JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является исследование эволюции и экспрессии генов-кандидатов с использованием данных секвенирования РНК.

Аннотация

Дистилляция и представление больших наборов данных, таких как данные всего генома или транскриптома, часто является сложной задачей. Один из способов разбить результаты — сосредоточиться на одном или нескольких семействах генов, которые важны для организма и исследования. В этом протоколе мы описываем биоинформативные шаги для создания филогении и количественной оценки экспрессии генов, представляющих интерес. Филогенетические деревья могут дать представление о том, как гены развиваются внутри и между видами, а также выявить орфографию. Эти результаты могут быть улучшены с использованием данных RNA-seq для сравнения экспрессии этих генов у разных людей или тканей. Исследования молекулярной эволюции и экспрессии могут выявить способы эволюции и сохранения функции генов между видами. Характеристика семейства генов может служить трамплином для будущих исследований и может выделить важное семейство генов в новом геноме или транскриптоме.

Введение

Достижения в области технологий секвенирования облегчили секвенирование геномов и транскриптомов немоделированных организмов. В дополнение к повышенной возможности секвенирования ДНК и РНК от многих организмов, обилие данных является общедоступным для изучения генов, представляющих интерес. Целью этого протокола является предоставление биоинформатических шагов для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов, которые могут играть важную роль в интересуемом организме.

Исследование эволюции гена или семейства генов может дать представление об эволюции биологических систем. Члены семейства генов обычно определяются путем идентификации сохраненных мотивов или гомологичных последовательностей генов. Эволюция семейства генов ранее исследовалась с использованием геномов отдаленно связанных модельных организмов1. Ограничением этого подхода является то, что неясно, как эти семейства генов развиваются у близкородственных видов и роль различных селективных давлений окружающей среды. В этот протокол мы включаем поиск гомологов у близкородственных видов. Генерируя филогенез на уровне типа, мы можем отметить тенденции в эволюции семейства генов, такие как сохранение генов или дупликации, специфичные для линии. На этом уровне мы также можем исследовать, являются ли гены ортологами или паралогами. Хотя многие гомологи, вероятно, функционируют аналогично друг другу, это не обязательно так2. Включение филогенетических деревьев в эти исследования важно для решения вопроса о том, являются ли эти гомологичные гены ортологами или нет. У эукариот многие ортологи сохраняют аналогичные функции внутри клетки, о чем свидетельствует способность белков млекопитающих восстанавливать функцию дрожжевых ортологов3. Однако есть случаи, когда неортологичный ген выполняет характерную функцию4.

Филогенетические деревья начинают очертивать отношения между генами и видами, но функция не может быть назначена исключительно на основе генетических связей. Исследования экспрессии генов в сочетании с функциональными аннотациями и анализом обогащения обеспечивают сильную поддержку функции генов. Случаи, когда экспрессия генов может быть количественно оценена и сравнена между людьми или типами тканей, могут быть более показательными для потенциальной функции. Следующий протокол следует методам, используемым при исследовании генов опсина в Hydra vulgaris7,но они могут быть применены к любому виду и любому семейству генов. Результаты таких исследований обеспечивают основу для дальнейшего изучения функции генов и генных сетей в немоделовых организмах. В качестве примера, исследование филогении опсинов, которые являются белками, которые инициируют каскад фототрансдукции, дает контекст эволюции глаз и обнаружения света8,9,10,11. В этом случае немодельные организмы, особенно базальные виды животных, такие как книдарии или гребневицы, могут прояснить сохранение или изменения в каскаде фототрансдукции и зрения черезклады 12,13,14. Точно так же определение филогении, экспрессии и сетей других семейств генов проинформирует нас о молекулярных механизмах, лежащих в основе адаптаций.

протокол

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными UC Irvine.

1. Подготовка библиотеки РНК-seq

  1. Изолируйте РНК с помощью следующих методов.
    1. Соберите образцы. Если РНК должна быть извлечена в более позднее время, флэш-заморозьте образец или поместите в раствор для хранения РНК15 (Таблица материалов).
    2. Усыпить и препарировать организм, чтобы отделить ткани, представляющие интерес.
    3. Извлеките общую РНК с помощью экстракционного набора и очистите РНК с помощью набора для очистки РНК (Таблица материалов)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют протоколы и наборы, которые могут работать лучше для различных видов и типов тканей16,17. Мы извлекли РНК из разных тканей организма бабочки18 и желатиновой гидры19 (см. обсуждение).
    4. Измерьте концентрацию и качество РНК каждого образца(Таблица материалов). Используйте образцы с числами целостности РНК (RIN) выше 8, в идеале ближе к 920 для создания библиотек кДНК.
  2. Постройте библиотеку и последовательность кДНК следующим образом.
    1. Создавайте библиотеки кДНК в соответствии с инструкцией по подготовке библиотек (см. обсуждение).
    2. Определение концентрации и качества кДНК(Таблица материалов).
    3. Мультиплексирует библиотеки и упорядочивает их.

2. Доступ к кластеру компьютеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ RNA-seq требует манипуляций с большими файлами и лучше всего выполняется на компьютерном кластере (Таблица материалов).

  1. Войдите в учетную запись кластера компьютеров с помощью команды ssh username@clusterlocation в окне приложения терминала (Mac) или PuTTY (Windows).

3. Получение считывания РНК-seq

  1. Получение считывания РНК-секв из средства секвенирования или, для данных, сгенерированных в публикации, из хранилища данных, где они были депонированы (3.2 или 3.3).
  2. Чтобы загрузить данные из репозиториев, таких как ArrayExpress, выполните следующие действия.
    1. Выполните поиск по сайту по номеру присоединения.
    2. Найдите ссылку для загрузки данных, затем щелкните левой кнопкой мыши и выберите Копировать ссылку.
    3. В окне терминала введите wget и выберите Вставить ссылку, чтобы скопировать данные в каталог для анализа.
  3. Чтобы загрузить данные NCBI Short Read Archive (SRA), выполните следующие альтернативные действия:
    1. На терминале загрузите SRA Toolkit v. 2.8.1 с помощью wget.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка и установка программ в кластер компьютеров может потребовать доступа root, обратитесь к администратору кластера компьютера в случае сбоя установки.
    2. Завершите установку программы, набрав tar -xvf $TARGZFILE.
    3. Выполните поиск в NCBI по номеру присоединения SRA для образцов, которые вы хотите загрузить, он должен иметь формат SRRXXXXXX.
    4. Получите данные RNA-seq, набрав [расположение sratoolkit]/bin/prefetch SRRXXXXXX в окне терминала.
    5. Для сопряженных файлов введите [расположение sratoolkit]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX, чтобы получить два файла fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ и SRRXXXXXX_2.FASTQ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сборки Trinity de novo используйте команду [расположение sratoolkit]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX

4. Обрезка адаптеров и некачественные считываемые материалы (опционально)

  1. Установите или загрузите Trimmomatic21 v. 0.35 в вычислительном кластере.
  2. В каталоге, где расположены файлы данных RNA-seq, введите команду, включаемую расположение триммоматного jar-файла, входные файлы FASTQ, выходные файлы FASTQ и дополнительные параметры, такие как длина и качество чтения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Команда будет варьироваться в зависимости от необработанного и желаемого качества и продолжительности чтения. Для чтения Illumina 43 bp с помощью праймеров Nextera мы использовали: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. ФАСТК $READ 2. paired_READ1 FASTQ. unpaired_READ1 FASTQ. paired_READ2 FASTQ. unpaired_READ2 FASTQ. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 СКОЛЬЗЯЩЕЕ ВИНО:4:17 MINLEN:30.

5. Получение эталонной сборки

  1. Поиск в Google, EnsemblGenomes и NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) для эталонного генома или собранного транскриптома для интересующих видов(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эталонный геном или транскриптом недоступны или имеют низкое качество, перейдите к ШАГУ 6 для создания сборки de novo.
  2. Если существует эталонный геном или собранный транскриптом, загрузите его в виде файла fasta, где будет выполнен анализ, выполнив следующие действия.
    1. Найдите ссылку для загрузки генома, щелкните левой кнопкой мыши и скопируйте ссылку.
    2. В окне терминала введите wget и вставьте адрес ссылки. Если доступно, также скопируйте файл GTF и файл белка FASTA для эталонного генома.

6. Создание сборки de novo (альтернатива шагу 5)

  1. Объедините файлы RNA-seq READ1 и READ2 fastq для всех образцов, набрав cat *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ и кот *READ2. > all_READ2 FASTQ. FASTQ в окне терминала.
  2. Установите или загрузите Trinity22 v.2.8.5 в вычислительном кластере.
  3. Генерация и сборка путем ввода на терминале: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --правый $all_READ2. ФАСТК.

7. Карта считывается с геномом (7.1) или de novo транскриптомом (7.2)

  1. Карта считывается с эталонный геном с использованием STAR23 v. 2.6.0c и RSEM24 v. 1.3.0.
    1. Установите или загрузите STAR v. 2.6.0c. и RSEM v. 1.3.0 для вычислительного кластера.
    2. Индексировать геном путем типизации rsem-prepare-reference --gtf $GENOME. GTF --звезда -p 16 $GENOME. $OUTPUT ФАСТА.
    3. Map считывает и вычисляет выражение для каждого образца, вводя rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1. ФАСТК $READ 2. $INDEX $OUTPUT FASTQ.
    4. Переименуйте файл результатов в описательный, используя mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    5. Сгенерируйте матрицу всех счетчиков, набрав rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.
  2. Нанесите RNA-seq на сборку Trinity de novo с помощью RSEM и галстука-бабочки.
    1. Установите или загрузите Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 и RSEM v. 1.3.0.
    2. Map считывает и вычисляет выражение для каждого образца, вводя [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --левый $READ 1. FASTQ --правый $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method галстук-бабочка --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
    3. Переименуйте файл результатов в описательный, используя mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
    4. Сгенерируйте матрицу всех счетчиков, набрав [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[гены/изоформы].results

8. Определите гены, представляющие интерес

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут быть выполнены с нуклеотидными или белковыми файлами FASTA, но работают лучше всего и более просты с белковыми последовательностями. Поиск BLAST с использованием белка к белку с большей вероятностью даст результаты при поиске между различными видами.

  1. Для эталонного генома используйте файл белка FASTA из STEP 5.2.2 или см. Дополнительные материалы для создания пользовательского генного признака GTF.
  2. Для транскриптома de novo сгенерируйте белок FASTA с помощью TransDecoder.
    1. Установите или загрузите TransDecoder v. 5.5.0 на компьютер cluser.
    2. Найдите самый длинный открытый кадр считывания и предсказав последовательность пептидов, набрав [Расположение трансдекодера]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. ФАСТА.
  3. Поиск омологов близкородственных видов в NCBI Genbank.
    1. Откройте окно интернет-браузера и перейдите в https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.
    2. В строке поиска введите название интересуемого гена и название близкородственных видов, которые были секвенированы или род или тип. В левой части строки поиска выберите белок и нажмите кнопку поиска.
    3. Извлеките последовательности, нажав кнопку Отправить, а затем выберите Файл. В разделе Формат выберите FASTA и нажмите Кнопка Создать файл.
    4. Переместите файл гомологов FASTA в кластер компьютеров, набрав scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR в окне локального терминала, или используйте FileZilla для передачи файлов на компьютер и кластер и с него.
  4. Поиск генов-кандидатов с помощью BLAST+26.
    1. Установите или загрузите BLAST+ v. 2.8.1 в кластере компьютеров.
    2. В компьютерном кластере сделайте базу данных BLAST из генома или транскриптома, переведенного белка FASTA, набрав [BLAST+ location]/makeblastdb -in $PEP. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
    3. BLAST гомологичные последовательности генов из NCBI в базу данных интересующих видов путем ввода [BLAST+ location]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.
    4. Просмотрите выходной файл с помощью команды подробнее. Скопируйте уникальные идентификаторы генов интересующих видов в новый текстовый файл.
    5. Извлеките последовательности генов-кандидатов, набрав perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP. > $OUTPUT ФАСТА.
  5. Подтвердите аннотацию гена с помощью реципрокного BLAST.
    1. В интернет-браузере перейдите в https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
    2. Выберите tblastn, затем вставьте последовательности-кандидаты, выберите базу данных неизбыточных белковых последовательностей и нажмите КНОПКУ BLAST.
  6. Идентификация дополнительных генов путем аннотирования всех генов в геноме или транскриптоме терминами генной онтологии (GO) (см. обсуждение).
    1. Перенесите белок FASTA на локальный компьютер.
    2. Загрузите и установите Blast2GO27,28,29 v. 5.2 на локальный компьютер.
    3. Откройте Blast2GO, щелкните Файл,перейдите в Загрузить,перейдите в Загрузить последовательности, нажмите Загрузить файл Fasta (fasta). Выберите файл FASTA и нажмите кнопку Загрузить.
    4. Нажмите «Blast», выберите NCBI Blastи нажмите «Далее». Отредактируйте параметры или нажмите кнопку Далее,отредактируйте параметры и нажмите кнопку Выполнить, чтобы найти наиболее похожее описание гена.
    5. Щелкните сопоставление, а затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы выполнить поиск похожих белков в аннотациях Gene Ontology.
    6. Затем щелкните interpro, выберите EMBL-EBI InterProи нажмите кнопку Далее. Измените параметры или нажмите кнопку Далееи нажмите кнопку Выполнить для поиска сигнатур известных семейств генов и доменов.
    7. Экспортируйте аннотации, щелкнув Файл,выбрав Экспорт, нажмите экспорт таблицы. Нажмите кнопку Обзор, присвойте файлу имя, нажмите кнопку Сохранить,нажмите кнопку Экспорт.
    8. Выполните поиск в таблице аннотаций по интересующих терминов GO, чтобы определить дополнительные гены-кандидаты. Извлеките последовательности из файла FASTA (ШАГ 8.4.5)

9. Филогенетические деревья

  1. Загрузите и установите MEGA30 v. 7.0.26 на локальный компьютер.
  2. Откройте MEGA, нажмите «Выровнять»,нажмите «Редактировать/Построить выравнивание»,выберите «Создать новое выравнивание», нажмите OK, выберите «Белок».
  3. Когда откроется окно выравнивания, нажмите «Редактировать»,нажмите «Вставить последовательности из файла» и выберите FASTA с белковыми последовательностями генов-кандидатов и вероятными гомологами.
  4. Выберите все последовательности. Найдите символ руки и наведите на него курсо. Следует сказать Выровнять последовательности с помощью алгоритма MUSCLE31. Щелкните символ руки, а затем щелкните Выровнять белок, чтобы выровнять последовательности. Измените параметры или нажмите кнопку ОК, чтобы выровнять параметры по умолчанию.
  5. Визуально проверьте и внесите любые изменения вручную, затем сохраните и закройте окно выравнивания.
  6. В главном окне MEGA нажмите на Модели,нажмите Найти лучшие модели ДНК / белка (ML),выберите файл выравнивания и выберите соответствующие параметры, такие как: Анализ: Выбор модели (ML), Дерево для использования: Автоматический (дерево соединения соседей), Статистический метод: Максимальная вероятность, Тип замены: Аминокислота, Обработка пробелов / отсутствующих данных: Использовать все сайты, Фильтр сайта ветвей: Нет.
  7. После того, как будет определена лучшая модель для данных, перейдите в главное окно MEGA. Щелкните Филогения, щелкните Дерево максимальной вероятности Contruct/Test, а затем при необходимости выберите выравнивание. Выберите подходящие параметры для дерева: Статистический метод: Максимальная вероятность, Тест на филогения: Метод Bootstrap со 100 репликами, Тип подстановки: аминокислота, Модель: LG с Freqs. (+F), показатели среди участков: гамма-распределенный (G) с 5 дискретными гамма-категориями, обработка разрывов/отсутствующих данных: использование всех сайтов, ЭВРИСТИЧЕСКИЙ метод ML: Ближайший-Сосед-Обмен (NNI).

10. Визуализация экспрессии генов с помощью доверенного платформенного модуля

  1. Для Trinity на компьютере кластера перейдите в каталог, в котором был запущен abundance_estimates_to_matrix.pl и одним из выходов должна быть matrix. TPM.not_cross_norm. Перенесите этот файл на локальный компьютер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительные материалы для перекрестной нормализации проб.
  2. Для TPM из анализа генома выполните следующие действия.
    1. В кластере компьютеров перейдите в папку установки RSEM. Скопируйте rsem-generate-data-matrix, введя scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Используйте nano для редактирования нового файла и измените «my $offsite = 4» с 4 на 5 для TPM, теперь он должен читать «мой $offsite = 5».
  3. Перейдите в каталог, где находятся выходные файлы RSEM .genes.results, и теперь используйте rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT для создания матрицы TPM. Передача результатов на локальный компьютер.
  4. Визуализируйте результаты в ggplot2.
    1. Загрузите R v. 4.0.0 и RStudio v. 1.2.1335 на локальный компьютер.
    2. Откройте RStudio в правой части экрана, перейдите на вкладку Пакеты и нажмите Установить. Введите ggplot2 и нажмите кнопку Установить.
    3. В окне сценария R прочитайте в таблице доверенного платформенного модуля, введя данные<-read.table("$tpm.txt",header = T)
    4. Для гистограмм, подобных рисунку 4, введите что-то похожее на: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity")
      заполнить<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6")
      p<-p+scale_fill_manual(значения=заливка)
      p + тема(ось.текст.x = element_text(угол = 90))

Результаты

Приведенные выше методы обобщены на рисунке 1 и были применены к набору данных тканей Hydra vulgaris. H. vulgaris является пресноводным беспозвоночным, которое принадлежит к типу Cnidaria, который также включает кораллы, медузы и морские анемоны. H. vulgaris может размнож...

Обсуждение

Цель этого протокола состоит в том, чтобы дать краткое описание шагов для характеристики семейства генов с использованием данных RNA-seq. Было доказано, что эти методы работают для различных видов и наборов данных4,34,35. Созданный здесь кон?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Адриану Бриско, Гила Смита, Раби Мурада и Алин Г. Рангел за советы и рекомендации по включению некоторых из этих шагов в наш рабочий процесс. Мы также благодарны Кэтрин Уильямс, Элизабет Реббоа и Наташе Пиччиани за комментарии к рукописи. Эта работа была частично поддержана стипендией Фонда Джорджа Э. Хьюитта для медицинских исследований A.M.M.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalyzer-DNA kitAgilent5067-4626wet lab materials
Bioanalyzer-RNA kitAgilent5067-1513wet lab materials
BLAST+ v. 2.8.1On computer cluster*
https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/
Blast2GO (on your PC)On local computer
https://www.blast2go.com/b2g-register-basic
boost v. 1.57.0On computer cluster
Bowtie v. 1.0.0On computer cluster
https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/
Computing cluster (highly recommended)NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.
Cufflinks v. 2.2.1On computer cluster
edgeR v. 3.26.8 (in R)In Rstudio
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
gcc v. 6.4.0On computer cluster
Java v. 11.0.2On computer cluster
MEGA7 (on your PC)On local computer
https://www.megasoftware.net
MEGAX v. 0.1On local computer
https://www.megasoftware.net
NucleoSpin RNA II kitMacherey-Nagel740955.5wet lab materials
perl 5.30.3On computer cluster
pythonOn computer cluster
Qubit 2.0 FluorometerThermoFisherQ32866wet lab materials
R v.4.0.0On computer cluster
https://cran.r-project.org/src/base/R-4/
RNAlaterThermoFisherAM7021wet lab materials
RNeasy kitQiagen74104wet lab materials
RSEM v. 1.3.0Computer software
https://deweylab.github.io/RSEM/
RStudio v. 1.2.1335On local computer
https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download
Samtools v. 1.3Computer software
SRA Toolkit v. 2.8.1On computer cluster
https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
STAR v. 2.6.0cOn computer cluster
https://github.com/alexdobin/STAR
StringTie v. 1.3.4dOn computer cluster
https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/
Transdecoder v. 5.5.0On computer cluster
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases
Trimmomatic v. 0.35On computer cluster
http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Trinity v.2.8.5On computer cluster
https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases
TRIzolThermoFisher15596018wet lab materials
TruSeq RNA Library Prep Kit v2IlluminaRS-122-2001wet lab materials
TURBO DNA-free KitThermoFisherAM1907wet lab materials
*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.

Ссылки

  1. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
  2. Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene orthology. Nature Reviews Genetics. 14 (5), 360-366 (2013).
  3. Dolinski, K., Botstein, D. Orthology and Functional Conservation in Eukaryotes. Annual Review of Genetics. 41 (1), (2007).
  4. Macias-Muñoz, A., McCulloch, K. J., Briscoe, A. D. Copy number variation and expression analysis reveals a non-orthologous pinta gene family member involved in butterfly vision. Genome Biology and Evolution. 9 (12), 3398-3412 (2017).
  5. Cannon, S. B., Mitra, A., Baumgarten, A., Young, N. D., May, G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana. BMC plant biology. 4, 10 (2004).
  6. Eastman, S. D., Chen, T. H. P., Falk, M. M., Mendelson, T. C., Iovine, M. K. Phylogenetic analysis of three complete gap junction gene families reveals lineage-specific duplications and highly supported gene classes. Genomics. 87 (2), 265-274 (2006).
  7. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), 1-19 (2019).
  8. Hisatomi, O., Tokunaga, F. Molecular evolution of proteins involved in vertebrate phototransduction. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 133 (4), 509-522 (2002).
  9. Arendt, D. Evolution of eyes and photoreceptor cell types. International Journal of Developmental Biology. 47, 563-571 (2003).
  10. Shichida, Y., Matsuyama, T. Evolution of opsins and phototransduction. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1531), 2881-2895 (2009).
  11. Porter, M. L., et al. Shedding new light on opsin evolution. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1726), 3-14 (2012).
  12. Plachetzki, D. C., Degnan, B. M., Oakley, T. H. The origins of novel protein interactions during animal opsin evolution. PLoS ONE. 2 (10), 1054 (2007).
  13. Ramirez, M. D., et al. The last common ancestor of most bilaterian animals possessed at least nine opsins. Genome Biology and Evolution. 8 (12), 3640-3652 (2016).
  14. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biology. 10, 107 (2012).
  15. Pedersen, K. B., Williams, A., Watt, J., Ronis, M. J. Improved method for isolating high-quality RNA from mouse bone with RNAlater at room temperature. Bone Reports. 11, 100211 (2019).
  16. Ridgeway, J. A., Timm, A. E., Fallon, A. Comparison of RNA isolation methods from insect larvae. Journal of Insect Science. 14 (1), 4-8 (2014).
  17. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-Seq: Implications for differential expression and meta-Analyses. BMC Genomics. 21 (1), 1-9 (2020).
  18. Briscoe, A. D., et al. Female behaviour drives expression and evolution of gustatory receptors in butterflies. PLoS genetics. 9 (7), 1003620 (2013).
  19. Murad, R., Macias-Muñoz, A., Wong, A., Ma, X., Mortazavi, A. Integrative analysis of Hydra head regeneration reveals activation of distal enhancer-like elements. bioRxiv. , 544049 (2019).
  20. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. Impact of RNA degradation on measurements of gene expression. BMC Biology. 12, 42 (2014).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Trinity. . RNA-Seq De novo Assembly Using Trinity. , 1-7 (2014).
  23. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  24. Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics. 12, 323 (2011).
  25. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
  26. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).
  27. Conesa, A., Götz, S. Blast2GO: A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics. International Journal of Plant Genomics. 619832, (2008).
  28. Conesa, A., et al. Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).
  29. Götz, S., et al. High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Research. 36 (10), 3420-3435 (2008).
  30. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular biology and evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  31. Edgar, R. C. MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  32. Taddei-Ferretti, C., Musio, C., Santillo, S., Cotugno, A. The photobiology of Hydra's periodic activity. Hydrobiologia. 530, 129-134 (2004).
  33. Chapman, J. A., et al. The dynamic genome of Hydra. Nature. 464 (7288), 592-596 (2010).
  34. Macias-Muñoz, A., Rangel Olguin, A. G., Briscoe, A. D. Evolution of phototransduction genes in Lepidoptera. Genome Biology and Evolution. 11 (8), 2107-2124 (2019).
  35. Macias-Munõz, A., Murad, R., Mortazavi, A. Molecular evolution and expression of opsin genes in Hydra vulgaris. BMC Genomics. 20 (1), (2019).
  36. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  37. Tavares, L., Alves, P. M., Ferreira, R. B., Santos, C. N. Comparison of different methods for DNA-free RNA isolation from SK-N-MC neuroblastoma. BMC research notes. 4, 3 (2011).
  38. Johnson, M. T. J., et al. Evaluating Methods for Isolating Total RNA and Predicting the Success of Sequencing Phylogenetically Diverse Plant Transcriptomes. PLoS ONE. 7 (11), (2012).
  39. Zhao, S., Zhang, Y., Gamini, R., Zhang, B., Von Schack, D. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: PolyA+ selection versus rRNA depletion. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  40. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16 (1), 1-14 (2015).
  41. Corley, S. M., MacKenzie, K. L., Beverdam, A., Roddam, L. F., Wilkins, M. R. Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols. BMC Genomics. 18 (1), 1-13 (2017).
  42. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8 (8), 1494-1512 (2013).
  43. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  44. Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification. Nature Biotechnology. 34 (5), 525-527 (2016).
  45. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  46. Araujo, F. A., Barh, D., Silva, A., Guimarães, L., Thiago, R. . OPEN GO FEAT a rapid web-based functional annotation tool for genomic and transcriptomic data. , 8-11 (2018).
  47. Huerta-Cepas, J., et al. Fast genome-wide functional annotation through orthology assignment by eggNOG-mapper. Molecular Biology and Evolution. 34 (8), 2115-2122 (2017).
  48. Huerta-Cepas, J., et al. EggNOG 5.0: A hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses. Nucleic Acids Research. 47, 309-314 (2019).
  49. Törönen, P., Medlar, A., Holm, L. PANNZER2: A rapid functional annotation web server. Nucleic Acids Research. 46, 84-88 (2018).
  50. Robinson, M., Mccarthy, D., Chen, Y., Smyth, G. K. . edgeR differential expression analysis of digital gene expression data User's Guide. , (2013).
  51. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
  52. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
  53. Letunic, I., Bork, P. Interactive tree of life (iTOL) v3: an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees. Nucleic acids research. 44, 242-245 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

171BLASTMEGA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены