Um Pipeline bioinforático para investigar a evolução molecular e a expressão genética usando RNA-seq

Resumo

O objetivo deste protocolo é investigar a evolução e expressão dos genes candidatos usando dados de sequenciamento de RNA.

Resumo

Destilar e relatar grandes conjuntos de dados, como dados de genoma inteiro ou transcriptome, é muitas vezes uma tarefa assustadora. Uma maneira de quebrar resultados é focar em uma ou mais famílias genéticas que são significativas para o organismo e estudar. Neste protocolo, delineamos etapas bioinformáticas para gerar uma filogenia e quantificar a expressão de genes de interesse. As árvores filogenéticas podem dar uma visão de como os genes estão evoluindo dentro e entre espécies, bem como revelar ortologia. Esses resultados podem ser aprimorados usando dados de RNA-seq para comparar a expressão desses genes em diferentes indivíduos ou tecidos. Estudos de evolução molecular e expressão podem revelar modos de evolução e conservação da função genética entre espécies. A caracterização de uma família genética pode servir de trampolim para estudos futuros e pode destacar uma importante família genética em um novo genoma ou papel transcriptome.

Introdução

Os avanços nas tecnologias de sequenciamento facilitaram o sequenciamento de genomas e transcriptomes de organismos não-modelos. Além da maior viabilidade do sequenciamento do DNA e do RNA de muitos organismos, uma abundância de dados está disponível publicamente para estudar genes de interesse. O objetivo deste protocolo é fornecer passos bioinforáticos para investigar a evolução molecular e a expressão de genes que possam desempenhar um papel importante no organismo de interesse.

Investigar a evolução de um gene ou gene familiar pode fornecer uma visão da evolução dos sistemas biológicos. Membros de uma família genética são tipicamente determinados pela identificação de motivos conservados ou sequências genéticas homólogos. A evolução da família genética foi previamente investigada usando genomas de organismos modelos distantes¹. Uma limitação para essa abordagem é que não está claro como essas famílias genéticas evoluem em espécies intimamente relacionadas e o papel de diferentes pressões seletivas ambientais. Neste protocolo, incluímos uma busca por homólogos em espécies intimamente relacionadas. Ao gerar uma filogenia a um nível de filogênio, podemos notar tendências na evolução da família genética, como a de genes conservados ou duplicações específicas de linhagem. Neste nível, também podemos investigar se genes são ortologs ou paralogs. Embora muitos homólogos provavelmente funcionem de forma semelhante entre si, isso não é necessariamente o caso². A incorporação de árvores filogenéticas nesses estudos é importante para resolver se esses genes homólogos são ortologs ou não. Nos eucariotes, muitos ortologos mantêm funções semelhantes dentro da célula, como evidenciado pela capacidade das proteínas mamíferas de restaurar a função dos ortologs de levedura³. No entanto, há casos em que um gene não ortologos realiza uma função caracterizada⁴.

As árvores filogenéticas começam a delinear relações entre genes e espécies, mas a função não pode ser atribuída apenas com base nas relações genéticas. Estudos de expressão genética combinados com anotações funcionais e análise de enriquecimento fornecem forte suporte para a função genética. Casos em que a expressão genética pode ser quantificada e comparada entre indivíduos ou tipos de tecidos podem ser mais reveladores da função potencial. O protocolo a seguir segue métodos usados na investigação de genes de opsina em Hydra vulgaris⁷, mas eles podem ser aplicados a qualquer espécie e qualquer família genética. Os resultados desses estudos fornecem uma base para uma investigação mais aprofundada sobre a função genética e redes genéticas em organismos não-modelo. Como exemplo, a investigação da filogenia das opsinas, que são proteínas que iniciam a cascata de fototransdução, dá contexto à evolução dos olhos e da detecção de luz^8,9,10,11. Neste caso, organismos não-modelos, especialmente espécies de animais basais, como cnidários ou ctenoforos, podem elucidar a conservação ou alterações na cascata de fototransdução e na visão através de claes^12,13,14. Da mesma forma, determinar a filogenia, expressão e redes de outras famílias genéticas nos informará sobre os mecanismos moleculares subjacentes às adaptações.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da UC Irvine.

1. Preparação da biblioteca RNA-seq

1. Isole o RNA usando os seguintes métodos.
   1. Coletar amostras. Se o RNA for extraído posteriormente, congele a amostra ou coloque na solução de armazenamento^{RNA 15} (Tabela de Materiais).
   2. Eutanize e disseque o organismo para separar tecidos de interesse.
   3. Extrair RNA total usando um kit de extração e purificar o RNA usando um kit de purificação de RNA(Tabela de Materiais)
      NOTA: Existem protocolos e kits que podem funcionar melhor para diferentes espécies e tipos de tecidos^16,17. Extraímos RNA de diferentes tecidos corporais de uma borboleta¹⁸ e uma Hidra^{gelatinosa 19} (ver discussão).
   4. Meça a concentração e a qualidade do RNA de cada amostra(Tabela de Materiais). Use amostras com números de integridade de RNA (RIN) superiores a 8, idealmente mais próximo de 9²⁰ para construir bibliotecas cDNA.
2. Construa biblioteca cDNA e sequência da seguinte forma.
   1. Construa bibliotecas cDNA de acordo com o manual de instruções de preparação da biblioteca (ver discussão).
   2. Determinar concentração e qualidade do CDNA(Tabela de Materiais).
   3. Multiplex as bibliotecas e sequenciá-las.

2. Acesse um cluster de computador

NOTA: A análise do RNA-seq requer manipulação de arquivos grandes e é melhor feita em um cluster de computador(Tabela de Materiais).

1. Faça login na conta de cluster do computador usando o username@clusterlocation de comando em uma janela de aplicativo terminal (Mac) ou PuTTY (Windows).

3. Obter leituras de RNA-seq

1. Obtenha leituras de RNA-seq da instalação de sequenciamento ou, para dados gerados em uma publicação, do repositório de dados onde foi depositado (3.2 ou 3.3).
2. Para baixar dados de repositórios como o ArrayExpress faça o seguinte:
   1. Pesquise no site usando o número de adesão.
   2. Encontre o link para baixar os dados e clique à esquerda e selecione Copiar link.
   3. Na janela do terminal, digite wget e selecione Colar link para copiar os dados no diretório para análise.
3. Para baixar os dados do NCBI Short Read Archive (SRA) siga estas etapas alternativas:
   1. No terminal baixe SRA Toolkit v. 2.8.1 usando wget.
      NOTA: Baixar e instalar programas no cluster do computador pode exigir acesso raiz, entrar em contato com o administrador do cluster do computador se a instalação falhar.
   2. Termine de instalar o programa digitando tar -xvf $TARGZFILE.
   3. Pesquise ncbi para obter o número de adesão sra para as amostras que você deseja baixar, ele deve ter o formato SRRXXXXXX.
   4. Obtenha os dados do RNA-seq digitando [local de srtoolkit]/bin/prefetch SRRXXXXXX NA janela do terminal.
   5. Para o tipo de arquivos emparelhados [sedetoolkit localização]/bin/fastq-dump -split-files SRRXXXXXX para obter dois arquivos de fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ e SRRXXXXXX_2.FASTQ).
      NOTA: Para fazer um conjunto Trinity de novo use o comando [sedetoolkit localização]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' -arquivos divididos SRRXXXXXX

4. Aparar adaptadores e leituras de baixa qualidade (opcional)

1. Instale ou carregue Trimmomatic²¹ v. 0.35 no cluster de computação.
2. No diretório onde os arquivos de dados RNA-seq estão localizados, digite um comando que inclua a localização do arquivo de frasco trimmomatic, os arquivos FASTQ de entrada, arquivos FASTQ de saída e parâmetros opcionais, como comprimento de leitura e qualidade.
   NOTA: O comando variará pela qualidade e comprimento brutos e desejados das leituras. Para leituras de Illumina 43 bp com primers Nextera, usamos: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. paired_READ1 FASTQ. unpaired_READ1 FASTQ. paired_READ2 FASTQ. unpaired_READ2 FASTQ. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.

5. Obter montagem de referência

1. Pesquise no Google, EnsemblGenomes e NCBI Genomas e Nucleotídeos TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) para obter um genoma de referência ou transcriptome montado para as espécies de interesse(Figura 1).
   NOTA: Se um genoma de referência ou transcriptome não estiver disponível ou de baixa qualidade, proceda ao PASSO 6 para gerar um conjunto de novo.
2. Se existir um genoma de referência ou transcriptome montado, baixe-o como um arquivo fasta para onde a análise será realizada seguindo as etapas abaixo.
   1. Encontre o link para baixar o genoma, clique à esquerda e Copy Link.
   2. Na janela do terminal digite wget e cole o endereço de link. Se disponível, copie também o arquivo GTF e o arquivo FASTA de proteína para o genoma de referência.

6. Gerar um conjunto de novo (Alternativa ao Passo 5)

1. Combine os arquivos RNA-seq READ1 e READ2 fastq para todas as amostras digitando gato *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ e gato *READ2. > all_READ2 FASTQ. FASTQ na janela do terminal.
2. Instale ou carregue o Trinity²² v.2.8.5 no cluster de computação.
3. Gerar e montagem digitando no terminal: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --esquerda $all_READ1. FASTQ --direita $all_READ2. O FASTQ.

7. Mapa lê para o genoma (7.1) ou de novo transcriptome (7.2)

1. O mapa lê para o genoma de referência usando STAR²³ v. 2.6.0c e RSEM²⁴ v. 1.3.0.
   1. Instale ou carregue STAR v. 2.6.0c. e RSEM v. 1.3.0 para o cluster de computação.
   2. Indexe o genoma digitando rsem-prepare-referência --gtf $GENOME. GTF -estrela -p 16 $GENOME. $OUTPUT FASTA.
   3. Mapa lê e calcula a expressão para cada amostra digitando rsem-calculate-expression -p 16 --star --emparelhado-end $READ 1. FASTQ $READ 2. $INDEX $OUTPUT FASTQ.
   4. Renomeie o arquivo de resultados para algo descritivo usando mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
   5. Gerar uma matriz de todas as contagens digitando rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.
2. Mapeie RNA-seq para o conjunto Trinity de novo usando RSEM e bowtie.
   1. Instale ou carregue Trinity²² v.2.8.5, Bowtie²⁵ v. 1.0.0 e RSEM v. 1.3.0.
   2. Mapa lê e calcula a expressão para cada amostra digitando [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcrições $TRINITY. FASTA --seqType fq --esquerda $READ 1. FASTQ - direita $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method bowtie --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
   3. Renomeie o arquivo de resultados para algo descritivo usando mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
   4. Gerar uma matriz de todas as contagens digitando [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genes/isoforms].resultados

8. Identificar genes de interesse

NOTA: As seguintes etapas podem ser feitas com arquivos nucleotídeos ou proteínas FASTA, mas funcionam melhor e são mais simples com sequências proteicas. Pesquisas de BLAST usando proteína para proteína são mais propensas a dar resultados na busca entre diferentes espécies.

1. Para um genoma de referência, use o arquivo FASTA de proteína do STEP 5.2.2 ou consulte Materiais Suplementares para gerar um recurso genético personalizado GTF.
2. Para um de novo transcriptome, gere uma proteína FASTA usando TransDecoder.
   1. Instale ou carregue TransDecoder v. 5.5.0 no cluser do computador.
   2. Encontre o quadro de leitura aberto mais longo e a sequência de peptídeos prevista digitando [transdecoder location]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. O FASTA.
3. Procure no NCBI Genbank por homólogos em espécies intimamente relacionadas.
   1. Abra uma janela do navegador de internet e vá para https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.
   2. Na barra de pesquisa digitam o nome do gene de interesse e o nome de espécies intimamente relacionadas que foram sequenciadas ou gêneros ou filo. À esquerda da barra de pesquisa selecione proteína e clique em pesquisar.
   3. Extrair sequências clicando em Enviar e, em seguida, selecionar Arquivo. Em Formato, selecione FASTA e clique em Criar Arquivo.
   4. Mova o arquivo FASTA de homólogos para o cluster do computador digitando scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR em uma janela de terminal local ou use FileZilla para transferir arquivos de e para computador e cluster.
4. Procure genes de candidatos usando BLAST+²⁶.
   1. Instale ou carregue BLAST+ v. 2.8.1 no cluster do computador.
   2. No cluster do computador, faça um banco de dados BLAST a partir do genoma ou transcriptome proteína traduzida FASTA digitando [localização BLAST+]/makeblastdb -em $PEP. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
   3. BLAST as sequências genéticas homólogos do NCBI para o banco de dados da espécie de interesse digitando [localização BLAST+]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.
   4. Exibir o arquivo de saída usando maiso comando . Copie iDs genéticos exclusivos da espécie de interesse para um novo arquivo de texto.
   5. Extrair as sequências de genes candidatos digitando perl -ne 'se(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 se @ARGV' $gene_id.txt $PEP. > $OUTPUT FASTA.
5. Confirme a anotação genética usando BLAST recíproco.
   1. No navegador da internet vá para https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
   2. Selecione tblastn, em seguida, cole as sequências do candidato, selecione o banco de dados de sequência de proteínas não redundante e clique em BLAST.
6. Identifique genes adicionais anotando todos os genes do genoma ou transcriptome com termos de ontologia genética (GO) (ver discussão).
   1. Transfira a proteína FASTA para o computador local.
   2. Baixe e instale o Blast2GO^27,28,29 v. 5.2 para o computador local.
   3. Abra o Blast2GO, clique em Arquivo,vá para Carga,vá para Sequências de carga,clique em Load Fasta File (fasta). Selecione o arquivo FASTA e clique em Carregar.
   4. Clique em Blast, escolha NCBI Blaste clique em Next. Editar parâmetros ou clicar em Next, editar parâmetros e clicar em Executar para encontrar a descrição genética mais semelhante.
   5. Clique em mapear e clique em Executar para pesquisar anotações de Gene Ontology para proteínas semelhantes.
   6. Em seguida, clique em interpro, selecione EMBL-EBI InterProe clique em Next. Editar parâmetros ou clicar em Seguire clique em Executar para procurar assinaturas de famílias e domínios de genes conhecidos.
   7. Exporte as anotações clicando em Arquivo,selecione Exportar,clique em Tabela de Exportação. Clique em Procurar, nomeie o arquivo, clique em Salvar, clique em Exportar.
   8. Pesquise na tabela de anotação termos de interesse do GO para identificar genes adicionais de candidatos. Extrair as sequências do arquivo FASTA (STEP 8.4.5)

9. Árvores filogenéticas

1. Baixe e instale MEGA³⁰ v. 7.0.26 no seu computador local.
2. Abra MEGA, clique em Alinhar,clique em Editar/Construir Alinhamento,selecione Criar um novo alinhamento clique em OK, selecione Proteína.
3. Quando a janela de alinhamento for aberta, clique em Editar,clique em Inserir sequências do arquivo e selecione o FASTA com sequências proteicas de genes candidatos e prováveis homólogos.
4. Selecione todas as sequências. Encontre o símbolo do braço e passe o mouse sobre ele. Deve-se dizer Alinhar sequências usando algoritmo MUSCLE^31. Clique no símbolo do braço e clique em Alinhar proteína para alinhar as sequências. Editar parâmetros ou clicar em OK para alinhar usando parâmetros padrão.
5. Inspecione visualmente e faça quaisquer alterações manuais e, em seguida, salve e feche a janela de alinhamento.
6. Na janela PRINCIPAL MEGA, clique em Modelos,clique em Encontrar os melhores modelos de DNA/proteína (ML), selecione o arquivo de alinhamento e selecione parâmetros correspondentes como: Análise: Seleção de Modelo (ML), Árvore para usar: Automática (árvore de junção vizinha), Método Estatístico: Probabilidade Máxima, Tipo de Substituição: Aminoácido, Tratamento de dados Gap/ausente: Use todos os sites, Filtro do site do ramo: Nenhum.
7. Uma vez determinado o melhor modelo para os dados, vá para a janela MEGA principal. Clique em Phylogeny e clique em Árvore de Máxima Probabilidade e selecione o alinhamento, se necessário. Selecione os parâmetros apropriados para a árvore: Método estatístico: Máxima Probabilidade, Teste de Filogenia: Método Bootstrap com 100 réplicas, tipo de substituição: aminoácido, modelo: LG com Freqs. (+F), taxas entre os locais: gama distribuída (G) com 5 categorias gama discretas, tratamento de dados gap/missing: use todos os locais, método heurístico ML: Near-Neighbor-Interchange (NNI).

10. Visualize a expressão genética usando TPM

1. Para Trinity, no cluster do computador vá para o diretório onde abundance_estimates_to_matrix.pl foi executado e uma das saídas deve ser matriz. TPM.not_cross_norm. Transfira este arquivo para o seu computador local.
   NOTA: Consulte Materiais Suplementares para normalização da amostra cruzada.
2. Para TPMs de uma análise de genoma siga os passos abaixo.
   1. No cluster do computador, vá para o local de instalação do RSEM. Copie a matriz rsem-generate-data,digitando scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Use nano para editar o novo arquivo e alterar "meu $offsite = 4" de 4 para 5 para TPM, ele agora deve ler "meu $offsite = 5".
3. Vá para o diretório onde os arquivos de saída RSEM .genes.results estão e agora use rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT para gerar uma matriz TPM. Transferir resultados para um computador local.
4. Visualize os resultados em ggplot2.
   1. Baixe R v. 4.0.0 e RStudio v. 1.2.1335 para um computador local.
   2. Abra rstudio à direita da tela vá para a guia Pacotes e clique em Instalar. Digite ggplot2 e clique em instalar.
   3. Na janela do script R lida na tabela TPM digitando dados<-read.table ("$tpm.txt", cabeçalho = T)
   4. Para gráficos de barra semelhantes à Figura 4 digitam algo semelhante a: p<-ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity")
      preenchimento<-c("#d7191c", "#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6")
      p<-p+scale_fill_manual(valores=preenchimento)
      p + tema (axis.text.x = element_text(ângulo = 90))

Resultados

Os métodos acima são resumidos na Figura 1 e foram aplicados a um conjunto de dados de tecidos hydra vulgaris. H. vulgaris é um invertebrado de água doce que pertence ao filo Cnidaria que também inclui corais, águas-vivas e anêmonas do mar. H. vulgaris pode se reproduzir assexualmente brotando e eles podem regenerar a cabeça e o pé quando bissecto. Neste estudo, buscou-se investigar a evolução e expressão dos genes opsin na Hydra

Discussão

O objetivo deste protocolo é fornecer um esboço das etapas para caracterizar uma família genética usando dados RNA-seq. Estes métodos têm sido comprovados para funcionar para uma variedade de espécies e conjuntos de dados^4,34,35. O gasoduto aqui estabelecido foi simplificado e deve ser fácil o suficiente para ser seguido por um novato em bioinformática. O significado do protocolo é que ele delineia todas as etapas e pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioanalyzer-DNA kit	Agilent	5067-4626	wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kit	Agilent	5067-1513	wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1			On computer cluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (on your PC)			On local computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0			On computer cluster
Bowtie v. 1.0.0			On computer cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (highly recommended)			NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.
Cufflinks v. 2.2.1			On computer cluster
edgeR v. 3.26.8 (in R)			In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0			On computer cluster
Java v. 11.0.2			On computer cluster
MEGA7 (on your PC)			On local computer https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1			On local computer https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kit	Macherey-Nagel	740955.5	wet lab materials
perl 5.30.3			On computer cluster
python			On computer cluster
Qubit 2.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q32866	wet lab materials
R v.4.0.0			On computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlater	ThermoFisher	AM7021	wet lab materials
RNeasy kit	Qiagen	74104	wet lab materials
RSEM v. 1.3.0			Computer software https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335			On local computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3			Computer software
SRA Toolkit v. 2.8.1			On computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0c			On computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4d			On computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0			On computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35			On computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5			On computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzol	ThermoFisher	15596018	wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2	Illumina	RS-122-2001	wet lab materials
TURBO DNA-free Kit	ThermoFisher	AM1907	wet lab materials
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.