispondente al campione "trattato con cefingina-60min"), t₁₂₀ (60 min dopo il lavaggio) e t₁₈₀ (120 min dopo il lavaggio).

2. Ansimante di placcatura assay

NOTA: Il test di placcatura consente di misurare la concentrazione di cellule in grado di generare una CFU nei campioni di coltura. Questa procedura rivela la velocità con cui una cellula si divide in due cellule vitali e permette di rilevare gli arresti di divisione cellulare (ad esempio, l'aumento del tempo di generazione batterica della lisi cellulare).

1. Preparare diluizioni seriali di 10 volte fino a 10^-7 dei 200 - l di campione di coltura in un mezzo fresco. Piastra 100 -L dell'appropriata diluizione su piastre di agarose LB non selettive al fine di ottenere tra 3-300 colonie dopo l'incubazione notturna a 37 gradi centigradi.
   NOTA: la diluizione seriale nel mezzo fresco deve essere eseguita rapidamente per limitare le divisioni batteriche. In alternativa, i ricercatori potrebbero prendere in considerazione l'utilizzo di una soluzione salina senza una fonte di carbonio per prevenire le divisioni cellulari durante il processo di diluizione.
2. Il giorno successivo, contare il numero di colonie per determinare la concentrazione di cellule vitali (CFU/mL) in ogni campione di coltura. Tracciare la CFU/mL in funzione del tempo per le colture cellulari non trattate e trattate.

3. Citometria di flusso

NOTA: nella sezione seguente viene descritta la preparazione di campioni di celle per l'analisi della citometria del flusso. Questa tecnica di analisi rivela la distribuzione delle dimensioni delle cellule e del contenuto di DNA per un gran numero di cellule. Quando possibile, si consiglia di elaborare immediatamente i campioni di citometria di flusso. In alternativa, i campioni possono essere conservati sul ghiaccio (fino a 6 h) e analizzati simultaneamente alla fine della giornata, una volta che sono state eseguite la placcatura e la microscopia.

1. Diluire il campione di coltura di 250 gradi per ottenere 250 gradi l ad una concentrazione di 15.000 celle/L (corrispondenti a un OD_600nm 0,06) in un mezzo fresco a 4 gradi centigradi.
   NOTA: L'incubazione sul ghiaccio limiterà la crescita e la modifica morfologica delle cellule. In alternativa, l'utente potrebbe prendere in considerazione l'esecuzione della fissazione delle cellule nel 75% di etanolo, come di solito consigliato per la citometria di flusso¹⁰.
2. Per la colorazione del DNA, mescolare il campione batterico con una soluzione di 10 g/mL di colorante fluorescente del DNA (rapporto 1:1) e incubare al buio per 15 min prima di analizzare il campione.
3. Passare il campione nel citometro di flusso con una velocità di flusso di 120.000 usd/min. Acquisire la luce di dispersione in avanti (FSC) e side-scattered (SSC) e il segnale fluorescenza del colorante fluorescente del DNA (FL-1) con le impostazioni appropriate.
4. Tracciare gli istogrammi a densità di cellule FSC e FL-1 per rappresentare la distribuzione delle dimensioni delle cellule e del contenuto di DNA nella popolazione cellulare.

4. Imaging di microscopia istantanea

NOTA: La parte seguente descrive la preparazione delle diapositive di microscopia e l'acquisizione di immagini per l'analisi delle istantanee della popolazione. Questa procedura fornirà informazioni riguardanti la morfologia delle cellule (lunghezza cellulare, larghezza, forma) e l'organizzazione intracellulare del DNA nucleoide.

1. Preriscaldare la camera termorite al microscopio a 37 gradi centigradi per stabilizzare la temperatura prima di iniziare le osservazioni. Questa camera consente la modulazione della temperatura dell'ottica del microscopio e dello stadio del campione durante gli esperimenti time-lapse.
2. Preparare i vetrini montati su agarose come descritto in Lesterlin e Dubarry⁷.
   1. Rimuovere la pellicola di plastica dalla parte inferiore del telaio blu (vedere Tabella dei materiali),lasciando la pellicola di plastica scavata sull'altro lato. Attaccare la cornice blu su uno scivolo di vetro al microscopio.
   2. Pipetta 150 l di soluzione media di agarose fusa 1% e versare all'interno del vano telaio blu. Coprire rapidamente con un coperchio pulito per rimuovere il liquido in eccesso e attendere qualche minuto affinché il pad agarose si solidifichi a temperatura ambiente.
   3. Quando il campione di cellule è pronto, rimuovere il coperchio e la pellicola di plastica dal telaio blu. Versare 10 l di campione di cellule sul pad agarose e inclinare delicatamente lo scivolo di vetro per stendere la goccia. Quando tutto il liquido è stato adsorbito, attaccare un coperchio pulito sul telaio blu per sigillare il campione. Il vetrino di microscopia è ora pronto per la microscopia.
3. Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio ed eseguire l'acquisizione dell'immagine utilizzando la luce trasmessa (con un obiettivo di contrasto di fase) e con l'eccitazione della sorgente luminosa alle lunghezze d'onda appropriate (560 nm per mCherry).
4. Selezionare campi di visualizzazione che contengono celle isolate per facilitare il rilevamento automatico delle celle durante l'analisi delle immagini. Assicurarsi che siano state mappate almeno 300 celle per consentire una solida analisi statistica della popolazione cellulare.

5. Microscopia microscopia microfluidica time-lapse

NOTA: La parte seguente illustra la preparazione delle piastre microfluidiche (vedere Tabella dei materiali),il caricamento delle celle, il programma di microfluidica e l'acquisizione di immagini time-lapse. Questa procedura di imaging rivela il comportamento delle singole cellule in tempo reale.

1. Rimuovere la soluzione di conservazione dalla piastra microfluidica e sostituirla con un mezzo fresco preriscaldato a 37 gradi centigradi, come descritto nella guida per l'utente del software microfluidico.
2. Sigillare la piastra microfluidica al sistema di collettore e fare clic sul pulsante Priming.
3. Posizionare la piastra microfluidica con il collettore sullo stadio del microscopio e preriscaldare a 37 gradi centigradi per 2 h prima di avviare l'acquisizione della microscopia.
   NOTA: Questa fase di preriscaldamento è fondamentale per evitare la dilatazione della camera microfluidica, che altererebbe la messa a fuoco del microscopio durante l'esperimento time-lapse e compromettere l'acquisizione dell'immagine.
4. Sigillare la piastra microfluidica. Sostituire il mezzo da pozzo 8 con 150 l di campione di coltura e sostituire il mezzo da 1 a 5 con il mezzo desiderato con o senza il reagente che induce lo stress.
5. Sigillare la piastra microfluidica e posizionarla sullo stadio del microscopio.
6. Sul software microfluidico (vedi Tabella dei materiali) eseguire la procedura di caricamento delle celle. Verificare che il caricamento delle cellule sia soddisfacente guardando al microscopio nella luce trasmessa. Eseguire la procedura di caricamento delle celle una seconda volta se la densità delle celle nella camera è insufficiente.
7. Eseguire la messa a fuoco con attenzione in modalità luce trasmessa e selezionare diversi campi visivi che mostrano batteri isolati. È importante selezionare campi che non sono sovraffollati per poter monitorare la crescita delle cellule isolate nel tempo (si consigliadino 10/20 cellule per 100^{sm 2).} Ciò faciliterà anche il rilevamento delle cellule durante l'analisi dell'immagine.
8. Sul software microfluidico, fare clic sul pulsante Crea un protocollo. Programmare l'iniezione di mezzi di crescita per equivalenti temporali di generazione 1/2 per consentire alle cellule di adattarsi (opzionale). Quindi programmare l'iniezione del mezzo che induce lo stress durante 10 min a 2 psi, seguita da iniezione a 1 psi per la durata desiderata del trattamento stress. Se avete intenzione di analizzare il recupero delle cellule dopo lo stress, programmare l'iniezione di mezzo di crescita fresco per la durata desiderata.
   NOTA: Nell'esperimento qui presentato, il cefisina è stato iniettato per 10 min a 2 psi, seguito da 50 min a 1 psi. Quindi, mezzo di crescita fresco è stato iniettato a 2 psi per 10 min, seguito da 3 h a 1 psi.
9. Eseguire l'imaging a microscopia in modalità time-lapse con 1 fotogramma ogni 10 min utilizzando il contrasto di fase nella luce trasmessa e una fonte di luce di eccitazione di 560 nm per il segnale mCherry, se necessario.
   NOTA: È importante avviare l'acquisizione di immagini microscopiche contemporaneamente all'inizio del protocollo di iniezione microfluidico.

6. Analisi dell'immagine

NOTA: questa sezione descrive brevemente i passaggi chiave dell'elaborazione e dell'analisi delle immagini di microscopia snapshot e time-lapse. L'apertura e la visualizzazione delle immagini microscopiche avviene con l'open source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)¹¹. L'analisi quantitativa delle immagini viene eseguita utilizzando il software open source ImageJ/Fiji insieme al plugin microbeJ gratuito¹² (https://microbej.com). Questo protocollo utilizza la versione MicrobeJ 5.13I.

1. Aprire il software Fiji e il plugin MicrobeJ.
2. Per l'analisi istantanea, rilasciate tutte le immagini corrispondenti a una diapositiva al microscopio (un campione) nella barra di caricamento di MicrobeJ per concatenare le immagini e salvare il file delle pile di immagini ottenuto. Per i dati time-lapse, è sufficiente rilasciare la pila di immagini nella barra di caricamento di MicrobeJ.
3. Eseguire il rilevamento automatico dei contorni delle cellule in base alla segmentazione dell'immagine di contrasto di fase e, se pertinente, dei nucleoidi in base alla segmentazione del segnale di fluorescenza del DNA colorato. Controllare visivamente l'accuratezza del rilevamento delle celle e utilizzare lo strumento di modifica MicrobeJ per la correzione, se necessario. Salvare il file dei risultati ottenuto.
   NOTA: le impostazioni utilizzate per il rilevamento delle cellule E. coli sono indicate nella Tabella dei materiali (vedere la colonna Commenti/Descrizione di MicrobeJ). Per altre specie batteriche (soprattutto per i batteri non a forma di canna), l'utente deve perfezionare le impostazioni prima del rilevamento (vedi esercitazione di MicrobeJ). Per le immagini time-lapse, l'esecuzione di un rilevamento semi-automatico delle celle utilizzando lo strumento di editing MicrobeJ potrebbe essere preferibile per consentire di concentrarsi sul destino delle singole celle (vedi esercitazione di MicrobeJ).
4. Fare clic sull'icona ResultJ per completare l'analisi e ottenere la finestra ResultJ. Molti tipi diversi di grafici di output possono essere generati da quel punto. Tracciare gli istogrammi normalizzati della forma/lunghezza delle cellule e il numero medio nucleoide per cella.

Risultati

La procedura descritta è stata utilizzata per analizzare il comportamento delle cellule di Escherichia coli K12 durante l'esposizione transitoria alla cefalea, un antibiotico che inibisce specificamente la divisione cellulare (Figura 1A)¹³. Il ceppo hupA-mCherry E. coli che produce la proteina HU etichettata fluorescentmente associata al DNA cromosomico è stato utilizzato per studiare la dinamica del cromosoma durante questo trattamento^8,9. Le cellule hupA-mCherry E. coli in crescita esponenziale sono state analizzate prima (t₀) e 60 min dopo l'incubazione con cefalea (t₆₀). Quindi, l'antibiotico è stato lavato via e il recupero della popolazione cellulare dopo 1 h (t₁₂₀) e 2 h (t₁₈₀) è stato analizzato (Figura 1B).

Figura 1: Procedura per l'analisi della risposta batterica ai trattamenti di stress. (A) Schematica del metodo. (B) Cartone che illustra la morfologia cellulare durante la normale crescita nel mezzo ricco e durante l'esposizione transitoria alla cephalexina (Ceph.), dall'aggiunta a (t₀) e dopo il lavaggio della cefalea da (t₆₀) a (t₁₈₀). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'evoluzione parallela di OD e CFU/mL è un primo indicatore che aiuta a capire l'effetto dei trattamenti di stress. Questi due parametri sono strettamente correlati durante la crescita imperturbata, ma sono spesso disaccoppiati e si evolvono in modo indipendente sotto stress. Le colture cellulari che crescono in presenza di cefrale hanno mostrato simili aumenti di OD_600nm come le colture non sottoposte a stress (Figura 2A), dimostrando che il farmaco non ha influenzato la sintesi di massa cellulare. Tuttavia, la concentrazione di cellule vitali non è aumentata quando la cefalea era presente a causa della rigorosa inibizione delladivisionecellulare ( Figura 2B). Le cellule hanno ricominciato a dividersi quando la cefalea è stata rimossa e alla fine ha raggiunto una concentrazione equivalente alla coltura non stressata a (t₁₈₀). Questi risultati riflettono l'effetto batteriostatico della cefalea, che induce un'inibizione completamente reversibile della divisione cellulare. Diverse sollecitazioni si tradurrà in diversi disaccoppiamento delle curve OD e CFU/mL, a seconda dell'effetto indotto (ad esempio, modifica della morfologia cellulare come filamento o rigonfiamento, morte cellulare con o senza lisi). Un elenco non esaustivo dei possibili risultati indica nteci a diversi effetti indotti dallo stress è presentato nella Figura 2C.

Figura 2: Monitoraggio della crescita batterica delle cellule non trattate e trattate con la cefalea a livello di popolazione. (A) Monitoraggio ottico della densità (OD_600nm/mL). (B) Concentrazione di cellule vitali (CFU/mL) all'interno di colture non trattate e trattate con cefalesina-60min. Le barre di errore indicano la deviazione standard per un triplice sperimentale. (C) Schemi dei possibili risultati e degli effetti di sollecitazione associati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'analisi a cella singola è essenziale per interpretare con precisione la risposta allo stress osservata a livello di popolazione. La citometria di flusso consente l'esame delle dimensioni delle cellule e del contenuto del DNA di diverse migliaia di celle^14,15 (Figura 3). L'esposizione alla cefalea ha provocato l'aumento parallelo delle dimensioni delle cellule e del contenuto di DNA (t₆₀). Quando la cefalea è stata rimossa, la dimensione delle cellule della popolazione e il contenuto di DNA sono diminuiti gradualmente fino a diventare simili alla popolazione non stressata a t₁₈₀. Questi risultati mostrano che la cefalea non ha inibito la replicazione del DNA e ha provocato la formazione di cellule filamentose che contenevano diversi equivalenti cromosomici. Questi filamenti divisi in cellule con dimensioni cellulari normali e contenuto di DNA quando il farmaco è stato lavato via. I risultati della citometria di flusso sarebbero molto diversi per gli stress che inibiscono la sintesi del DNA, che portano alla formazione di cellule filamentose contenenti un solo cromosoma non replicante. In tal caso, le dimensioni delle cellule aumenterebbero allo stesso modo, ma non sarebbero associate ad un aumento del contenuto di DNA.

Figura 3: Analisi della citometria di flusso rappresentativa di cellule non trattate e trattate con cefalea-60 min. (A) Istogrammi di distribuzione delle dimensioni delle celle (FSC-H). (B) Istogrammi del contenuto di DNA (FL1-SYTO9). n - 120.000 celle analizzate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'imaging a microscopia istantanea è stato utilizzato per esaminare la morfologia cellulare e l'organizzazione intracellulare del DNA mostrata dallalocalizzazioneHU-mCherry ( Figura 4A). Cephalexin provocò la formazione di cellule lunghe con larghezza cellulare normale e nessuna divisione di setti. Questi filamenti lisci contenevano strutture di DNA regolarmente distanziate chiamate nucleoidi, confermando che la cefalea non influenzava la replicazione e la segregazione dei cromosomi. L'analisi quantitativa delle immagini ha ampiamente confermato le dimensioni delle cellule e l'aumento del contenuto del DNA osservato in precedenza con la citometria di flusso (Figura 4B,C). I risultati sarebbero molto diversi per le sollecitazioni che inducono il danno al DNA, che portano alla formazione di cellule filamentose in cui la replicazione continua ma la segregazione è compromessa. In questo caso, le dimensioni delle cellule e il contenuto di DNA aumenterebbero allo stesso modo, ma le cellule ospitano una singola massa non strutturata di DNA. Le immagini istantanee potrebbero anche rivelare altri tipi di forme di cellule aberranti o la presenza di mini, anucleate o cellule lismiche (cellule fantasma).

Figura 4: Analisi istantanea di microscopia di cellule non trattate e trattate con cefalea-60min. (A) Immagini di microscopia rappresentative che mostrano il contrasto di fase (grigio) e il segnale HU-mCherry (rosso). (B) Istogrammi di distribuzione della lunghezza delle celle. Barra di scala - 5 istogrammi(C)del numero di nucleoidi per cella. Per ogni campione sono state analizzate tra 800 e 2.000 cellule. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La microscopia time-lapse associata all'apparato microfluidico¹⁶ ha aiutato a determinare i fenotipi precedentemente osservati e fornisce ulteriori approfondimenti sullo sviluppo e la causalità della carenza di crescita. Le immagini time-lapse (Figura 5A e Film 1) hanno confermato che l'allungamento cellulare (sintesi di massa cellulare) e la replica zione cromosomica e la segregazione non erano inibite dall'esposizione alla cefalea. Inoltre, ha rivelato il processo di recupero quando la cefalea è stata rimossa. L'analisi del lignaggio cellulare filamentoso ha mostrato che la divisione cellulare riavvia 20 minuti dopo aver lavato via il farmaco (Figura 5B). Le cellule divise risultanti erano vitali, perché a loro volta si divisero, portando infine alla formazione di 33 cellule che mostravano dimensioni normali e contenuto di DNA. Ciò ha permesso il calcolo di un tempo di generazione complessivo di 31 min per i 180 min dell'esperimento, che è simile al tempo di generazione calcolato per la popolazione non stressata dalle misurazioni CFU/mL (33 min).

Figura 5: Analisi time-lapse microscopia delle cellule trattate con cefalea-60min. (A) Immagini di microscopia rappresentative che mostrano il contrasto di fase (grigio) e il segnale HU-mCherry (rosso). La cella filamentosa monitorata è indicata dal contorno bianco e le celle divise con colori diversi. Barra di scala - 5 m. (B) Rappresentazione schematica del lignaggio cellulare filamentoso corrispondente al pannello (A) e al filmato 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Film 1: Film microfluidico di E. coli HU-mCherry trattato con cefalea. La cefalesina è stata iniettata dopo 60 min, seguita da iniezione di mezzo RDM fresco per 3 h. Tempo indicato in giallo (1 fotogramma ogni 10 min). Barra di scala - 5 m. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Discussione

È essenziale prestare attenzione allo stato di crescita delle cellule durante la procedura. Far crescere le cellule su diverse generazioni prima di raggiungere una fase esponenziale completa. Per il successo di questo metodo, è importante che tutti i campioni di cellule vengano raccolti contemporaneamente ed è meglio analizzare solo una cultura trattata e una cultura non trattata contemporaneamente. I campioni cellulari per l'imaging microscopio devono essere mantenuti alla temperatura sperimentale per tutta la durata della procedura. È quindi essenziale preriscaldare la camera del microscopio e la camera microfluidica prima dell'inizio dell'esperimento. Se i campioni di cellule per la citometria di flusso non possono essere analizzati prontamente, possono essere conservati sul ghiaccio fino a 6 h. L'incubazione sul ghiaccio limiterà la crescita e la modifica morfologica delle cellule. In alternativa, l'utente potrebbe prendere in considerazione l'utilizzo della fissazione delle cellule in etanolo 75%, che di solito è raccomandato per la citometria di flusso¹⁰. Se il protocollo richiede il lavaggio dell'induttore di stress dal mezzo, centrifugare e le cellule pipetta molto attentamente per evitare di danneggiare le potenziali cellule aberranti.

Sia la citometria del flusso che l'analisi delle istantanee danno accesso alle dimensioni delle cellule e ai parametri del contenuto del DNA, con istantanee che forniscono un'ulteriore osservazione della morfologia cellulare. La colorazione del DNA con DAPI¹⁰ (4',6-diamidino-2-phenylindole) o altri coloranti di DNA stabili può essere eseguita se non è disponibile alcuna fusione fluorescente per osservare i nucleoidi nell'organismo di interesse. Se non è possibile eseguire l'analisi della citometria di flusso, è importante immaginare e analizzare un gran numero di cellule mediante microscopia.

L'imaging a microscopia può essere eseguito anche utilizzando ceppi che trasportano fusioni fluorescenti alle proteine coinvolte in specifici percorsi di interesse. Questo aiuterebbe a rivelare l'effetto dello stress su una varietà di processi cellulari come la replicazione, la trascrizione, la sintesi della parete cellulare o la divisione cellulare. Il metodo può essere applicato a una serie di specie batteriche, l'unico requisito è che l'apparato microfluidico deve essere compatibile con la morfologia delle cellule. Le piastre microfluidiche standard sono utili per i batteri a forma di canna con una larghezza cellulare compresa tra 0,7 e 4,5 m. Tuttavia, cocci, ovococci o altri ceppi batterici con forme particolari devono essere testati. In alternativa, se non è possibile eseguire esperimenti microfluidici a causa dell'indisponibilità dell'apparecchiatura o di ceppi batterici incompatibili, l'imaging time-lapse può essere eseguito su vetrini montati su agarose per una durata massima di 2h.

Il vantaggio complessivo di questa analisi multiscala è quello di fornire una visione globale dell'effetto dell'induzione dello stress su diversi aspetti della capacità di crescita batterica (ad esempio, sintesi di massa, vitalità cellulare, morfologia cellulare, integrità della membrana, contenuto di DNA) e il modo questi si evolvono con il tempo in una popolazione batterica che cresce in condizioni di stress. Permette anche di analizzare il ripristino della crescita normale a livello di singola cellula e livello di popolazione. L'approccio è applicabile a un'ampia gamma di specie batteriche e praticamente a qualsiasi tipo di trattamento di stress, come l'esposizione a antibiotici o altri composti antimicrobici, l'analisi dell'influenza dell'interazione con altri organismi in multispecie o l'effetto della mutazione genetica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	BioRad	1613100	Certified molecular biology agarose
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	ThermoFisher scientific	A24858	Cytometer
CellASIC ONIX Microfluidic System	Merck Millipore	CAX2-S0000	Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic	Merck Millipore	CAX2-MBC20	Manifold system
CytoOne 96-well plate with lid	Starlab	CC7672-7596	Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion			Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication
Gene Frame	Thermo Scientific	AB-0578	Blue frame (125 μL, 1,7 x 2,8 cm)
Luria-Broth agarose medium	MP Biomedicals	3002232	Growth medium for plating assay
MicrobeJ	Imagej/Fiji plugin	https://www.microbej.com/	Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	Merck Millipore	B04A-03-5PK	Plate for Microfluidic system
Microscope Nikon eclipse Ti	Nikon		Fluorescence microscope
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)	Teknova	M2105	Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 μm
SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S34854	DNA fluorescent dye
TECAN Infinite M1000	TECAN	30034301	Automated plate reader