Preparação de Conjugados de Proteínas Citotóxicas Específicas do Local via Química de Maleimida-tiol e Ligação Mediada por Sortase A

Resumo

Aqui, fornecemos protocolos detalhados para uma marcação específica do local de proteínas com drogas citotóxicas usando reação maleimida-tiol e ligação mediada por sortase A.

Resumo

O câncer é atualmente a segunda causa mais comum de morte em todo o mundo. A marca registrada das células cancerígenas é a presença de proteínas marcadoras específicas, como receptores de fator de crescimento, em sua superfície. Esse recurso permite o desenvolvimento de terapêuticas altamente seletivas, os bioconjugados proteicos, compostos por proteínas-alvo (anticorpos ou ligantes receptores) conectadas a drogas altamente citotóxicas por um ligante específico. Devido à alta afinidade e seletividade das proteínas-alvo, os bioconjugados reconhecem proteínas marcadoras na superfície das células cancerígenas e utilizam endocitose mediada por receptor para atingir o interior da célula. O sistema de transporte vesicular intracelular finalmente entrega os bioconjugados aos lisossomos, onde a proteólise separa os medicamentos citotóxicos livres do núcleo proteico dos bioconjugados, desencadeando a morte das células cancerígenas dependentes de medicamentos. Atualmente, existem vários bioconjugados proteicos aprovados para o tratamento do câncer e um grande número está em desenvolvimento ou ensaios clínicos.

Um dos principais desafios na geração dos bioconjugados é uma ligação específica do local do medicamento citotóxico à proteína alvo. Os últimos anos trouxeram um tremendo progresso no desenvolvimento de estratégias químicas e enzimáticas para modificação de proteínas com drogas citotóxicas. Aqui, apresentamos os protocolos detalhados para a incorporação específica do local de ogivas citotóxicas em proteínas-alvo usando um método químico que emprega química de maleimida-tiol e uma abordagem enzimática que depende da ligação mediada por sortase A. Usamos a variante projetada do fator de crescimento de fibroblastos 2 e a região cristalizável do fragmento da imunoglobulina G humana como uma proteína de direcionamento exemplar e a monometil auristatina E e o metotrexato como drogas citotóxicas modelo. Todas as estratégias descritas permitem a geração altamente eficiente de conjugados citotóxicos biologicamente ativos de arquitetura molecular definida com potencial para o tratamento seletivo de diversos tipos de câncer.

Introdução

Décadas de esforços científicos levaram a um enorme avanço em nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares que governam o desenvolvimento e a progressão do câncer. Ao mesmo tempo, as possibilidades terapêuticas ainda são amplamente limitadas devido aos efeitos adversos das drogas causados por sua falta de seletividade, pela grande variabilidade dos tumores e pela resistência aos medicamentos desenvolvida após o tratamento prolongado. Terapias anticancerígenas direcionadas têm ganhado atenção nos últimos anos como abordagens novas e altamente promissoras para o tratamento de diversos tumores. As terapias direcionadas dependem de sofisticados sistemas de entrega de medicamentos que entregam com precisão a carga citotóxica às células cancerígenas e poupam as saudáveis. Estes incluem principalmente diversas nanopartículas, lipossomas e transportadores de medicamentos à base de proteínas.

As células cancerígenas geralmente expõem níveis elevados de proteínas marcadoras específicas em sua superfície. Os conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) são novas terapias anticancerígenas à base de proteínas, que combinam em uma molécula extrema especificidade de anticorpos monoclonais e alta potência citotóxica de fármacos. Uma vez ligado à superfície da célula cancerígena, o ADC utiliza endocitose mediada por receptor para entrar na célula. Posteriormente, os ADCs são transportados através de compartimentos endossômicos para os lisossomos, onde as proteases degradam os ADCs e liberam drogas citotóxicas ativas. Atualmente, existem oito ADCs aprovados nos EUA para o tratamento de diversos tumores, incluindo câncer de mama triplo negativo, câncer de mama HER2 positivo, câncer urotelial, linfoma difuso de grandes células B, malignidade hematológica, linfoma de Hodgkin e leucemia mieloide aguda. Um grande número de ADCs também está em desenvolvimento ou aguarda aprovação¹. Digno de nota, as abordagens de engenharia de proteínas levaram ao desenvolvimento de diversas alternativas aos andaimes proteicos de anticorpos monoclonais e seus conjugados citotóxicos. Estes incluem diferentes fragmentos de anticorpos ^2,3, DARPins ^4,5, knottins ^6,7, centirinas⁸, affibodies ^9,10 ou ligantes de receptores modificados^11,12.

Existem vários requisitos críticos que devem ser atendidos por um conjugado citotóxico à base de proteína bem-sucedido, ou seja, a estabilidade do conjugado, especificidade extraordinária, alta afinidade do conjugado em relação ao marcador específico do câncer, rápida internalização do conjugado no interior da célula cancerígena, seu transporte eficiente para os lisossomos e liberação intracelular eficaz da carga ativa. Outra característica importante é a homogeneidade dos conjugados, que depende em grande parte da estratégia aplicada para a ligação da carga útil às proteínas-alvo. Existem vários métodos disponíveis para conjugação específica do local de proteínas com drogas citotóxicas, como modificação de resíduos de cisteína ou lisina de cadeia lateral de proteína, ligação da droga a aminoácidos não naturais incorporados às proteínas-alvo ou modificações enzimáticas das proteínas-alvo (por exemplo, com transglutaminase, glicosiltransferase, enzima geradora de formilglicina, sortase A). Na maioria dos casos, os métodos de conjugação específicos do local requerem modificações das moléculas alvo (por exemplo, via engenharia de cisteína ou introdução de tags de peptídeos curtos), mas, por sua vez, resultam em uma produção eficiente de conjugado homogêneo de interesse.

Aqui, fornecemos protocolos para conjugação específica do local altamente eficiente de proteínas-alvo com drogas citotóxicas. Como proteínas exemplares, usamos duas moléculas diferentes: o fragmento cristalizável (Fc) de IgG humano e uma variante projetada do fator de crescimento de fibroblastos humanos 2 (FGF2). O fragmento Fc constitui parte integrante dos ADCs típicos, mas também está presente em outros tipos de conjugados, como pepticorpos citotóxicos ou conjugados de fragmentos de anticorpos. O FGF2 é um ligante natural do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) que foi projetado com sucesso para produzir um conjugado citotóxico seletivo direcionado às células cancerígenas superprodutoras de FGFR.

Apresentamos duas estratégias distintas de conjugação que permitem a incorporação sítio-específica de drogas citotóxicas. Primeiro, é fornecido o protocolo de conjugação às cadeias laterais de cisteína do fragmento Fc via química maleimida-tiol com base no protocolo¹³ de Hermanson (Figura 1A, B). Neste protocolo, duas ligações dissulfeto são inicialmente reduzidas com tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) e os grupos tióis livres resultantes são submetidos à conjugação com monometil auristatina E (MMAE) via química maleimida-tiol ( Figura 1B ). Devido à interação entre os domínios de cadeia pesada constante 2 e 3 (CH2 e CH3), a estrutura dimérica do Fc ligado a drogas é preservada. Em segundo lugar, é apresentada a estratégia para a geração de conjugado FGF2 de ogiva dupla que combina engenharia de cisteína e ligação mediada por sortase A para incorporação de dois medicamentos distintos em FGF2 de maneira específica do local (Figura 1A, C). A variante livre de cisteína do FGF2 com KCKSGG N-terminal adicional com resíduo de cisteína exposto único e etiqueta de peptídeo curto LPETGG C-terminal é usada¹². A reação maleimida-tiol permite a conjugação de MMAE com cisteína dentro do ligante KCKSSG projetado por nosso grupo^14,15. Etapa dependente da Sortase A (com base em Chen et al.)¹⁶ medeia a ligação do peptídeo de tetraglicina ligado ao metotrexato (MTX) GGGG-MTX à sequência LPETGG C-terminal, produzindo dois tipos de conjugados de ogiva única (Figura 1C). A sortase A é uma cisteína protease que catalisa a reação de transpeptidação entre os motivos LPETGG e GGGG. A enzima se liga ao motivo LPETGG no terminal C da proteína, então a ligação amida entre a treonina e a glicina é hidrolisada para formar um complexo enzima-substrato. O próximo passo é a aminose da ligação tioésero-substrato enzimático, onde o doador de um grupo amino primário é o resíduo de glicina do motivo tetraglicina¹⁷. A combinação dessas duas abordagens gera conjugados de ogivas duplas FGF2 específicos do local (Figura 1C). Em princípio, os protocolos de conjugação fornecidos podem ser aplicados com sucesso a qualquer proteína direcionada projetada de interesse para gerar conjugados citotóxicos seletivos. Além disso, a versatilidade dessa abordagem a torna adequada para muitos outros fins de ligação proteína-proteína e proteína-peptídeo, bem como para a ligação de lipídios, polímeros, ácidos nucléicos e fluoróforos a proteínas com grupo sulfidrila disponível (ou gerado pela redução de ligações dissulfeto nativas) e/ou com pequena marca peptídica introduzida.

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Protocolo

1. Conjugação do domínio Fc com MMAE

NOTA: Antes das conjugações específicas do local, prepare os principais reagentes: proteína altamente pura de interesse (neste caso, o fragmento Fc e a variante FGF2 projetada, como ponto de partida 1-5 mg de proteína recombinante, preparada de acordo com Sokolowska-Wedzina¹⁸), álcool maleimidocaproil-Val-Cit-p-aminobenzílico (PABC)-monometil auristatina E (MMAE) (CUIDADO, agente altamente citotóxico, manusear com cuidado), Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e sortase A¹⁶. O metotrexato ligado ao peptídeo de tetraglicina (GGGG-MTX) (CUIDADO, MTX é um agente altamente citotóxico, manuseado com cuidado) pode ser sintetizado na fase de suporte sólido de acordo com o método de síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) na estratégia Fmoc¹⁹ ou obtido de fontes comerciais.

1. Para reduzir as ligações dissulfeto dentro do fragmento Fc (Figura 1), adicione um excesso molar dez vezes maior de TCEP sobre a proteína Fc (39 μM) em PBS (100 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7,4) e incube a 37 ° C por 1 h. A solução-mãe TCEP deve ter o pH ajustado com 0,1 M NaOH para 6,0, a fim de evitar a precipitação de proteínas devido a mudanças de pH.
2. Após a incubação, filtre a proteína reduzida usando um filtro de 0,2 μm para remover os precipitados de proteína.
3. Ao novo tubo de reação, adicione o primeiro excesso molar quádruplo de MMAE (dissolva o MMAE em N,N-dimetilacetamida (DMAc) para preparar a solução estoque de 40 mM) sobre grupos proteína-SH. Em seguida, adicione o dobro do volume de tampão PBS em relação ao volume da proteína Fc. Por fim, adicione o fragmento Fc reduzido da etapa 1.2.
   NOTA: Nesta etapa, a ordem de adição de reagentes é importante.
4. Efectuar a reacção de conjugação durante a noite a 15 °C com uma rotação suave. Essas condições leves impedem a desnaturação de proteínas.
5. Filtrar a solução com conjugado utilizando um filtro de 0,2 μm para remover os precipitados potenciais.
6. Realize o SDS-PAGE para analisar a eficiência da reação. Use gel de separação a 10%, marcador de proteína de 10 a 250 kDa e analise bandas entre 35 e 50 kDa (Figura 2).
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e a mistura de reação armazenada a 4 ° C para armazenamento de curto prazo ou a -80 ° C para armazenamento de longo prazo. No entanto, o congelamento e o descongelamento podem causar precipitação adicional e diminuir os rendimentos de purificação conjugados.
7. Carregue a mistura de reação em uma coluna com grânulos conjugados com proteína A e lave o excesso de MMAE com tampão de lavagem 1 contendo 300 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0,1% Tween 20, 2 mM EDTA pH 7,4. Em seguida, lave a coluna usando o tampão de lavagem 2 com 650 mM NaCl, 18 mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄, pH 7,4.
   NOTA: Através da interação seletiva da região Fc do conjugado com a proteína A nos grânulos, o conjugado é capturado na coluna, enquanto o MMAE não reagido é lavado. Esta etapa é necessária para obter um conjugado altamente puro.
8. Eluir o conjugado Fc-MMAE da coluna com tubos de citrato de sódio 0,1 M pH 3,5 a 1,5 mL contendo 1 M Tris pH 9,0 (1 mL de proteína a 200 μL de 1 M Tris pH 9,0).
9. Dessalinizar o Fc-MMAE para PBS pH 7,4 usando uma coluna com resina Sephadex G-25. Esta etapa evita a desnaturação do conjugado e permite que o conjugado seja usado em testes in vitro e in vivo.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
10. Realizar SDS-PAGE (10%) para analisar o conjugado final Fc-MMAE. Use gel de separação a 10%, marcador de proteína de 10 a 250 kDa e analise bandas entre 35 e 50 kDa (Figura 2).

2. Conjugação de FGF2 projetado

1. Conjugação de GGGG-MTX com a sequência LPETGG C-terminal de FGF2 projetado via ligação mediada por sortase A
   1. Transfira FGF2 projetado purificado contendo KCKSGG N-terminal e sequência LPETGG C-terminal (usado nesta etapa para conjugação) para o tampão de reação sortase A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) usando uma coluna com resina G-25. Ajuste a concentração de proteína para 1 μM com o tampão de reação sortase A.
   2. Adicionar o peptídeo GGGG-MTX dissolvido em DMAc, diretamente à solução proteica até uma concentração final de 100 μM.
   3. Adicionar a sortase A a uma concentração final de 0,1 μM e incubar durante 12 h a 15 °C com uma rotação suave. As concentrações de reagentes a utilizar nas etapas 2.1.1-2.1.3 são amplamente determinadas pelo rendimento do conjugado a atingir e pelas características bioquímicas da proteína alvo (eficácia da purificação da proteína, solubilidade e estabilidade). Para uma reação eficaz de sortase A, use um ponto de partida dez a cem vezes menor concentração de sortase A do que a proteína-alvo contendo LPETGG e concentração 100 vezes maior de GGGG-MTX do que a proteína marcada com LPETGG.
   4. Colocar a mistura de reacção numa coluna de Heparina Sepharose.
   5. Lave as moléculas que não reagiram com HEPES 25 mM pH 7,4.
   6. Eluir o produto da reação (FGF2. MTX) com HEPES 25 mM pH 7,4 com NaCl 2 M.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   7. Analise a eficiência da conjugação usando SDS-PAGE. Use gel de separação a 15%, marcador de proteína de 10 a 250 kDa e analise bandas entre 15 e 25 kDa (Figura 3).
2. Conjugação de MMAE com a sequência N-terminal KCKSGG de FGF2 projetado via reação maleimida-tiol
   1. Dessalinize a sequência de FGF2 projetada contendo KCKSGG N-terminal e LPETGG C-terminal para o tampão de reação (25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM metionina, 0,1 mM EDTA) usando uma coluna com resina Sephadex G-25. Ajuste a concentração de proteína para 25 μM com o tampão de reação.
   2. Dissolver o MMAE em DMAc para preparar a solução-mãe a 40 mM.
   3. Ao novo tubo de reação, adicione o primeiro excesso molar quádruplo de MMAE sobre os grupos proteína-SH. Em seguida, adicione o dobro do volume de tampão PBS em relação ao volume da proteína FGF2. Por fim, adicione a proteína FGF2.
      NOTA: Nesta etapa, a ordem de adição de reagentes é importante.
   4. Efectuar a reacção durante 1 h a 20 °C com uma rotação suave.
   5. Carregar a mistura de reacção numa coluna de carboximetil (CM)-sepharose e lavar o excesso do agente citotóxico não conjugado com HEPES 25 mM pH 7,4. Essas condições leves impedem a desnaturação de proteínas.
   6. Eluir o MMAE. FGF2 conjugado da coluna com HEPES 25 mM pH 7,4 com NaCl 0,5 M.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
   7. Analise a eficiência da conjugação usando SDS-PAGE. Use gel de separação a 15%, marcador de proteína de 10 a 250 kDa e analise bandas entre 15 e 25 kDa (Figura 3).
3. Preparação de conjugado de ogiva dupla de FGF2 enginnerado usando combinação de química maleimida-tiol e ligação mediada por sortase A
   NOTA: Para a geração de conjugados de ogivas duplas de FGF2 projetado, as etapas 2.1 e 2.2 são combinadas. Primeiro MMAE. O conjugado FGF2 é produzido via química maleimida-tiol (etapa 2.2) e usado para a ligação de GGGG-MTX com sortase A à etiqueta LPETGG terminal C de MMAE. FGF2 (etapa 2.1). Além disso, o procedimento reverso também é possível (primeiro conjugação mediada por sortase A, depois reação maleimida-tiol).
   1. Use as etapas 2.2.1-2.2.7 para a preparação do MMAE mono-substituído. Conjugado FGF2.
   2. Troque o tampão pelo tampão de reação sortase A (25 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 5 mM CaCl₂) usando uma coluna com resina Sephadex G-25.
   3. Continuar como descrito nos pontos 2.1.2-2.1.7.

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Resultados

Os protocolos apresentados descrevem duas estratégias distintas para a conjugação de diferentes drogas citotóxicas em proteínas de interesse. Além disso, é mostrada uma combinação de estratégias individuais que permite gerar conjugados citotóxicos de ogivas duplas de maneira específica do local.

Conforme mostrado nos géis SDS-PAGE na Figura 2 (pista 2 vs. 3), a reação maleimida-tiol permite atingir quase 100% de efi...

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Discussão

Devido ao alto interesse no desenho de terapêuticas seletivas contra diversos tipos de câncer, há uma necessidade urgente de estratégias que permitam a ligação específica do local de cargas distintas às proteínas-alvo. A modificação específica do local das proteínas de direcionamento é crítica, pois garante a homogeneidade dos conjugados bioativos desenvolvidos, um pré-requisito para a terapêutica moderna. Existem vários métodos, tanto químicos quanto enzimáticos, qu...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CM-Sepharose column	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	CCF100
Heparin Sepharose column	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE17-0407-01
HiTrap Desalting column	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe column	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monomethyl auristatin E (MMAE)	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-100374	Toxic
N,N-Dimethylacetamide (DMAc)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	185884
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	646547