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Resumo

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Resumo

Camundongos humanizados fornecem uma plataforma sofisticada para estudar a virologia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e testar drogas antivirais. Este protocolo descreve o estabelecimento de um sistema imunológico humano em camundongos adultos NOG. Aqui, explicamos todos os passos práticos do isolamento das células CD34+ derivadas do sangue do cordão umbilical e seu subsequente transplante intravenoso para os camundongos, até a manipulação do modelo através da infecção pelo HIV, combinação de terapia antirretroviral ( cART), e amostragem de sangue. Aproximadamente 75.000 células hCD34+ são injetadas por via intravenosa nos camundongos e o nível de chimerismo humano, também conhecido como humanização, no sangue periférico é estimado longitudinalmente por meses por citometria de fluxo. Um total de 75.000 células hCD34+ produz células CD45+ humanas no sangue periférico. Os camundongos são suscetíveis à infecção intravaginal com HIV e o sangue podem ser amostrados uma vez por semana para análise, e duas vezes mensais por longos períodos. Este protocolo descreve um ensaio para quantificação da carga viral plasmática usando pcR digital droplet (ddPCR). Mostramos como os camundongos podem ser efetivamente tratados com um regime de cART padrão de cuidado na dieta. A entrega do cART na forma de chow de rato regular é um refinamento significativo do modelo experimental. Este modelo pode ser usado para análise pré-clínica de compostos sistêmicos e tópicos de profilaxia pré-exposição, bem como para testes de novos tratamentos e estratégias de cura do HIV.

Introdução

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é uma infecção crônica com mais de 37 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo1. A terapia antiviral combinada (cART) é uma terapia que salva vidas, mas uma cura ainda é justificada. Assim, há a necessidade de modelos animais que espelham o sistema imunológico humano e suas respostas para facilitar a continuação da pesquisa no HIV. Múltiplos tipos de camundongos humanizados que são capazes de suportar o enenxerto celular e tecidual foram desenvolvidos transplantando células humanas em camundongos severamente imunodeficientes2. Esses camundongos humanizados são suscetíveis à infecção pelo HIV e fornecem uma alternativa importante aos modelos de vírus da imunodeficiência símia de primatas não humanos, pois são mais baratos e simples de usar do que primatas não humanos. Camundongos humanizados têm facilitado a pesquisa em transmissão viral do HIV, patopatismo, prevenção e tratamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Apresentamos um sistema de modelohumanizado flexível para pesquisa sobre HIV desenvolvido por transplantar células-tronco humanas derivadas do sangue do cordão umbilical em camundongos do ACENO. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) de fundo. Além de ser de origem não fetal, a bioengenharia prática desses camundongos é menos exigente tecnicamente em comparação com os procedimentos microcirúrgicos envolvidos no transplante da construção hepática-timo hemobiana (TBL).

Mostramos como estabelecer a infecção pelo HIV através da transmissão intravaginal e como monitorar a carga viral plasmática com uma configuração digital de gota sensível (ddPCR). Posteriormente, descrevemos o estabelecimento do cART padrão dado como parte da dieta diária do camundongo. O objetivo desses métodos combinados é reduzir o estresse aos animais e facilitar experimentos em larga escala onde o tempo gasto manuseando cada animal é limitadoem 12.

Em humanos, um genótipo CCR5Δ32/wt ou CCR5Δ32/ Δ32 causa redução da suscetibilidade à infecção pelo HIV com vírus transmissor/fundador13, e algumas precauções devem ser tomadas quando a bioengenharia humanizou camundongos com células-tronco para fins de estudos de HIV. Isso é especialmente verdade em nossa região porque variantes de ocorrência natural no gene CCR5, particularmente as exclusões de Δ32, são mais prevalentes em populações nativas escandinavas e bálticas em comparação com o resto do mundo14,15. Assim, nosso protocolo inclui um ensaio fácil e de alto nível para triagem de células-tronco hematopoiéticas para variantes CCR5 antes do transplante.

Para a exposição intravaginal escolhemos o vírus transmissor/fundador R5 RHPA4259, isolado de uma mulher em um estágio inicial de infecção que foi infectada intravaginalmente16. Nós expôs os camundongos a uma dose viral que foi suficiente para produzir transmissão bem sucedida na maioria dos camundongos, mas abaixo de uma taxa de transmissão de 100%. A escolha dessa dose permite uma faixa dinâmica suficiente na taxa de transmissão, de forma que os efeitos antivirais de um candidato a medicamentos possam resultar em animais protegidos em experimentos de prevenção do HIV e diminuição da carga viral para estudos de tratamento.

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Protocolo

Todas as amostras de sangue do cordão umbilical foram obtidas em estrita conformidade com os protocolos aprovados localmente, incluindo o consentimento informado de doação anônima pelos pais. Todos os experimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as regulamentações nacionais dinamarquesas a licença 2017-15-0201-01312.

ATENÇÃO: Manuseie camundongos expostos ao HIV e sangue com extrema cautela. Descontaminar todas as superfícies e líquidos que estiveram em contato com o HIV com um desinfetante confirmado para o HIV(Tabela de Materiais).

1. Isolamento de células-tronco CD34+ humanas

  1. Cole amostras de sangue do cordão umbilical em tubos de coleta de sangue revestidos por EDTA após seções planejadas de cesarianaou nascimentos vaginais e de acordo com aprovações éticas locais.
  2. Isolar pmbcs do sangue do cordão por separação de densidade-gradiente de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Isolar as células CD34+ da população pbmc pela primeira vez pré-enriquecedora com anticorpos contra marcadores comuns para células maduras, o que induz a crosslinking de células de linhagens indesejadas com glóbulos vermelhos. Isso é seguido pelo enriquecimento celular CD34+ usando contas magnéticas, de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Determine a contagem de células vivas por exclusão azul de trypan padrão, resuspendendo 10 μL de suspensão celular em 90 μL de azul trypan. Adicione 10 μL desta solução a um hemacyômetro e conte células não azuis, de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Células CD34+ de criopreservação viável em 1 mL de 10% DMSO em soro bovino fetal (FBS) até o dia do transplante de camundongos.
    3. Criopreservando viável uma pequena fração de células isoladas (CD34+) e flow-through (CD34-) separadamente para avaliar a pureza das células-tronco CD34+(~30.000 células de cada amostra). Alternativamente, teste a pureza em células recém-enriquecidas (veja o passo 2 abaixo).
    4. Congele uma fração de fluxo não-pelotas (CD34-) para determinação do status CCR5Δ32. As células podem ser congeladas diretamente sem solução de congelamento condicionada, mas a presença de glóbulos vermelhos na pelota pode inibir o PCR subsequente se o fluxo for depelotas.

2. Avaliação da pureza das células-tronco CD34+ via citometria de fluxo

  1. Descongele as células isoladas (CD34+) e as células de fluxo (CD34-). Lave as células resuspendendo as células de cada frasco em 9 mL de tampão FACS de temperatura ambiente (RT), consistindo de 2% de soro bovino fetal (FBS) em soro tampão de fosfato (PBS).
  2. Centrífuga por 5 min a 300 x g em RT para células de pelotização.
  3. Despeje o supernatante, resuspenda as células no líquido restante e transfira para tubos FACS. Repita o passo de lavagem com 3 mL de tampão FACS. Após a segunda centrífuga, despeje o supernatant e resuspenda as células do líquido restante.
  4. Adicione 5 μL da solução de bloqueio do Receptor Fc (Tabela de Materiais) e deixe por 10 min na RT. Não lave a solução de bloqueio do Receptor Fc.
  5. Adicione a mistura contendo volumes predeterminados de anticorpos contra CD3 humano (clone SK7) BUV395, CD34 (clone AC136), FITC e CD45 (clone 2D1) APC(Tabela 1). Deixe as células por 30 min na RT no escuro. Os fluoroforóres devem ser escolhidos com base em parâmetros que podem ser avaliados com címetro de fluxo disponível sem exigir uma matriz de compensação.
  6. Lave as células com 3 mL de tampão FACS.
  7. Centrífuga por 5 min a 300 x g na RT para pelotas as células.
  8. Despeje o supernatant e resuspenda as células no líquido restante.
    1. Repita esta etapa de lavagem 2x para garantir que todos os anticorpos desvinculados tenham sido removidos.
  9. Registre as amostras no cítometro de fluxo(Tabela de Materiais)e realize a análise de dados com software adequado. A estratégia de gating é apresentada na Figura 1A-F.

3. Triagem genética para variantes CCR5Δ32 no sangue do cordão umbilical

  1. Incuba1 1,25 μL de fluxo não-pelotado com 11,25 μL de mistura PCR contendo 200 μM de mistura dNTP, 0,01 U/μL high fidelity DNA polymerase, e os primers dianteiros e reversos detalhados na Tabela 2.
    1. Ajuste o volume com água livre de nucação para aproximadamente 12,5 μL para cada reação pcr.
  2. Amplificar os fragmentos genômicos com o programa de ciclismo PCR detalhado na Tabela 3.
  3. Separe os produtos PCR em um gel de agarose de 2%13.
    1. Os produtos PCR dos alelos do tipo selvagem e dos alelos Δ32 produzem fragmentos pcr de 196 pares de base e 164 bandas de pares base, respectivamente, tornando-os facilmente distinguíveis por eletroforese de gel13 (Figura 1G).

4. Transplante de células-tronco intravenosas

NOTA: Ter uma pessoa preparando as células em laboratório e outra pessoa preparar os ratos e o espaço de trabalho para transplantes é uma abordagem eficiente.

  1. Em uma instalação animal, 4-6 h antes do transplante planejado das células-tronco, irradiam o ACENO feminino de 6 a 7 semanas. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac (NOG) ratos (Tabela de Materiais) com 0,75 Gy com uma fonte Cs137. A melhor dose pré-condicionante pode variar de acordo com a idade do mouse, fonte de radiação e outros fatores. Este processo condiciona os animais para enenxerto bem sucedido com células-tronco humanas.
  2. Em uma instalação animal, prepare o espaço de trabalho do banco de fluxo e todos os reagentes antes de trazer os ratos ou células para o espaço de trabalho.
    1. Coloque uma almofada azul estéril para cobrir a superfície de trabalho do banco de fluxo. Prepare gaze estéril e um recipiente afiado.
    2. Coloque uma lâmpada de aquecimento desinfetada com 70% de etanol no banco de fluxo com uma gaiola de rato estéril vazia o calor.
  3. Em laboratório, descongele células CD34+ isoladas e dilui-las em 9 mL de 37 °C simples RPMI.
  4. Centrífuga sem células a 350 x g por 5 min na RT, descarte o supernatante por aspiração e resuspenda a pelota em 1 mL de RPMI simples a 37 °C.
  5. Determine a contagem da célula por exclusão azul trypan e ajuste o volume para 200 μL por mouse. Faça extra para levar em conta possíveis perdas devido às etapas subsequentes de manuseio.
    1. Prepare-se para transplantar 75.000 células CD34+ por 200 μL em cada camundongo.
    2. As células podem ser mantidas a 4 °C durante o transporte para a instalação animal antes do transplante. Evite manter as células no gelo para reduzir a agregação ou aglomeração.
  6. Na instalação animal, leve a gaiola com os ratos para o banco de fluxo e transfira os ratos para a gaiola a lâmpada de aquecimento para dilatar os vasos sanguíneos. Deixe uma extremidade da gaiola longe da fonte de calor para que os ratos possam se afastar do calor ao se aquecerem. Os camundongos que se mudaram para o fim da gaiola, longe da fonte de calor, são suficientemente quentes para uma injeção bem sucedida da veia traseira.
  7. Carregue uma seringa lubrificada de 1 mL acima da marca de 800 μL com células CD34+ suspensas. Usar uma seringa lubrificada de 1 mL aliviará drasticamente a injeção intravenosa e aumentará a precisão desta técnica.
  8. Conecte uma agulha de 30 G de 13 mm e prepare a agulha e a seringa para injeção. Esta ordem de operação permite que a seringa seja carregada mais rapidamente enquanto protege a integridade das células a serem transplantadas dado o possível dano que pode ocorrer durante a rápida aspiração das células através de uma agulha tão pequena. Encha o cubo da agulha com líquido pressionando o êmbolo e remova o líquido até a marca de 200 μL da agulha.
  9. Coloque um mouse aquecido (passo 4.6) em um contidor usado para dar injeções intravenosas. Injete cuidadosamente 200 μL da suspensão da célula na veia traseira do mouse. Passe 2 s realizando o mergulho e mantenha a agulha inserida por aproximadamente 2 s após a conclusão da injeção. Isso garante que as células migraram adequadamente longe do local da injeção antes da remoção da agulha.
  10. Conforme necessário, limpe a cauda do rato com gaze estéril para remover qualquer sangue visível. Coloque o rato de volta em sua gaiola não aquecida. Repita o procedimento de injeção com os ratos restantes.

5. Coleta de sangue e processamento para análise

NOTA: O enenxerto de células humanas no sangue periférico pode ser avaliado por citometria de fluxo 3 a 5 meses após o transplante de células-tronco humanas.

  1. Retire amostras de sangue dos camundongos usando técnicas locais aprovadas pelo IACUC.
  2. Colete um máximo de 70-100 μL de sangue total em tubos de microcentrífugas PCR estéreis contendo 10 μL de 0,5 M EDTA (pH = 8,0) para evitar coagulação de sangue.

6. Avaliação do enenxerto humano via citometria de fluxo

  1. Transfira 40-50 μL de sangue para tubos FACS.
  2. Adicione 5 μL da solução de bloqueio do Receptor Fc para evitar a ligação não específica de anticorpos e deixe por 10 minutos na RT.
  3. Adicione a mistura de anticorpos anti-humanos do mouse contendo CD4 (clone SK3) BUV 496, CD8 (clone RPA-T8) BV421, CD3 (clone OKT3) FITC, CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7, CD45 (clone 2D1) APC (Tabela 4) e deixar para manchar no escuro na RT por 30 min. Fluorophores devem ser escolhidos com base em parâmetros que podem ser avaliados com o fluxo disponível címetros sem necessidade de uma compensação.
  4. Adicione 2 mL de um tampão de glóbulo vermelho apropriado a cada tubo para lse as células vermelhas do sangue. Use um tampão de lise especificamente formulado para coloração de anticorpos antes da lise glóbulo vermelha (um exemplo adequado é dado na Tabela de Materiais). Vórtice brevemente para garantir a distribuição igualitária das células na solução de lising e deixar por 10 min na RT. A distribuição igualitária das células é importante.
  5. Adicione 2 mL de tampão FACS para parar a reação da lise.
  6. Centrífuga por 5 min a 300 x g na RT para pelotas as células.
  7. Despeje o supernatant e o vórtice suavemente até que as células sejam resuspensas.
  8. Adicione 3 mL de tampão FACS e centrífuga por 5 min a 300 x g na RT.
  9. Despeje o supernatant e resuspenda as células.
  10. Registre as amostras em um címetro de fluxo adequado e analise usando software apropriado (Tabela de Materiais). Análise sou retratada na Figura 2 e Figura 3.

7. Exposição intravaginal do HIV

NOTA: O vírus usado para exposição intravaginal dos camundongos pode ser produzido usando protocolos publicados anteriormente17. O vírus é mantido a -80 °C e transportado entre locais enquanto armazenado em gelo seco seguindo protocolos aprovados localmente. O vírus é armazenado em gelo seco até imediatamente antes da exposição dos camundongos. O vírus pode ser diluído em RPMI simples (evite o RPMI que tenha antibióticos ou aditivos soro) para alcançar a concentração adequada imediatamente antes da exposição (21.400 IUs foram usados para esta exposição do IVAG). Uma vez gerado, mantenha o estoque diluído no gelo molhado durante todo o procedimento para evitar ciclos de degelo congelante que ocorreriam se o vírus diluído fosse colocado de volta no gelo seco uma vez descongelado.

  1. Prepare todo o equipamento e espaço de trabalho do banco de fluxo, como apresentado na Figura 4 antes de trazer os ratos ou vírus para o banco de fluxo (semelhante ao passo 4.2).
    1. Coloque o foco da lâmpada de aquecimento no centro do espaço de trabalho onde o mouse estará localizado durante o procedimento de exposição ao HIV. A lâmpada de aquecimento garantirá que não diminua na temperatura corporal dos camundongos. Outros equipamentos que controlam a temperatura também podem ser usados, (por exemplo, uma almofada de gel aquecida ou um cobertor de água morna circulante, de acordo com as normas locais da IACUC18).
    2. Traga pontas de pipeta estéreis de 20 μL e uma pipeta apropriada para o banco. Coloque um recipiente com desinfetante líquido(Tabela de Materiais)no banco para inativação imediata de materiais e líquidos que tenham estado em contato com o vírus.
  2. Coloque um rato em uma câmara com 3% de gás isoflurano e toalhas de papel. Essa porcentagem de gás anestesiará os animais dentro de 2 a 4 minutos. Como em todos os outros materiais utilizados com camundongos imunodeficientes, o aparelho de anestesia deve ser devidamente desinfetado antes do uso.
  3. Uma vez anestesiado, transfira o mouse para uma almofada azul estéril a lâmpada de aquecimento. Insira o focofamento do rato em uma máscara que fornece gás isoflurano contínuo de 3% para manter a anestesia. Segure o rato na base da cauda, estômago voltado para cima, com a mão suportando o rato de volta como retratado na Figura 4.
  4. Com uma ponta de pipeta estéril, estimule a área genital acariciando suavemente para cima em direção ao ânus para induzir o esvaziamento do reto, aliviando a pressão sobre a vagina.
  5. Cuidadosamente desnuda a abertura vaginal embrulhando a cauda do rato em seus dedos de tal forma que a vulva naturalmente se abre, talvez com leve cutucada usando uma ponta de pipeta estéril.
  6. Troque a ponta da pipeta e a pipeta 20 μL do vírus atraumáticamente na vagina do rato sem criar bolhas. Não insira a ponta profundamente na vagina. Em vez disso, com a vulva aberta, coloque a ponta da pipeta no nível da abertura vaginal, evite ir mais fundo para eliminar o potencial de escoriações durante o processo de inoculação, solte o vírus e permita que a gravidade puxe o vírus para a vagina. Alternativamente, use uma agulha reta de 22 G 1,25 mm, conforme descrito em Veselinovic et al.6.
  7. Mantenha o mouse nesta posição com a vagina virada para 5 minutos após exposição para evitar vazamento induzido pela gravidade da suspensão do vírus.
    1. Coloque cuidadosamente o rato na gaiola de casa, tomando cuidado para colocar o rato em suas costas.

8. Processamento de amostras de sangue antes da análise da carga viral

  1. Coletar sangue como descrito na seção 5 acima.
  2. Centrífuga as amostras de sangue por 5 min a 500 x g na RT para separar o plasma e as células.
  3. Colete 40 μL de plasma para medição de carga viral em um novo tubo de microcentrífuga estéril aprovado pelo PCR e armazene a -80 °C por pelo menos 1 h até processamento posterior. É importante congelar todas as amostras antes da extração de RNA para evitar o risco de viés de comparar níveis de RNA em amostras que não foram congeladas antes do isolamento do RNA com amostras congeladas antes do isolamento do RNA.
  4. Ajuste o volume de sangue de volta ao volume original adicionando 40 μL de mídia suspensa (PBS com 2,5% de albumina de soro bovino, 50 u/mL penicilina G e estreptomiacina, e 10 DNase U/mL, filtrado estéril a 0,22 μm).
  5. Transfira 15 μL do volume sanguíneo ajustado para um novo tubo de microcentrífuga aprovado pelo PCR.
  6. Adicione 1 mL de solução de lise RBC 1x (Tabela de Materiais),vórtice e incubar por 10 min na RT.
  7. Centrífuga por 1 min a 9.600 x g em RT para células de pelotização.
  8. Aspirar supernatante e deixar apenas a pequena pelota de célula branca, porque a contaminação de glóbulos vermelhos pode inibir o PCR.
  9. Armazene pelotas a -80 °C por pelo menos 1 h até continuar o processamento.
    NOTA: Opcionalmente, qualquer sangue remanescente da etapa 8.4 pode ser usado para análise de citometria de fluxo, conforme descrito acima na etapa 6.

9. Extração de DNA usando um método de extração proteinase K

  1. Extrair DNA de pelotas de células periféricas (geradana etapa 8.8) usando um método de extração de proteína K conforme descrito abaixo. Este método foi demonstrado para extrair o maior rendimento de DNA de um pequeno volume de sangue, como o necessário para as coletas de sangue em série utilizadas neste estudo19.
  2. Adicione 25 μL de proteinase K (20 μg/mL) a 1 mL de tampão de tris 0,1M.
  3. Vórtice a solução Proteinase K brevemente.
  4. Adicione 50 μL da solução Proteinase K a cada pelota celular a ser digerida.
  5. Misture e baixe e confirme a resuspensão da pelota celular.
  6. Agite-se em um termoshaker (Tabela de Materiais) a 400 rpm (dependendo do instrumento) a 56 °C por 1 h. Tubos de fita para mantê-los no lugar, se necessário.
  7. Imediatamente e no mesmo termoshaker, inativar proteinase K com uma mudança de temperatura para 95 °C enquanto o tremor continua por mais 20 min.
  8. Vórtice a cada amostra.
  9. Coloque cada amostra a -80 °C por um mínimo de 30 min.
  10. Descongele, em seguida, centrífuga as amostras em 17.000 x g por 1 min em RT para pelotas de fragmentos celulares indesejados.
  11. Coloque o supernatant contendo DNA em um novo tubo de microcentrífuga.
  12. O modelo de DNA está pronto para PCR. Os modelos de DNA podem ser armazenados a -80 °C.

10. Extração de RNA, síntese de cDNA e quantificação ddPCR de RNA viral

  1. Isolar o RNA do plasma de camundongos descongelado com um kit de isolamento de RNA vírus seguindo o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais).
  2. Após a adição da amostra à coluna, adicione uma etapa de tratamento de DNase na coluna para garantir a remoção de todo o DNA na amostra de plasma.
    1. Para cada amostra, adicione 95 μL de solução DNase livre de Rnase (misture 2 μL DNase sem RNAse e tampão de reação de 98 μL) à coluna e incuba rinpara 15 min na RT.
  3. Armazene as amostras de RNA a -80 °C por pelo menos 1h antes de continuar o processamento. É importante congelar todas as amostras após a extração de RNA evitar o risco de viés ao comparar amostras que não foram congeladas com amostras congeladas.
  4. Sintetizar cDNA usando uma etapa de transcrição reversa usando reagentes como descrito anteriormente20. Certifique-se de adicionar 0,5 μL de um inibidor de RNase à reação do CDNA para evitar a degradação do RNA.
    1. Realizar síntese de cDNA com o programa detalhado na Tabela 5.
  5. Armazene as amostras de cDNA a -80 °C por pelo menos 1h. É importante congelar todas as amostras após a síntese do CDNA evitar o risco de viés ao comparar amostras que não foram congeladas com amostras congeladas.
  6. Prepare amostras para ddPCR da seguinte forma20:
    1. Misture 3 μL da amostra de cDNA com 11 μL da mistura de sonda ddPCR (sem dUTP)20,250 nM menor sonda de encolinha de cocolinha e 900 nM de cada um dos primers dianteiros e reversos conforme detalhado na Tabela 6.
    2. Ajuste o volume total de PCR para 22 μL com água livre de nuca.
  7. Emulsifique o PCR mistura-se com droplet generation oil para sondas em um gerador de gotículas de acordo com o protocolo do fabricante e descrições anteriores20.
  8. Execute o programa PCR conforme detalhado na Tabela 7.
    NOTA: As sequências de primer/sonda e os programas pcr exibidos aqui foram especificamente projetados e otimizados para detecção sensível da cepa do HIV RHPA4259. As sequências de primer e sonda podem ser facilmente ajustadas para detectar qualquer outra cepa de escolha do HIV.
  9. Detecte fluorescência de gotas das amostras em um leitor de gotículas e analise os resultados com software apropriado de acordo com o protocolo do fabricante.

11. Tratamento com chow contendo cART

  1. Alimentar camundongos com pelotas contendo um regime padrão de cART contendo 4.800 mg/kg raltegravir (RAL), 720 mg/kg tenofovir disoproxil fumarate (TDF) e 520 mg/kg emtricitabine (FTC)21 (Tabela 8). Essas doses foram determinadas assumindo que um rato pesa 25 g e come 4 g de chow por dia. Isso corresponde a uma dose diária de 768 mg/kg RAL, 2,88 mg/kg TDF e 83 mg/kg FTC21.
  2. Use uma dieta cART que foi preparada por um fornecedor externo (Ver Tabela de Materiais) de medicamentos prescritos. Outras empresas poderiam potencialmente produzir esse regime. Use uma dieta cART colorida de vermelho para distingui-lo facilmente do açúcar do rato comum.
    1. Produzir uma dieta de controle sem cART em uma cor marrom padrão para fácil distinção.
  3. Para iniciar o cART, prepare gaiolas de rato estéreis com a adição de dieta de chow contendo cART e, em seguida, transfira os ratos da gaiola antiga para a nova gaiola.
    1. Monitore os pesos dos camundongos e o consumo de chow contendo cART por inspeção visual para garantir que os camundongos estejam se ajustando à mudança.

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Resultados

A estratégia de gating para a análise da pureza das células-tronco é retratada na Figura 1. A Figura 1A-C mostra a população purificada do CD34+ e a Figura 1D-F do CD34- fluxo utilizado para ilustrar que a quantidade mínima da população cd34+ é perdida no processo de isolamento. A pureza das células-tronco CD34+ isoladas ficou entre 85%-95% com menos de 1% de contaminação por células T...

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Discussão

A tensão severamente imunocomprometida do mouse NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) é extremamente adequado para transplante de células e tecidos humanos. Tanto as vias imunes inatas quanto adaptativas nesses camundongos estão comprometidas. Os ratos NOG e NSG abrigam uma mutaçãoprkdc scid que resulta na função de células T e B defeituosas. Além disso, esses camundongos não possuem um receptor funcional de entrelaçana-2 (cadeia gama co...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesses.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à equipe do Biomedicine Animal Facility da Universidade de Aarhus, particularmente pela Sra. Jani Kær pelos esforços de manutenção da colônia e pelo rastreamento de pesos dos ratos. Os autores gostariam de agradecer ao professor Florian Klein pelo desenvolvimento do cART padrão de cuidado e pela orientação. O seguinte reagente foi obtido através do Nih AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) do Dr. John Kappes e Dr. Christina Ochsenbauer.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Blue padVWR56616-031Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7BD Bioscience557835
CD3 (clone OKT3) FITCBiolegend317306
CD3 (clone SK7) BUV395BD Bioscience564001
CD34 (clone AC136) FITCMiltenyi130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496BD Bioscience564652/51
CD45 (clone 2D1) APCBiolegend368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421BD Bioscience562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)Bio-Rad1863025
DMSOMerck10,02,95,21,000
DNAseSigmaD4263For suspension buffer
dNTP mixLife TechnologiesR0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS)BiowestL0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit IIStemcell17896
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Lysing solution 10XBD349202Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton)Falcon352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX)Biolegend422302
Fetal bovine serumSigmaF8192-500
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17144002
Flowjo v.10
GauzeMesoft157300Should be sterilized prior to use
Heating lampCustom made
Hemacytometer (Bürker-Türk)VWRDOWC1597418
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Microcentrifuge tubes, PCR-PT approvedSarstedt72692405
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Needle, Microlance 3, 30G ½"BD304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacTaconicNOG-F
Nuclease-free waterVWR chemicals436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kitMacherey-Nagel740691
PCR-approved microcentrifuge tubesSarstedt72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100XBiowestL0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymeraseLife TechnologiesF549S
Pipette tips, sterile, ART 20P BarrierThermoScientific2149P
Proteinase KNEB100005398
QuantaSoft softwareBio-Rad
QX100 Droplet GeneratorBio-Rad1886-3008
QX100 Droplet ReaderBio-Rad186-3003
RBC lysis solutionBiolegend420301
RNase-free DNAse size F + reaction bufferMacherey-Nagel740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitorThermoScientific10777-019
RPMIBiowestL0501-500Dissolve in H20
Softject 1 mL syringeHenke Sass Wolf5010-200V0
Superscript III Reverse TranscriptaseThermoFisher Scientific18080044
ThermoshakerVWR89370-910
Trypane blueSigmaT8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0ThermoFisher Scientific15575-020
Virkon S (virus disinfectant)Dupont7511

Referências

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