Intravajinal HIV Maruziyeti ve HIV Enfeksiyonu Tedavisi için İnsanize NOG Fareler

Özet

Biz nesil ve insanlaşmış ve insan immün yetmezlik virüs enfekte NOG fare modeli kök hücre nakli, intravajinal insan immün yetmezlik virüsü maruz kalma ve damlacık dijital PCR RNA dayalı değerlendirilmesi için bir protokol geliştirdik Miktar.

Özet

Humanized fareler insan immün yetmezlik virüsü (HIV) virolojisi incelemek ve antiviral ilaçları test etmek için sofistike bir platform sağlar. Bu protokol yetişkin NOG farelerde bir insan bağışıklık sisteminin kurulması nı açıklar. Burada, göbek kordon kanı nın izolasyonundan elde edilen insan CD34+ hücrelerinin ve farelere intravenöz naklinden, modelin HIV enfeksiyonu yoluyla manipülasyonuna, kombinasyon antiretroviral tedaviye kadar tüm pratik adımları açıklıyoruz ( cART) ve kan örneklemesi. Yaklaşık 75.000 hCD34+ hücre farelere intravenöz olarak enjekte edilir ve insan kimerizmi düzeyi, ayrıca insanlaşma olarak da bilinir, periferik kanda akış sitometrisi tarafından aylarca uzunlamasına olarak tahmin edilmektedir. Toplam 75.000 hCD34+ hücre periferik kanda %20-50 insan CD45+ hücresi verir. Fareler HIV ile intravajinal enfeksiyona duyarlı dır ve kan analiz için haftada bir kez ve uzun süre ler için ayda iki kez örneklenebilir. Bu protokol, damlacık dijital PCR (ddPCR) kullanarak plazma viral yük nicelik için bir test açıklar. Farelerin diyette standart bir cART rejimi ile nasıl etkili bir şekilde tedavi edilebildiğini gösteriyoruz. Düzenli fare chow şeklinde cART teslim deneysel modelin önemli bir arıtma olduğunu. Bu model hem sistemik hem de topikal ön pozlama profilaksisi bileşiklerinin klinik öncesi analizinde ve yeni tedavilerin ve HIV kür stratejilerinin test edilmesinde kullanılabilir.

Giriş

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) dünya çapında 37 milyondan fazla enfekte bireyler ile kronik bir enfeksiyondur^1. Kombinasyon antiviral tedavi (cART) bir hayat kurtarıcı tedavi, ama bir çare hala garanti edilir. Böylece, HIV sürekli araştırma kolaylaştırmak için insan bağışıklık sistemi ve tepkileri ayna hayvan modelleri için bir ihtiyaç vardır. Hücre ve doku engraftment destekleme yeteneğine sahip insanlaşmış farelerin birden fazla türü ciddi immünoeksik fareler içine insan hücreleri nakli ile geliştirilmiştir². Bu tür insanlaşmış fareler HIV enfeksiyonuna karşı hassastır ve insan olmayan primat simian immün yetmezlik virüs modellerine önemli bir alternatif sağlar, çünkü insan olmayan primatlardan daha ucuz ve kullanımı daha kolaydır. Humanized fareler HIV viral iletim araştırma kolaylaştırdı, patogenez, önleme, ve tedavi^{3,4,5,6,7,8,9,10,11}.

Biz NOD fareler içine kordon kanı kaynaklı insan kök hücreleri nakli tarafından geliştirilen HIV araştırma için esnek bir insanlaştırılmış model sistemi saiyoruz. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug/JicTac (NOG) arka plan. Fetal kökenli olmamasının yanı sıra, bu farelerin pratik biyomühendislik daha az teknik olarak kan-karaciğer timus (BLT) yapı nakli dahil mikrocerrahi işlemler egöre talep edilir.

İntravajinal iletim yoluyla HIV enfeksiyonunun nasıl kurulabildiğini ve hassas bir damlacık dijital PCR (ddPCR) tabanlı kurulum la plazma viral yükünün nasıl izlendiğini gösteriyoruz. Daha sonra, günlük fare diyetinin bir parçası olarak verilen standart cART'ın kurulmasını tanımlıyoruz. Bu kombine yöntemlerin amacı hayvanlariçin stresi azaltmak ve her hayvan ın kullanımı nda harcanan sürenin sınırlı olduğu büyük ölçekli deneyleri^{kolaylaştırmaktır 12.}

İnsanlarda, bir CCR5^Δ32/wt veya CCR5^{Δ32/ Δ32} genotip verici / kurucu virüsler¹³ile HIV enfeksiyonuna daha az duyarlılık neden olur , ve bazı önlemler zaman biyomühendislik insanlı fareler kök hücreleri ile HIV çalışmaları amacıyla alınması gerekir. CCR5 genidoğal olarak meydana gelen varyantları, özellikle Δ32 deletiyonları, dünyanın geri kalanına göre İskandinav ve Baltık yerli nüfuslarında daha yaygın olduğu için bu bölgemizde özellikle doğrudur^14,15. Bu nedenle protokolümüz, transplantasyon öncesi CCR5 varyantları için donör hematopoetik kök hücrelerin taranması için kolay, yüksek iş akışı testini içermektedir.

İntravajinal maruziyet için biz verici seçti / kurucusu R5 virüsü RHPA4259, intravajinal enfekte oldu enfeksiyonun erken bir aşamasında bir kadından izole¹⁶. Fareleri, farelerin çoğunda başarılı bir iletim sağlamak için yeterli olan viral bir doza maruz bıraktık, ama %100 iletim hızının altındaydı. Böyle bir dozun seçilmesi, bir ilaç adayının antiviral etkilerinin HIV önleme deneylerinde korunan hayvanlara ve tedavi çalışmaları için viral yükün azalmasına yol açabileceği şekilde iletim hızında yeterli bir dinamik aralık sağlar.

Protokol

Tüm kordon kanı örnekleri, ebeveynler tarafından isimsiz bağışın bilgilendirilmiş onayı da dahil olmak üzere, yerel olarak onaylanmış protokollere uygun olarak kesin olarak elde edilebildi. Tüm hayvan deneyleri 2017-15-0201-01312 lisansı kapsamında Danimarka ulusal yönetmeliklerine uygun olarak onaylanarak gerçekleştirilmiştir.

DİkKAT: HIV'e maruz kalan fareleri ve kanı son derece dikkatli kullanın. Hiv ile temas eden tüm yüzeyleri ve sıvıları doğrulanmış bir HIV dezenfektanı(Malzeme Tablosu)ile dezenfekte edin.

1. İnsan CD34+ kök hücrelerinin izolasyonu

1. Planlı sezaryen veya vajinal doğumlardan sonra ve yerel etik onaylara göre EDTA kaplı kan toplama tüplerinde kordon kanı örnekleri toplayın.
2. Üreticiprotokolüne göre yoğunluk-gradyan ayrımı ile PMC'leri kordon kanından izole edin.
3. Cd34+ hücrelerini PBMC popülasyonundan izole ederek, ilk olarak, istenmeyen soyhücrelerinin kırmızı kan hücreleriyle çapraz bağlanmasına neden olan olgun hücreler için ortak belirteçlere karşı antikorlarla önceden zenginleştirin. Bunu, üreticinin protokolüne göre manyetik boncuklar kullanılarak CD34+ hücre zenginleştirme takip eder.
   1. 90 μL'lik trypan mavisi 10 μL hücre süspansiyonuna yeniden silerek canlı hücre sayısını standart trypan mavisi hariç tutularak belirleyin. Üreticinin protokolüne göre bu çözeltinin 10 μL'sini hemacytometreye ekleyin ve mavi olmayan hücreleri sayın.
   2. Fare nakli gününe kadar fetal büyükbaş serumda (FBS) 1 mL'lik 1 mL'lik CD34+ hücrelerde uygulanabilir kriyokorun.
   3. Cd34+ kök hücre saflığını (her numunenin ~30.000 hücre) değerlendirmek için ayrı ayrı izole edilmiş (CD34+) ve akış hücrelerinin (CD34-) küçük bir kısmını canlı olarak korur. Alternatif olarak, taze zenginleştirilmiş hücreler üzerinde saflığı test edin (aşağıdaki adım 2'ye bakın).
   4. CCR5Δ32 durumunun belirlenmesi için peletli olmayan akış (CD34-) kısmını dondurun. Hücreler şartlı dondurma solüsyonu olmadan doğrudan dondurulabilir, ancak peletkırmızı kan hücrelerinin varlığı akış peletli ise sonraki PCR inhibe edebilir.

2. Cd34+ kök hücre saflığının akış sitometrisi ile değerlendirilmesi

1. İzole edilmiş hücreleri (CD34+) ve akış tan (CD34-) eritin. Her şişedeki hücreleri 9 mL oda sıcaklığında (RT) FACS tamponu içinde, fosfat tamponlu salinde (PBS) %2 fetal sığır serumu (FBS) içeren yeniden sulandırarak hücreleri yıkayın.
2. Pelet hücrelerine RT'de 300 x g'da 5 dk santrifüj.
3. Supernatant dökün, kalan sıvı hücreleri resuspend ve FACS tüpleri aktarın. 3 mL FACS tamponu ile yıkama adımını tekrarlayın. İkinci santrifüjden sonra, supernatant dökün ve kalan sıvı hücreleri resuspend.
4. 5 μL Fc Reseptör engelleme çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve RT'de 10 dakika bekletin. Fc Reseptör bloke çözeltisini yıkamayın.
5. İnsan CD3 (klon SK7) BUV395, CD34 (clone AC136), FITC ve CD45 (klon 2D1) APC(Tablo 1)karşı antikorların önceden belirlenmiş hacimleri içeren karışımı ekleyin. Karanlıkta RT'de hücreleri 30 dakika bekletin. Floroforlar, bir telafi matrisi gerektirmeden kullanılabilir akış sitometreleri ile değerlendirilebilecek parametrelere göre seçilmelidir.
6. Hücreleri 3 mL FACS arabelleği ile yıkayın.
7. Hücreleri pelet rt 300 x g 5 dakika santrifüj.
8. Supernatant dökün ve kalan sıvı hücreleri resuspend.
   1. Tüm bağlanmamış antikorların çıkarıldığından emin olmak için bu yıkama adım 2x tekrarlayın.
9. Örnekleri akış sitometresine(Malzeme Tablosu)kaydedin ve uygun yazılımla veri analizi yapın. Gating stratejisi Şekil 1A-F'desunulmuştur.

3. Kordon kanında CCR5Δ32 varyantları için genetik tarama

1. 200 μM dNTP karışımı, 0,01 U/μL yüksek doğrulukLU DNA polimeraz ve Tablo 2'deayrıntılı olarak belirtilen ileri ve ters astarlar içeren 11,25 μL PCR karışımı ile peletsiz akış 1.25 μL inkübat.
   1. Her PCR reaksiyonu için çekirdeğiz su ile hacmi yaklaşık 12,5 μL olarak ayarlayın.
2. Tablo 3'teayrıntılı olarak belirtilen PCR bisiklet programı ile genomik parçaları yükseltin.
3. PCR ürünlerini %2 agarose jel^13'teayırın.
   1. Yabani tip alellerden ve Δ32 alellerinden elde edilen PCR ürünleri sırasıyla 196 baz çifti ve 164 baz çifti bantlarından oluşan PCR parçaları vererek jel elektroforez¹³ (Şekil 1G)ile kolayca ayırt edilebilir hale getirir.

4. İntravenöz kök hücre nakli

NOT: Bir kişinin laboratuvardaki hücreleri hazırlaması, diğerinin ise fareleri ve çalışma alanını organ nakliiçin hazırlaması verimli bir yaklaşımdır.

1. Bir hayvan tesisinde, kök hücrelerin planlanan naklinden önce 4-6 saat, 6-7 haftalık dişi NOD ışınlama. Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Sug/JicTac (NOG) fareler(Malzeme Tablosu)ile 0.75 Gy ile cs¹³⁷ kaynak. En iyi önkoşullanma dozu fare yaşı, radyasyon kaynağı ve diğer faktörlere bağlı olarak değişebilir. Bu süreç, hayvanların insan kök hücreleri ile başarılı engraftment için koşullar.
2. Bir hayvan tesisinde, fareleri veya hücreleri çalışma alanına getirmeden önce akış tezgahı çalışma alanını ve tüm reaktifleri hazırlayın.
   1. Akış tezgahının çalışma yüzeyini kapsayacak şekilde steril mavi bir ped yerleştirin. Steril gazlı bez ve keskin bir kap hazırlayın.
   2. Isı altında boş bir steril fare kafesi ile akış tezgahına% 70 etanol ile dezenfekte bir ısıtma lambası yerleştirin.
3. Laboratuvarda izole CD34+ hücrelerini eritin ve 9 mL 37 °C düz RPMI ile seyreltin.
4. Hücreleri RT'de 5 dk için 350 x g'da santrifüj edin, aspirasyon la süpernatantatın ve 37 °C'de 1 mL düz RPMI'de peleti yeniden askıya alın.
5. Hücre sayısını trypan mavisi hariç tutularak belirleyin ve ses düzeyini fare başına 200 l'ye ayarlayın. Sonraki işleme adımları nedeniyle olası kayıpları dikkate almak için ekstra olun.
   1. Her fareye 200°L'de 75.000 CD34+ hücre nakletmeye hazır olun.
   2. Hücreler nakilden önce hayvan tesisine nakli sırasında 4 °C'de tutulabilir. Toplama veya kümelenme azaltmak için buz üzerinde hücreleri tutmak kaçının.
6. Hayvan tesisinde, farelerle birlikte kafesi akış tezgahına getirin ve kan damarlarını büyütmek için fareleri ısıtma lambasının altındaki kafese aktarın. Kafesin bir ucunu ısı kaynağından uzak bırakın, böylece fareler ısının ısısından uzaklaşabilsin. Kafesin sonuna kadar hareket eden fareler, ısı kaynağından uzakta, başarılı bir kuyruk damar enjeksiyonu için yeterince sıcaktır.
7. Askıda CD34+ hücreleri ile 800 μL işaretinin üzerine 1 mL yağlanmış şırınga yükleyin. Yağlanmış 1 mL şırınga kullanmak intravenöz enjeksiyonu önemli ölçüde kolaylaştıracak ve bu tekniğin hassasiyetini artıracaktır.
8. 30 G 13 mm iğne takın ve iğne ve şırıngayı enjeksiyon için hazırlayın. Bu çalışma sırası şırınganın daha hızlı yüklenmesini sağlarken, hücrelerin bu kadar küçük bir iğne ile hızlı aspirasyonu sırasında oluşabilecek olası hasar göz önüne alındığında nakledilecek hücrelerin bütünlüğünü korur. İğne göbeğini pistonuna basarak sıvıyla doldurun ve sıvıyı iğnenin 200 μL işaretine kadar çıkarın.
9. IV enjeksiyonları vermek için kullanılan bir dizginleyici ısıtmalı fare (adım 4.6) yerleştirin. Dikkatlice farenin kuyruk damarına hücre süspansiyon200 μL enjekte. Dalma gerçekleştirmek için 2 s harcayın ve enjeksiyon tamamlandıktan sonra yaklaşık 2 s için takılı iğne tutun. Bu, iğnenin çıkarılmasından önce hücrelerin enjeksiyon bölgesinden yeterince uzağa göç etmesini sağlar.
10. Gerektiğinde, herhangi bir görünür kan kaldırmak için steril gazlı bez ile fare kuyruğu silin. Fareyi ısıtılmayan ev kafesine geri koyun. Kalan fareler ile enjeksiyon işlemini tekrarlayın.

5. Kan toplama ve analiz için işleme

NOT: Periferik kandaki insan hücresi engreftasyonu, insan kök hücre naklinden 3-5 ay sonra akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.

1. Yerel IACUC onaylı teknikler kullanarak farelerden kan örnekleri alın.
2. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için 10 μL 0,5 M EDTA (pH = 8,0) içeren steril PCR mikrosantrifüj tüpleri içine toplam kan maksimum 70-100 μL toplayın.

6. Akış sitometrisi ile insan engreftasyonunun değerlendirilmesi

1. 40-50 μL'lik kanın FACS tüplerine aktarılması.
2. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 5 μL Fc Reseptör bloke edici çözelti ekleyin ve RT'de 10 dakika bekletin.
3. CD4 içeren fare anti-insan antikor karışımı ekleyin (klon SK3) BUV 496, CD8 (klon RPA-T8) BV421, CD3 (klon OKT3) FITC, CD19 (klon sj25c1) PE-Cy7, CD45 (klon 2D1) APC(Tablo 4) ve 30 dakika boyunca RT karanlıkta leke bırakmak.
4. Kırmızı kan hücrelerini lyse için her tüp için uygun bir kırmızı kan hücresi lysing tampon 2 mL ekleyin. Kırmızı kan hücresi lisisi öncesinde antikor boyama için özel olarak formüle edilmiş bir lisis tamponu kullanın (Malzeme Tablosundauygun bir örnek verilmiştir). Girdap kısaca lysing çözeltisindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak ve RT'de 10 dakika bekletmek için.
5. Lysis reaksiyonu durdurmak için FACS tampon 2 mL ekleyin.
6. Hücreleri pelet rt 300 x g 5 dakika santrifüj.
7. Hücreler yeniden askıya alınana kadar yavaşça supernatant ve girdap dökün.
8. RT'de 300 x g'da 5 dk'lık 3 mL FACS tamponu ve santrifüj ekleyin.
9. Supernatant dökün ve hücreleri resuspend.
10. Örnekleri uygun bir akış sitometresine kaydedin ve uygun yazılım(Tablo Malzemeler)kullanarak analiz edin. Temsili analiz ve sonuçlar Şekil 2 ve Şekil 3'tegösterilmiştir.

7. Intravajinal HIV maruziyeti

NOT: Farelerin intravajinal maruziyetinde kullanılan virüs daha önce yayınlanmış protokoller kullanılarak üretilebilir¹⁷. Virüs -80 °C'de tutulur ve yerel onaylı protokoller izleyerek kuru buzüzerinde saklanırken konumlar arasında taşınır. Virüs farelerin maruz kalma hemen öncesine kadar kuru buz üzerinde saklanır. Virüs düz RPMI içine seyreltilmiş olabilir (antibiyotik veya serum katkı maddeleri olan RPMI kaçının) maruz kalma hemen önce uygun konsantrasyonu elde etmek için (21.400 IUs bu IVAG maruz kalma için kullanılmıştır). Bir kez oluşturulduktan sonra, seyreltilmiş virüs bir kez çözülmüş kuru buz geri yerleştirilir eğer oluşacak donma-çözülme döngüleri önlemek için prosedür boyunca ıslak buz üzerinde seyreltilmiş stok tutun.

1. Fareleri veya virüsü akış tezgahına getirmeden önce Şekil 4'te sunulan tüm ekipman ve akış tezgahı çalışma alanını hazırlayın (adım 4.2'ye benzer).
   1. Isıtma lambası odağı, HIV'e maruz kalma işlemi sırasında farenin bulunacağı çalışma alanının ortasına yerleştirin. Isıtma lambası farelerin vücut ısısında azalma sağlamaz. Sıcaklığı kontrol eden diğer ekipmanlar da kullanılabilir ( örneğin, yerel IACUC yönetmeliklerine göre ısıtmalı jel ped veya dolaşan ılık su battaniyesi^18).
   2. Tezgahiçine steril 20 μL pipet uçları ve uygun bir pipet getirin. Virüsle temas eden malzemelerin ve sıvıların derhal inaktivasyonu için tezgaha sıvı dezenfektanlı(Malzeme Tablosu)içeren bir kap yerleştirin.
2. % 3 izofluran gaz ve kağıt havlu ile bir odaya bir fare yerleştirin. Gazın bu yüzdesi 2-4 dakika içinde hayvanları anestezik olacaktır. İmmün eksik farelerde kullanılan diğer tüm malzemelerde olduğu gibi, anestezi cihazı nın kullanılmadan önce düzgün bir şekilde dezenfekte edilmesi gerekir.
3. Anestezi yapıldıktan sonra fareyi ısıtma lambasının altındaki steril mavi bir pede aktarın. Anesteziyi korumak için sürekli %3 izofluran gazı sağlayan bir maskeye fare yitirin. Fareyi kuyruğun tabanında tutun, mide yukarı bakacak şekilde, elinizle fareyi Şekil 4'tetasvir edildiği gibi destekleyin.
4. Steril bir pipet ucu ile, rektum boşalma neden olmak için anüs doğru hafifçe yukarı okşayarak genital bölgeyi uyarmak, vajina üzerindeki baskıyı giderici.
5. Fare kuyruğunu parmaklarınız arasında sarmalayarak vajinal açıklığı dikkatlice çıplak tutarak vulva doğal olarak açılır, belki de steril bir pipet ucu kullanarak hafif dürtme ile.
6. Kabarcıklar oluşturmadan fare vajina içine atraumatically virüs pipet ucu ve pipet 20 μL değiştirin. Ucunu vajinanın derinliklerine sokmayın. Bunun yerine, vulva açıldı, vajinal açılış düzeyinde pipet ucu yerleştirin, aşılama işlemi sırasında aşınma potansiyelini ortadan kaldırmak için daha derin gitmekten kaçının, virüs serbest, ve yerçekimi vajina içine virüs çekmek için izin. Alternatif olarak, Veselinovic ve^{ark. 6'da}açıklandığı gibi 22 G 1.25 mm künt uçlu, düz iğne kullanın.
7. Virüs süspansiyon yerçekimi kaynaklı sızıntıyı önlemek için maruz kaldıktan sonra 5 dakika boyunca bakan vajina ile bu pozisyonda fare tutun.
   1. Fareyi dikkatlice ev kafesine yerleştirin ve fareyi sırtına yerleştirmeye özen din.

8. Viral yük analizi öncesinde kan örneklerinin işlenmesi

1. Yukarıdaki bölüm 5'te açıklandığı gibi kan toplayın.
2. Plazma ve hücreleri ayırmak için 5 dk 500 x g RT'de kan örneklerini santrifüj edin.
3. Viral yük ölçümü için 40 μL plazmayı yeni steril PCR onaylı mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve ilave işleme ye ne kadar -80 °C'de saklayın. RNA yalıtımından önce dondurulmamış numunelerdeki RNA düzeylerini RNA yalıtımı öncesinde dondurulmuş numunelere karşılaştırmaktan kaçınmak için RNA çıkarmadan önce tüm numuneleri dondurmak önemlidir.
4. 40 μL süspansiyon media (PBS %2,5 büyükbaş serum albumin, 50 U/mL penisilin G ve streptomisin ve 0,22 μm steril filtrelenmiş 10 U/mL DNase) ekleyerek kan hacmini orijinal hacmine ayarlayın.
5. Ayarlanan kan hacminin 15 μL'sini pcr onaylı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
6. 1 mL 1x RBC lysis çözeltisi(Malzeme Tablosu),girdap ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
7. Pelet hücrelerine RT'de 9.600 x g'da 1 dk santrifüj.
8. Aspire supernatant ve sadece küçük beyaz hücre pelet bırakın, kırmızı kan hücresi kontaminasyonu PCR inhibe çünkü.
9. Pelet'i -80 °C'de en az 1 saat daha fazla işleme ye kadar saklayın.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, adım 8.4 kalan kan, adım 6 yukarıda açıklandığı gibi, akış sitometri analizi için kullanılabilir.

9. Proteinaz K ekstraksiyon yöntemi ile DNA ekstraksiyonu

1. Aşağıda açıklandığı gibi proteinaz K ekstraksiyon yöntemi kullanarak periferik hücre peletlerinden (adım 8.8'de oluşturulan) DNA ayıklayın. Bu yöntem, bu çalışmada kullanılan seri kan koleksiyonları için gerekli olduğu gibi kan küçük bir hacim en yüksek DNA verimi ayıklamak için gösterilmiştir¹⁹.
2. 0.1M Tris tampon 1 mL proteinaz K (20 μg/mL) 25 μL ekleyin.
3. Girdap proteinaz K çözeltisi kısaca.
4. Sindirilecek her hücre peletine proteinaz K çözeltisinin 50 μL'sini ekleyin.
5. Yukarı ve aşağı boru ile karıştırın ve hücre pelet resuspension onaylamak.
6. Gerekirse yerinde tutmak için 56 °C'de 1 saat boyunca 400 rpm 'de (alete bağlı olarak) bir thermoshaker(Malzeme Tablosu)üzerinde sallayın.
7. Hemen ve aynı termoshaker, 95 °C'ye sıcaklık kayması ile proteinaz K inaktive ederken sallayarak ek bir 20 dakika devam ediyor.
8. Her numuneyi girdap.
9. Her numuneyi en az 30 dakika -80 °C'ye yerleştirin.
10. Çözülme, sonra istenmeyen hücresel parçaları pelet RT 1 dakika için 17.000 x g örnekleri santrifüj.
11. DNA içeren süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
12. DNA şablonu PCR için hazır. DNA şablonları -80 °C'de saklanabilir.

10. Viral RNA'nın RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve ddPCR niceliği

1. Üreticinin protokolü(Tablo Malzemeler)aşağıdaki bir virüs RNA izolasyon kiti ile çözülmüş fare plazmasından RNA izole Edin.
2. Örnek sütuna eklenmesinden sonra, plazma örneğindeki tüm DNA'nın alınmasını sağlamak için sütun üzerine bir DNase tedavi adımı ekleyin.
   1. Her numune için, kolona 95 μL RNase-free DNase çözeltisi (mix 2 μL RNaAse içermeyen DNase ve 98 μL reaksiyon arabelleği) ekleyin ve RT'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
3. RNA örneklerini daha fazla işleme den önce en az 1 saat boyunca -80 °C'de saklayın. RNA ekstraksiyonundan sonra tüm numunelerin dondurulması, dondurulmuş numuneler ile dondurulmamış örnekleri karşılaştırırken önyargı riskinden kaçınmak önemlidir.
4. Daha önce açıklandığı gibi reaktifler kullanarak ters transkriptaz adım kullanarak sentez cDNA²⁰. RNA'nın bozulmasını önlemek için cDNA reaksiyonuna 0,5 μL rNase inhibitörü eklediğinizden emin olun.
   1. Tablo 5'teayrıntılı olarak belirtilen program ile cDNA sentezini gerçekleştirin.
5. CDNA örneklerini -80 °C'de en az 1 saat saklayın. Dondurulmuş olmayan örnekleri dondurulmuş numuneler ile karşılaştırırken tüm numunelerin dondurulması önemlidir.
6. DDPCR için örnek hazırlama²⁰:
   1. CDNA numunesinin 3 μL'sini ddPCR prob karışımının 11 μL'si (dUTP yok)²⁰, 250 nM minör oluk bağlayıcı prob ve tablo 6'daayrıntılı olarak belirtilen ileri ve ters astarların her birinin 900 nM'sini karıştırın.
   2. Çekirdeksiz su ile toplam PCR hacmini 22°L'ye ayarlayın.
7. PcR üreticinin protokolü ve önceki açıklamalara göre bir damlacık jeneratör probları için Droplet Generation Oil ile karışımları emülsifiye²⁰.
8. PCRprogramını Tablo 7'de ayrıntılı olarak çalıştırın.
   NOT: Burada görüntülenen astar/sonda dizileri ve PCR programları, RHPA4259 HIV suşunun hassas tespiti için özel olarak tasarlanmış ve optimize edilmiştir. Astar ve sonda dizileri kolayca tercih edilen diğer HIV suş tespit etmek için ayarlanabilir.
9. Damlacık okuyucudaki örneklerden damlacık floresansını algıla ve sonuçları üreticinin protokolüne uygun uygun yazılımla analiz edin.

11. CART içeren chow ile tedavi

1. 4.800 mg/kg raltegravir (RAL), 720 mg/kg tenofovir disoproksil fumaat (TDF) ve 520 mg/kg emtricitabine (FTC)²¹ içeren standart cART rejimi içeren peletli fareleri besleyin (Tablo 8). Bu dozlar bir farenin 25 g ağırlığında olduğunu ve günde 4 g yemek yediğini varsayarsak belirlendi. Bu doz günlük 768 mg/kg RAL, 2.88 mg/kg TDF ve 83 mg/kg FTC^21'ekarşılık gelmektedir.
2. Reçeteli ilaçların harici bir satıcı (Bkz. Malzemeler Tablosu)tarafından hazırlanmış bir cART diyeti kullanın. Diğer şirketler de potansiyel olarak bu rejimi üretebilir. Kolayca sıradan fare chow ayırt etmek için kırmızı renkli bir cART diyet kullanın.
   1. Kolay ayrım için standart kahverengi renkte cART olmadan bir kontrol chow diyet üretin.
3. cART'ın başlatılması için, cART içeren chow diyeti ile steril fare kafesleri hazırlayın ve fareleri eski kafesten yeni kafese aktarın.
   1. Farelerin ağırlıklarını ve cART içeren chow tüketimini görsel inceleme ile izleyerek farelerin değişime uyum sağladığından emin olun.

Sonuçlar

Kök hücre saflık analizi için gating stratejisi Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 1A-C saflaştırılmış CD34+ popülasyonunu ve Şekil 1D-F CD34-akış-through'ı gösterir ve CD34+ popülasyonunun minimum miktarının izolasyon işleminde kaybolduğunu göstermektedir. İzole CD34+ kök hücrelerin saflığı %85-95 arasında ydı ve %1'den az T-hücre kontaminasyonu vardı.

Tartışmalar

Ağır bağışıklık sistemi zayıflamış fare suş NOD. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Sug/JicTac (NOG) insan hücreleri ve dokuların nakli için son derece uygundur. Bu farelerde hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık yolları tehlikeye girer. NOG ve NSG fareleri, kusurlu T ve B hücre fonksiyonu ile sonuçlanan bir Prkdc^scid mutasyonu barındırır. Ayrıca, bu fareler il-2, IL-4, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ve IL-21 gibi birçok anahtar sitokinler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blue pad	VWR	56616-031	Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7	BD Bioscience	557835
CD3 (clone OKT3) FITC	Biolegend	317306
CD3 (clone SK7) BUV395	BD Bioscience	564001
CD34 (clone AC136) FITC	Miltenyi	130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496	BD Bioscience	564652/51
CD45 (clone 2D1) APC	Biolegend	368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421	BD Bioscience	562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863025
DMSO	Merck	10,02,95,21,000
DNAse	Sigma	D4263	For suspension buffer
dNTP mix	Life Technologies	R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS)	Biowest	L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II	Stemcell	17896
EDTA	Invitrogen	15575-038
FACS Lysing solution 10X	BD	349202	Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton)	Falcon	352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX)	Biolegend	422302
Fetal bovine serum	Sigma	F8192-500
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17144002
Flowjo v.10
Gauze	Mesoft	157300	Should be sterilized prior to use
Heating lamp			Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk)	VWR	DOWC1597418
Isoflurane gas	Orion Pharma	9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer	BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved	Sarstedt	72692405
Mouse cART food	ssniff Spezialdiäten GmbH	Custom made product
Mouse restrainer		Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½"	BD	304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac	Taconic	NOG-F
Nuclease-free water	VWR chemicals	436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit	Macherey-Nagel	740691
PCR-approved microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X	Biowest	L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase	Life Technologies	F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier	ThermoScientific	2149P
Proteinase K	NEB	100005398
QuantaSoft software	Bio-Rad
QX100 Droplet Generator	Bio-Rad	1886-3008
QX100 Droplet Reader	Bio-Rad	186-3003
RBC lysis solution	Biolegend	420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer	Macherey-Nagel	740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor	ThermoScientific	10777-019
RPMI	Biowest	L0501-500	Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe	Henke Sass Wolf	5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080044
Thermoshaker	VWR	89370-910
Trypane blue	Sigma	T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0	ThermoFisher Scientific	15575-020
Virkon S (virus disinfectant)	Dupont	7511