Maleimide-thiol Chemistry 및 Sortase A-Mediated Ligation을 통한 부위 특이적 세포독성 단백질 접합체 준비

요약

여기에서는 maleimide-thiol 반응 및 sortase A 매개 ligation을 사용하여 세포독성 약물로 단백질의 부위 특이적 라벨링을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

암은 현재 전 세계적으로 두 번째로 흔한 사망 원인입니다. 암세포의 특징은 성장 인자 수용체(growth factor receptor)와 같은 특정 마커 단백질(specific marker protein)이 표면에 존재한다는 것입니다. 이 기능을 통해 특정 링커에 의해 고농도 세포독성 약물에 연결된 표적 단백질(항체 또는 수용체 리간드)로 구성된 단백질 바이오콘주게이트인 매우 선택적인 치료제의 개발을 가능하게 합니다. 표적 단백질의 매우 높은 친화력과 선택성으로 인해 bioconjugates는 암세포 표면의 marker 단백질을 인식하고 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 활용하여 세포 내부에 도달합니다. 세포 내 소포 수송 시스템은 궁극적으로 바이오접합체를 리소좀으로 전달하며, 여기서 단백질 분해는 바이오접합체의 단백질 코어에서 유리 세포독성 약물을 분리하여 약물 의존성 암세포 사멸을 유발합니다. 현재 암 치료용으로 승인된 여러 단백질 생체접합체가 있으며 그 중 다수가 개발 중이거나 임상 시험 중입니다.

생체접합체 생성의 주요 과제 중 하나는 세포독성 약물이 표적 단백질에 부위 특이적으로 부착되는 것입니다. 최근 몇 년 동안 세포독성 약물을 이용한 단백질 변형을 위한 화학적 및 효소적 전략 개발이 크게 진전을 이루었습니다. 여기에서는 말레이미드-티올 화학을 사용하는 화학적 방법과 sortase A-매개 접합에 의존하는 효소적 접근법을 사용하여 세포독성 탄두를 표적 단백질에 부위 특이적으로 통합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 섬유아세포 성장 인자 2의 공학적 변이체와 인간 면역글로불린 G의 결정화 가능한 부위를 예시적인 표적 단백질로 사용하며, 모노메틸 오리스타틴 E 및 메토트렉세이트를 세포독성 약물 모델로 사용합니다. 설명된 모든 전략은 다양한 암의 선택적 치료 가능성이 있는 정의된 분자 구조의 생물학적으로 활성화된 세포독성 접합체의 매우 효율적인 생성을 가능하게 합니다.

서문

수십 년에 걸친 과학적 노력은 암 발병과 진행을 관장하는 분자 메커니즘에 대한 지식의 엄청난 발전으로 이어졌습니다. 동시에 약물의 선택성 부족으로 인한 약물의 부작용, 종양의 큰 변동성 및 장기간의 치료 후 발생하는 약물 내성으로 인해 치료 가능성은 여전히 크게 제한되어 있습니다. 표적 항암 요법은 최근 몇 년 동안 다양한 종양 치료를 위한 새롭고 매우 유망한 접근 방식으로 주목받고 있습니다. 표적 치료제는 세포독성 페이로드를 암세포에 정확하게 전달하고 건강한 세포를 살리는 정교한 약물 전달 시스템에 의존합니다. 여기에는 주로 다양한 나노 입자, 리포좀 및 단백질 기반 약물 전달체가 포함됩니다.

암세포는 종종 표면에 높은 수준의 특정 마커 단백질을 노출시킵니다. 항체 약물 접합체(ADC)는 새로운 단백질 기반 항암 치료제로, 단일 클론 항체의 극도의 특이성과 약물의 높은 세포 독성 효능을 하나의 분자에 결합합니다. 일단 암 세포 표면에 결합되면, ADC는 수용체 매개 세포내이입(receptor-mediated endocytosis)을 이용하여 세포로 들어갑니다. 그 후, ADC는 엔도솜 구획을 통해 리소좀으로 운반되며, 여기서 프로테아제는 ADC를 분해하고 활성 세포독성 약물을 방출합니다. 현재 미국에는 삼중 음성 유방암, HER2 양성 유방암, 요로상피암, 미만성 거대 B세포 림프종, 혈액 악성 종양, 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병 등 다양한 종양의 치료를 위해 승인된 8개의 ADC가 있습니다. 또한 많은 수의 ADC가 개발 중이거나 승인을 기다리고 있습니다¹. 주목할 만한 점은 단백질 공학 접근 방식을 통해 단클론 항체 단백질 스캐폴드 및 세포 독성 접합체에 대한 다양한 대안을 개발할 수 있었다는 것입니다. 여기에는 다양한 항체 단편 ^2,3, DARPins ^4,5, knottins ^6,7, centyrins⁸, affibody ^9,10 또는 엔지니어링된 수용체 리간드^11,12가 포함됩니다.

성공적인 단백질 기반 세포독성 접합체를 위해서는 접합체 안정성, 탁월한 특이성, 암 특이적 마커에 대한 접합체의 높은 친화력, 암세포 내부로의 접합체의 빠른 내재화, 리소좀으로의 효율적인 수송 및 활성 페이로드의 효과적인 세포 내 방출 등 몇 가지 중요한 요구 사항이 충족되어야 합니다. 또 다른 중요한 특징은 접합체 균질성(conjugates homogeneity)이며, 이는 표적 단백질에 페이로드를 부착하기 위해 적용된 전략에 크게 의존합니다. 단백질 측쇄 시스테인 또는 라이신 잔기의 변형, 표적 단백질에 통합된 비천연 아미노산에 약물의 부착 또는 표적 단백질의 효소 변형(예: 트랜스글루타미나제, 글리코실전이효소, 포르밀글리신 생성 효소, 분류효소 A)과 같이 세포독성 약물과 단백질의 부위 특이적 접합에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다. 대부분의 경우 부위 특이적 접합 방법은 표적 분자의 수정(예: 시스테인 엔지니어링 또는 짧은 펩타이드 태그의 도입을 통해)을 필요로 하지만, 그 결과 관심 있는 균질한 접합체를 효율적으로 생산할 수 있습니다.

여기에서는 세포독성 약물을 가진 표적 단백질의 매우 효율적인 부위 특이적 접합을 위한 프로토콜을 제공합니다. 모범적인 단백질로 우리는 두 가지 다른 분자, 즉 인간 IgG의 결정화(Fc) 단편과 인간 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)의 공학적 변형체를 사용했습니다. Fc 단편은 일반적인 ADC의 필수적인 부분을 구성하지만 세포 독성 펩티바디 또는 항체 단편의 접합체와 같은 다른 유형의 접합체에도 존재합니다. FGF2는 FGFR을 과도하게 생산하는 암세포를 표적으로 하는 선택적 세포독성 접합체를 생성하도록 성공적으로 설계된 천연 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 리간드입니다.

우리는 세포독성 약물의 부위 특이적 통합을 허용하는 두 가지 뚜렷한 접합 전략을 제시합니다. 먼저, Hermanson의 프로토콜¹³을 기반으로 말레이미드-티올 화학을 통해 Fc 단편의 시스테인 곁사슬에 접합하기 위한 프로토콜이 제공됩니다(그림 1A,B). 이 프로토콜에서는 초기에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 두 개의 이황화 결합이 감소하고, 그 결과로 생성된 유리 티올기는 말레이미드-티올 화학을 통해 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)와 접합됩니다(그림 1B). 일정한 중쇄 영역 2와 3(CH2 및 CH3) 사이의 상호 작용으로 인해 약물 결합 Fc의 이합체 구조가 보존됩니다. 둘째, 시스테인 엔지니어링과 소르타제 A 매개 결찰을 결합하여 두 가지 별개의 약물을 부위 특이적 방식으로 FGF2에 통합한 이중 탄두 FGF2 접합체 생성 전략을 제시합니다(그림 1A,C). 단일 노출된 시스테인 잔류물이 있는 추가 N-말단 KCKSGG와 C-말단 LPETGG 쇼트 펩타이드 태그가 있는 FGF2의 시스테인이 없는 변형체가 사용됩니다¹². 말레이미드-티올 반응은 우리 그룹^14,15에 의해 설계된 KCKSSG 링커 내에서 MMAE와 시스테인의 접합을 가능하게 합니다. Sortase A-dependent step (Chen et al. 기준)^{도 16}은 메토트렉세이트(MTX)와 연결된 테트라글리신 펩타이드 GGGG-MTX의 접합을 C-말단 LPETGG 서열에 매개하여 두 가지 유형의 단일 탄두 접합체를 생성합니다(그림 1C). Sortase A는 LPETGG와 GGGG 모티프 사이의 트랜스펩티드 반응을 촉매하는 시스테인 프로테아제입니다. 효소는 단백질의 C-말단에서 LPETGG 모티프에 결합한 다음 트레오닌과 글리신 사이의 아미드 결합이 가수분해되어 효소-기질 복합체를 형성합니다. 다음 단계는 티오에스테르 효소-기질 결합의 아미노분해이며, 여기서 1차 아미노기의 공여체는 테트라글리신 모티프¹⁷의 글리신 잔기입니다. 이 두 가지 접근 방식을 결합하면 현장 특이적 FGF2 이중 탄두 접합체가 생성됩니다(그림 1C). 원칙적으로, 제공된 접합 프로토콜은 선택적 세포독성 접합체를 생성하기 위해 엔지니어링된 모든 표적 단백질에 성공적으로 적용될 수 있습니다. 또한, 이 접근법의 다양성은 다른 많은 단백질-단백질 및 단백질-펩타이드 결찰 목적뿐만 아니라 사용 가능한 sulfhydryl 기(또는 천연 이황화 결합의 감소에 의해 생성됨) 및/또는 도입된 작은 펩타이드 태그가 있는 단백질에 지질, 폴리머, 핵산 및 형광단을 부착하는 데 적합합니다.

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프로토콜

1. Fc-domain과 MMAE의 활용

참고: 부위 특이적 접합에 앞서 주요 시약을 준비하십시오: 고순도 관심 단백질(이 경우 Fc 단편 및 엔지니어링된 FGF2 변이체, 시작점으로 1-5mg의 재조합 단백질, Sokolowska-Wedzina¹⁸에 따라 준비됨), 말레미도카프로일-발-시트-p-아미노벤질 알코올(PABC)-모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)(주의, 고농도 세포독성제, 주의해서 취급), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 및 소르타제 A¹⁶. 테트라글리신 펩타이드(GGGG-MTX)와 연결된 메토트렉세이트(MTX는 세포독성이 높은 물질이므로 주의해서 취급해야 함)는 Fmoc 전략¹⁹ 의 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법에 따라 고체지지상에서 합성하거나 상용 소스에서 얻을 수 있습니다.

1. Fc 단편(그림 1) 내의 이황화 결합을 줄이려면 PBS(100mM NaCl, 18mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄ pH 7.4)의 Fc 단백질(39μM)에 걸쳐 TCEP의 10배 몰 초과량을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. TCEP 원액은 pH를 0.1M NaOH에서 6.0으로 조정해야 합니다. pH 변화로 인한 단백질 침전을 방지하기 위해.
2. 배양 후 0.2μm 필터를 사용하여 환원된 단백질을 여과하여 단백질 침전물을 제거합니다.
3. 새 반응 튜브에 단백질 -SH 그룹에 MMAE( N,N-디메틸아세트아미드(DMAc)에 MMAE를 용해하여 40mM 스톡 용액을 준비)의 첫 번째 4배 몰 초과를 추가합니다. 그런 다음 Fc 단백질의 부피와 관련하여 PBS 완충액의 두 배를 추가합니다. 마지막으로 1.2단계에서 감소된 Fc 단편을 추가합니다.
   참고: 이 단계에서는 시약 첨가 순서가 중요합니다.
4. 15°C에서 하룻밤 동안 완만한 회전으로 접합 반응을 수행합니다. 이러한 경미한 조건은 단백질 변성을 방지합니다.
5. 0.2μm 필터를 사용하여 접합체로 용액을 필터링하여 잠재적인 침전물을 제거합니다.
6. SDS-PAGE를 수행하여 반응의 효율성을 분석합니다. 10% 분리 겔, 10 – 250 kDa 단백질 마커를 사용하고 35 - 50 kDa 사이의 대역을 분석합니다(그림 2).
   참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 반응 혼합물은 단기 보관의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -80°C에 보관합니다. 그러나 동결 및 해동은 추가 침전을 유발하고 접합체 정제 수율을 감소시킬 수 있습니다.
7. 반응 혼합물을 단백질 A-접합 비드가 있는 컬럼에 로드하고 300mM NaCl, 18mM NaH₂PO₄, 33 mM, Na₂HPO₄, 0.1% Tween 20, 2 mM EDTA pH 7.4를 포함하는 세척 버퍼 1로 초과량의 MMAE를 씻어냅니다. 그런 다음 650mM NaCl, 18mM NaH₂PO₄, 33 mM Na₂HPO₄, pH 7.4의 세척 버퍼 2를 사용하여 컬럼을 세척합니다.
   참고: 비드의 단백질 A와 접합체의 Fc 영역의 선택적 상호 작용을 통해 접합체는 컬럼에 포획되고 미반응 MMAE는 세척됩니다. 이 단계는 고순도 켤레를 얻는 데 필요합니다.
8. 1M Tris pH 9.0(단백질 1mL에서 1M Tris pH 9.0의 200μL까지)을 포함하는 0.1M sodium citrate pH 3.5 - 1.5mL 튜브로 컬럼에서 Fc-MMAE 접합체를 용리합니다.
9. Sephadex G-25 수지가 있는 컬럼을 사용하여 Fc-MMAE를 PBS pH 7.4로 탈염합니다. 이 단계는 conjugate의 변성을 방지하고 conjugate를 in vitro 및 in vivo 테스트에서 사용할 수 있도록 합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
10. SDS-PAGE(10%)를 수행하여 최종 Fc-MMAE 접합체를 분석합니다. 10% 분리 겔, 10 – 250 kDa 단백질 마커를 사용하고 35 - 50 kDa 사이의 대역을 분석합니다(그림 2).

2. 엔지니어링된 FGF2의 활용

1. sortase A-매개 결찰을 통해 GGGG-MTX를 엔지니어링된 FGF2의 C-말단 LPETGG 서열에 접합
   1. G-25 수지가 있는 컬럼을 사용하여 N-말단 KCKSGG 및 C-말단 LPETGG 서열(이 단계에서 접합에 사용됨)을 포함하는 정제된 엔지니어링 FGF2를 sortase A 반응 완충액(25mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 10mM(NH₄)₂SO₄, 5mM CaCl₂)으로 전달합니다. sortase A Reaction Buffer를 사용하여 단백질 농도를 1 μM로 조정합니다.
   2. DMAc에 용해된 GGGG-MTX 펩타이드를 단백질 용액에 직접 첨가하여 최종 농도가 100μM가 되도록 합니다.
   3. sortase A를 최종 농도 0.1μM에 추가하고 완만한 회전으로 15°C에서 12시간 동안 배양합니다. 단계 2.1.1-2.1.3에서 사용할 시약의 농도는 주로 달성하고자 하는 접합체의 수율과 표적 단백질의 생화학적 특성(단백질 정제 효과, 용해성 및 안정성)에 의해 결정됩니다. 효과적인 sortase A 반응을 위해 LPETGG 함유 표적 단백질보다 10배에서 100배 낮은 농도의 sortase A 농도와 LPETGG 태그 단백질보다 100배 더 높은 농도의 GGGG-MTX 농도를 시작점으로 사용하십시오.
   4. 반응 혼합물을 Heparin Sepharose 컬럼에 로드합니다.
   5. 25mM HEPES pH 7.4로 미반응 분자를 씻어냅니다.
   6. 반응 생성물을 용리(FGF2. MTX) 25mM HEPES pH 7.4와 2M NaCl.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   7. SDS-PAGE를 사용하여 활용의 효율성을 분석합니다. 15% 분리 겔, 10 – 250kDa 단백질 마커를 사용하고 15 – 25kDa 사이의 대역을 분석합니다(그림 3).
2. 말레이미드-티올 반응을 통해 엔지니어링된 FGF2의 N-말단 KCKSGG 서열에 MMAE의 접합
   1. Sephadex G-25 수지가 있는 컬럼을 사용하여 반응 완충액(25mM HEPES pH 7.0, 10mM(NH₄)₂SO₄, 10mM 메티오닌, 0.1mM EDTA)에 N 말단 KCKSGG 및 C 말단 LPETGG 서열을 포함하는 FGF2를 탈염했습니다. 반응 버퍼를 사용하여 단백질 농도를 25μM로 조정합니다.
   2. MMAE를 DMAc에 용해시켜 40mM 원액을 준비합니다.
   3. 새로운 반응 튜브에 단백질 -SH 그룹에 비해 MMAE의 첫 번째 4배 몰 초과량을 추가합니다. 그런 다음 FGF2 단백질의 부피와 관련하여 PBS 완충액의 두 배를 추가합니다. 마지막으로 FGF2 단백질을 추가합니다.
      참고: 이 단계에서는 시약 추가 순서가 중요합니다.
   4. 20°C에서 1시간 동안 부드럽게 회전하면서 반응을 수행합니다.
   5. Carboxymethyl (CM)-Sepharose 컬럼에 반응 혼합물을 로드하고 25mM HEPES pH 7.4로 잉여량의 비접합 세포독성제를 씻어냅니다. 이러한 경미한 조건은 단백질 변성을 방지합니다.
   6. MMAE를 용출합니다. 25mM HEPES pH 7.4와 0.5M NaCl의 컬럼에서 FGF2 접합체.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
   7. SDS-PAGE를 사용하여 활용의 효율성을 분석합니다. 15% 분리 겔, 10 – 250kDa 단백질 마커를 사용하고 15 – 25kDa 사이의 대역을 분석합니다(그림 3).
3. 말레이미드-티올 화학과 소타제 A-매개 결찰의 조합을 사용한 enginnered FGF2의 이중 탄두 접합체 제조
   참고: 엔지니어링된 FGF2의 이중 탄두 접합체 생성을 위해 2.1단계와 2.2단계가 결합됩니다. 첫 번째 MMAE. FGF2 접합체는 maleimide-thiol chemistry(단계 2.2)를 통해 생성되며 sortase A가 있는 GGGG-MTX를 MMAE의 C 말단 LPETGG 태그에 부착하는 데 사용됩니다. FGF2 (단계 2.1). 또한 역절차도 가능합니다(첫 번째 sortase A-mediated conjugation, 그 다음 maleimide-thiol 반응).
   1. 2.2.1-2.2.7 단계를 사용하여 모노 치환 MMAE를 준비합니다. FGF2 켤레.
   2. Sephadex G-25 수지가 있는 컬럼을 사용하여 버퍼를 sortase A 반응 버퍼(25mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 10mM(NH₄)₂SO₄, 5mM CaCl₂)로 교환합니다.
   3. 2.1.2-2.1.7에 설명된 대로 계속합니다.

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결과

제시된 프로토콜은 서로 다른 세포독성 약물을 관심 단백질로 접합하기 위한 두 가지 별개의 전략을 설명합니다. 또한, 부위 특이적 방식으로 이중 탄두 세포독성 접합체를 생성할 수 있는 개별 전략의 조합이 표시됩니다.

그림 2(2열 대 3)의 SDS-PAGE 겔에서 볼 수 있듯이 말레이미드-티올 반응은 Fc 단편에 대한 MMAE 접합에 대해 거?...

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토론

다양한 암 유형에 대한 선택적 치료제 설계에 대한 관심이 높기 때문에 표적 단백질에 고유한 화물을 부위 특이적으로 부착할 수 있는 전략이 시급히 필요합니다. 표적 단백질의 부위 특이적 변형은 현대 치료제의 전제 조건인 개발된 생체 활성 접합체의 균질성을 보장하기 때문에 매우 중요합니다. 화학적 및 효소적 방법 모두 여러 가지 방법이 있어 선택한 단백질에 화...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CM-Sepharose column	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	CCF100
Heparin Sepharose column	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE17-0407-01
HiTrap Desalting column	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe column	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monomethyl auristatin E (MMAE)	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-100374	Toxic
N,N-Dimethylacetamide (DMAc)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	185884
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	646547