JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы приводим подробные протоколы сайт-специфичного мечения белков цитотоксическими препаратами с использованием малеимидом-тиоловой реакции и сортазного А-опосредованного лигирования.

Аннотация

В настоящее время рак является второй по распространенности причиной смерти во всем мире. Отличительной чертой раковых клеток является наличие на их поверхности специфических маркерных белков, таких как рецепторы фактора роста. Эта особенность позволяет разрабатывать высокоселективные терапевтические средства, белковые биоконъюгаты, состоящие из целевых белков (антител или рецепторных лигандов), соединенных с высокоцитотоксическими препаратами специфическим линкером. Благодаря очень высокому сродству и селективности белков-мишеней, биоконъюгаты распознают маркерные белки на поверхности раковых клеток и используют рецептор-опосредованный эндоцитоз для достижения внутренней части клетки. Внутриклеточная везикулярная транспортная система в конечном итоге доставляет биоконъюгаты к лизосомам, где протеолиз отделяет свободные цитотоксические препараты от белкового ядра биоконъюгатов, вызывая лекарственно-зависимую гибель раковых клеток. В настоящее время существует несколько белковых биоконъюгатов, одобренных для лечения рака, и большое количество из них находится в стадии разработки или клинических испытаний.

Одной из основных проблем при создании биоконъюгатов является сайт-специфическое присоединение цитотоксического препарата к белку-мишени. В последние годы был достигнут огромный прогресс в разработке химических и ферментативных стратегий модификации белка цитотоксическими препаратами. Здесь мы представляем подробные протоколы site-specific включения цитотоксических боеголовок в белки-мишени с использованием химического метода с использованием химии малеимида-тиола и ферментативного подхода, основанного на опосредованном сортазой А-опосредованном лигировании. В качестве примера белков-мишеней мы используем сконструированный вариант фактора роста фибробластов 2 и фрагментируемую кристаллизуемую область иммуноглобулина человека G и монометилауристатин Е и метотрексат. Все описанные стратегии позволяют с высокой эффективностью получать биологически активные цитотоксические конъюгаты определенной молекулярной архитектуры с потенциалом для селективного лечения различных видов рака.

Введение

Десятилетия научных усилий привели к огромному прогрессу в наших знаниях о молекулярных механизмах, управляющих развитием и прогрессированием рака. В то же время терапевтические возможности все еще в значительной степени ограничены из-за побочных эффектов препаратов, вызванных их недостаточной селективностью, большой вариабельностью опухолей и лекарственной устойчивостью, развивающейся после длительного лечения. Таргетная противораковая терапия в последние годы привлекает внимание как новые и весьма перспективные подходы к лечению различных опухолей. Таргетная терапия основана на сложных системах доставки лекарств, которые точно доставляют цитотоксическую полезную нагрузку к раковым клеткам и щадят здоровые. К ним относятся в основном различные наночастицы, липосомы и белковые носители лекарств.

Раковые клетки часто подвергают воздействию повышенного уровня специфических маркерных белков на своей поверхности. Конъюгаты лекарственных препаратов на основе антител (ADC) являются новыми противораковыми препаратами на основе белков, которые сочетают в одной молекуле чрезвычайную специфичность моноклональных антител и высокую цитотоксическую активность лекарственных средств. После связывания с поверхностью раковой клетки, ADC использует рецептор-опосредованный эндоцитоз для проникновения в клетку. Впоследствии АЦП транспортируются через эндосомальные компартменты в лизосомы, где протеазы разрушают АЦП и высвобождают активные цитотоксические препараты. В настоящее время в США одобрено восемь ADC для лечения различных опухолей, включая тройной негативный рак молочной железы, HER2-положительный рак молочной железы, уротелиальный рак, диффузную В-крупноклеточную лимфому, гематологическое злокачественное новообразование, лимфому Ходжкина и острый миелоидный лейкоз. Большое количество АЦП также либо находятся в стадии разработки, либо ожидают утверждения1. Следует отметить, что подходы к белковой инженерии привели к разработке разнообразной альтернативы моноклональным антителам белковых скаффолдов и их цитотоксических конъюгатов. К ним относятся различные фрагменты антител 2,3, DARPins 4,5, кноттины 6,7, центирины8, аффибоды 9,10 или модифицированные рецепторные лиганды11,12.

Существует несколько критических требований, которые должны быть удовлетворены успешным цитотоксическим конъюгатом на основе белка, а именно: стабильность конъюгата, чрезвычайная специфичность, высокая аффинность конъюгата к маркеру, специфичному для рака, быстрая интернализация конъюгата внутрь раковой клетки, его эффективный транспорт к лизосомам и эффективное внутриклеточное высвобождение активной полезной нагрузки. Еще одной важной особенностью является гомогенность конъюгатов, которая во многом зависит от применяемой стратегии прикрепления полезной нагрузки к белкам-мишеням. Существует несколько доступных методов сайт-специфической конъюгации белков с цитотоксическими препаратами, таких как модификация цистеина или остатков лизина боковой цепи белка, присоединение препарата к неестественным аминокислотам, включенным в белки-мишени, или ферментативные модификации белков-мишеней (например, с помощью трансглутаминазы, гликозилтрансферазы, фермента, генерирующего формилглин, сортазы А). В большинстве случаев сайт-специфичные методы конъюгации требуют модификации молекул-мишеней (например, с помощью цистеиновой инженерии или введения коротких пептидных меток), но, в свою очередь, приводят к эффективному получению гомогенного конъюгата, представляющего интерес.

Здесь мы предоставляем протоколы для высокоэффективной сайт-специфической конъюгации белков-мишеней с цитотоксическими препаратами. В качестве образцовых белков мы использовали две разные молекулы: кристаллизуемый фрагмент (Fc) человеческого IgG и модифицированный вариант фактора роста фибробластов человека 2 (FGF2). Fc-фрагмент является неотъемлемой частью типичных АЦП, но он также присутствует в других типах конъюгатов, таких как цитотоксические пептитела или конъюгаты фрагментов антител. FGF2 является природным лигандом рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), который был успешно сконструирован для получения селективного цитотоксического конъюгата, нацеленного на раковые клетки, чрезмерно продуцирующие FGFR.

Мы представляем две различные стратегии конъюгации, позволяющие сайт-специфичное включение цитотоксических препаратов. Во-первых, представлен протокол конъюгации с цистеиновыми боковыми цепями Fc-фрагмента с помощью химии малеимида-тиола, основанный на протоколе Хермансона13 (рис. 1A, B). В этом протоколе две дисульфидные связи первоначально восстанавливаются трис(2-карбоксиэтил)фосфином (TCEP), и полученные свободные тиоловые группы подвергаются конъюгации с монометилауристатином Е (MMAE) через химию малеимида-тиола (рис. 1B). Благодаря взаимодействию между постоянными доменами тяжелой цепи 2 и 3 (CH2 и CH3) димерная структура сцепленного с лекарством Fc сохраняется. Во-вторых, представлена стратегия создания конъюгата FGF2 с двойной боеголовкой, которая сочетает в себе цистеиновую инженерию и опосредованное А-опосредованное лигирование сортазы А для включения двух различных препаратов в FGF2 сайт-специфичным образом (рис. 1A, C). Используется безцистеиновый вариант FGF2, несущий дополнительный N-концевой KCKSGG с одиночным открытым остатком цистеина и С-концевой LPETGG короткой пептидной меткой12. Реакция малеимида-тиола позволяет конъюгировать MMAE с цистеином в линкере KCKSSG, разработанном нашей группой 14,15. Сортаза А-зависимый шаг (на основе Chen et al.)16 опосредует лигирование связанного с метотрексатом (MTX) пептида тетраглицина GGGG-MTX в С-концевую последовательность LPETGG, образуя два типа конъюгатов с одной боеголовкой (рисунок 1C). Сортаза А представляет собой цистеиновую протеазу, которая катализирует реакцию транспептидации между мотивами LPETGG и GGGG. Фермент связывается с мотивом LPETGG на С-конце белка, затем амидная связь между треонином и глицином гидролизуется с образованием комплекса фермент-субстрат. Следующим этапом является аминолиз тиоэфирной фермент-субстратной связи, где донором первичной аминогруппы является глициновый остаток мотива тетраглицина17. Комбинация этих двух подходов позволяет создавать специфичные для сайта сопряжения двойной боеголовки FGF2 (рисунок 1C). В принципе, предоставленные протоколы конъюгации могут быть успешно применены к любому сконструированному белку-мишени, представляющему интерес, для получения селективных цитотоксических конъюгатов. Кроме того, универсальность этого подхода делает его пригодным для многих других целей белок-белкового и белково-пептидного лигирования, а также для присоединения липидов, полимеров, нуклеиновых кислот и флуорофоров к белкам с доступной сульфгидрильной группой (или полученными путем восстановления нативных дисульфидных связей) и/или с введенной малой пептидной меткой.

протокол

1. Конъюгация Fc-домена с MMAE

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сайт-специфичными конъюгациями подготовьте ключевые реагенты: высокочистый белок, представляющий интерес (в данном случае фрагмент Fc и сконструированный вариант FGF2, в качестве отправной точки 1-5 мг рекомбинантного белка, приготовленный в соответствии с Соколовской-Вединой18), малеимидокапроил-Val-Cit-p-аминобензиловый спирт (PABC)-монометилауристатин E (MMAE) (ОСТОРОЖНО, высокоцитотоксический агент, обращайтесь осторожно), трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) и сортаза A16. Метотрексат, связанный с пептидом тетраглицина (GGGG-MTX) (ОСТОРОЖНО, МТХ является высокоцитотоксическим агентом, обращайтесь с ним осторожно) может быть либо синтезирован на твердой несущей фазе в соответствии с методом синтеза твердофазного пептида (SPPS) в стратегии Fmoc19, либо получен из коммерческих источников.

  1. Чтобы уменьшить дисульфидные связи внутри Fc-фрагмента (рис. 1), добавьте десятикратный молярный избыток TCEP над белком Fc (39 мкМ) в PBS (100 мМ NaCl, 18 мМ2PO4, 33 мМ Na2HPO4 pH 7,4) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч. Исходный раствор TCEP должен иметь рН, отрегулированный с 0,1 М NaOH до 6,0, для того, чтобы предотвратить выпадение белка в осадок из-за изменения pH.
  2. После инкубации отфильтруйте восстановленный белок с помощью фильтра 0,2 мкм для удаления белковых осадков.
  3. В новую реакционную пробирку добавить сначала четырехкратный молярный избыток MMAE (растворить MMAE в N,N-диметилацетамиде (DMAc) для получения 40 мМ стокового раствора) над белковыми -SH группами. Затем добавьте двойной объем буфера PBS по отношению к объему белка Fc. Наконец, добавьте уменьшенный фрагмент Fc из шага 1.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важен порядок добавления реагентов.
  4. Проведите реакцию конъюгации в течение ночи при температуре 15 °C с осторожным вращением. Эти мягкие условия препятствуют денатурации белка.
  5. Отфильтруйте раствор с помощью конъюгата с помощью фильтра 0,2 мкм для удаления потенциальных осадков.
  6. Проведите SDS-PAGE для анализа эффективности реакции. Используйте 10% разделительный гель, белковый маркер с концентрацией 10–250 кДа и проанализируйте полосы от 35 до 50 кДа (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, а реакционную смесь хранить либо при температуре 4 °C для кратковременного хранения, либо при -80 °C для длительного хранения. Однако замораживание и оттаивание могут привести к выпадению дополнительных осадков и снижению производительности сопряженной очистки.
  7. Загрузите реакционную смесь на колонку с белком А-конъюгированными шариками и смойте избыток MMAE промывочным буфером 1, содержащим 300 мМ NaCl, 18 мМ2PO4, 33 мМ, Na2HPO4, 0,1% Tween 20, 2 мМ EDTA pH 7,4. Затем промойте колонку с помощью промывочного буфера 2 с 650 мМ NaCl, 18 мМ2PO4, 33 мМ Na2HPO4, pH 7,4.
    Примечание: Благодаря избирательному взаимодействию Fc-области конъюгата с белком А на бусинах, конъюгат захватывается на колонке, в то время как непрореагировавший MMAE вымывается. Этот шаг необходим для получения высокочистого конъюгата.
  8. Выведите конъюгат Fc-MMAE из колонки с 0,1 М цитратом натрия pH 3,5 до 1,5 мл в пробирках, содержащих 1 M Tris pH 9,0 (от 1 мл белка до 200 мкл 1 M Tris pH 9,0).
  9. Обессоливание Fc-MMAE до PBS pH 7,4 с помощью колонки со смолой Sephadex G-25. Этот этап предотвращает денатурацию конъюгата и позволяет использовать конъюгат в тестах in vitro и in vivo.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
  10. Проведите SDS-PAGE (10%) для анализа конечного конъюгата Fc-MMAE. Используйте 10% разделительный гель, белковый маркер с концентрацией 10–250 кДа и проанализируйте полосы от 35 до 50 кДа (Рисунок 2).

2. Сопряжение сконструированного FGF2

  1. Конъюгация GGGG-MTX с С-концевой последовательностью LPETGG сконструированного FGF2 путем сортазного А-опосредованного лигирования
    1. Перенесите очищенный сконструированный FGF2, содержащий N-концевой KCKSGG и С-концевую последовательность LPETGG (используемую на данном этапе для конъюгации), в реакционный буфер сортазы А (25 мМ HEPES pH 7,4, 150 мМ NaCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ CaCl2) с использованием колонки со смолой G-25. Отрегулируйте концентрацию белка до 1 мкМ с помощью реакционного буфера сортазы А.
    2. Добавьте растворенный в DMAc пептид GGGG-MTX, непосредственно в раствор белка до конечной концентрации 100 мкМ.
    3. Добавьте сортазу А до конечной концентрации 0,1 мкМ и инкубируйте в течение 12 ч при 15 °C при осторожном вращении. Концентрации реагентов, которые должны быть использованы на этапах 2.1.1-2.1.3, в значительной степени определяются выходом конъюгата, который должен быть достигнут, и биохимическими характеристиками белка-мишени (эффективностью очистки белка, его растворимостью и стабильностью). Для эффективной реакции сортазы А используйте исходную концентрацию сортазы А в десять-сто раз ниже, чем целевой белок, содержащий LPETGG, и в 100 раз более высокую концентрацию GGGG-MTX, чем белок, меченный LPETGG.
    4. Загрузите реакционную смесь в колонку с гепарином сефарозой.
    5. Смойте непрореагировавшие молекулы с помощью 25 мМ HEPES pH 7,4.
    6. Выведите продукт реакции (FGF2. MTX) с 25 мМ HEPES pH 7,4 с 2 М NaCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
    7. Проанализируйте эффективность конъюгации с помощью SDS-PAGE. Используйте 15% разделительный гель, белковый маркер с концентрацией 10–250 кДа и проанализируйте полосы от 15 до 25 кДа (Рисунок 3).
  2. Конъюгация MMAE с N-концевой последовательностью KCKSGG сконструированного FGF2 с помощью малеимидом-тиоловой реакции
    1. Обессоливший FGF2, содержащий N-концевую последовательность KCKSGG и C-концевую последовательность LPETGG, был получен в реакционный буфер (25 мМ HEPES pH 7,0, 10 мМ (NH4)2SO4, 10 мМ метионин, 0,1 мМ ЭДТА) с использованием колонки со смолой Sephadex G-25. Отрегулируйте концентрацию белка до 25 μМ с помощью реакционного буфера.
    2. Растворите MMAE в DMAc для приготовления 40 мМ стокового раствора.
    3. В новую реакционную пробирку добавляют сначала четырехкратный молярный избыток MMAE над белковыми -SH группами. Затем добавьте двойной объем буфера PBS по отношению к объему белка FGF2. Наконец, добавьте белок FGF2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важен порядок добавления реагентов.
    4. Проводите реакцию в течение 1 ч при температуре 20 °C при осторожном вращении.
    5. Загрузите реакционную смесь в колонку карбоксиметил (КМ)-сефароза и смойте избыток несопряженного цитотоксического агента 25 мМ HEPES pH 7,4. Эти мягкие условия препятствуют денатурации белка.
    6. Разбавьте MMAE. FGF2 конъюгат из колонки с 25 мМ HEPES pH 7,4 с 0,5 М NaCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
    7. Проанализируйте эффективность конъюгации с помощью SDS-PAGE. Используйте 15% разделительный гель, белковый маркер с концентрацией 10–250 кДа и проанализируйте полосы от 15 до 25 кДа (Рисунок 3).
  3. Получение конъюгата двойной боеголовки из инженерного FGF2 с использованием комбинации химии малеимида-тиола и сортаза А-опосредованного лигирования
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания сдвоенных боеголовок сопряжены с разработанными FGF2 ступени 2.1 и 2.2. Первый MMAE. Конъюгат FGF2 получают с помощью химии малеимид-тиол (стадия 2.2) и используют для присоединения GGGG-MTX с сортазой A к C концевой метке LPETGG MMAE. FGF2 (шаг 2.1). Также возможна обратная процедура (сначала опосредованная сортазой А-опосредованная конъюгация, затем малеимимид-тиоловая реакция).
    1. Используйте шаги 2.2.1-2.2.7 для приготовления монозамещенных ММАЭ. FGF2 конъюгат.
    2. Замените буфер на реакционный буфер сортазы А (25 мМ HEPES pH 7,4, 150 мМ NaCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ CaCl2) с помощью колонки со смолой Sephadex G-25.
    3. Продолжайте в соответствии с описаниями, приведенными в пунктах 2.1.2-2.1.7.

Результаты

Представленные протоколы описывают две различные стратегии конъюгации различных цитотоксических препаратов в представляющие интерес белки. Кроме того, показана комбинация индивидуальных стратегий, которая позволяет генерировать цитотоксические конъюгаты с двой?...

Обсуждение

В связи с высоким интересом к разработке селективных терапевтических средств против различных типов рака существует острая потребность в стратегиях, позволяющих сайт-специфичное прикрепление отдельных грузов к белкам-мишеням. Сайт-специфичная модификация белков-м...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана First TEAM и программами реинтеграции Фонда польской науки (POIR.04.04.00-00-43B2/17-00; POIR.04.04.00-00-5E53/18-00), софинансируемый Европейским Союзом в рамках Европейского фонда регионального развития, присужденный L.O и A.S. M.Z работа была поддержана OPUS (2018/31/B/NZ3/01656) и Sonata Bis (2015/18/E/NZ3/00501) от Национального научного центра. Работа A.S.W была поддержана грантом Miniatura от Национального научного центра (2019/03/X/NZ1/01439).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CM-Sepharose columnSigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USACCF100
Heparin Sepharose columnGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-0407-01
HiTrap Desalting columnGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe columnGE Healthcare, Chicago, IL, USAGE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monomethyl auristatin E (MMAE)MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-100374Toxic
N,N-Dimethylacetamide (DMAc)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA185884
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA646547

Ссылки

  1. Bethany, H. A new generation of antibody-drug conjugates for cancer patients. Chemical & Engineering News. 98 (14), (2020).
  2. Tu, C., et al. A Combination of structural and empirical analyses delineates the key contacts mediating stability and affinity increases in an optimized biotherapeutic single-chain Fv (scFv). Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1267-1276 (2016).
  3. Sokolowska-Wedzina, A., et al. High-affinity internalizing human scFv-Fc antibody for targeting FGFR1-overexpressing lung cancer. Molecular Cancer Research. 15 (8), 1040-1050 (2017).
  4. Seeger, M. A., et al. construction, and characterization of a second-generation DARPin library with reduced hydrophobicity. Protein Science. 22 (9), 1239-1257 (2013).
  5. Deyev, S., et al. Synthesis, characterization, and selective delivery of DARPin-gold nanoparticle conjugates to cancer cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (10), 2569-2574 (2017).
  6. Currier, N. V., et al. Targeted drug delivery with an integrin-binding Knottin-Fc-MMAF conjugate produced by cell-free protein synthesis. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (6), 1291-1300 (2016).
  7. Cox, N., Kintzing, J. R., Smith, M., Grant, G. A., Cochran, J. R. Integrin-targeting knottin peptide-drug conjugates are potent inhibitors of tumor cell proliferation. Angewandte Chemie International Edition. 55 (34), 9894-9897 (2016).
  8. Goldberg, S. D., et al. Engineering a targeted delivery platform using Centyrins. Protein Engineering Design and Selection. 29 (12), 563-572 (2016).
  9. Altai, M., et al. Affibody-derived drug conjugates: Potent cytotoxic molecules for treatment of HER2 over-expressing tumors. Journal of Controlled Release. 288, 84-95 (2018).
  10. Sochaj-Gregorczyk, A. M., Serwotka-Suszczak, A. M., Otlewski, J. A Novel affibody-Auristatin E conjugate with a potent and selective activity against HER2+ cell lines. Journal of Immunotherapy. 39 (6), 223-232 (2016).
  11. Szlachcic, A., Zakrzewska, M., Lobocki, M., Jakimowicz, P., Otlewski, J. Design and characteristics of cytotoxic fibroblast growth factor 1 conjugate for fibroblast growth factor receptor-targeted cancer therapy. Drug Design, Development and Therapy. 10, 2547-2560 (2016).
  12. Krzyscik, M. A., Opaliński, &. #. 3. 2. 1. ;., Otlewski, J. Novel method for preparation of site-specific, stoichiometric-controlled dual warhead conjugate of FGF2 via dimerization employing sortase A-mediated ligation. Molecular Pharmaceutics. 16 (8), 3588-3599 (2019).
  13. Hermanson, G. T. The Reactions of bioconjugation. Bioconjugate Techniques. , 229-258 (2013).
  14. Lobocki, M., et al. High-yield site-specific conjugation of fibroblast growth factor 1 with monomethylauristatin e via cysteine flanked by basic residues. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 1850-1858 (2017).
  15. Krzyscik, M. A., et al. Cytotoxic conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with monomethyl auristatin e for effective killing of cells expressing FGF receptors. ACS Omega. 2 (7), 3792-3805 (2017).
  16. Chen, I., Dorr, B. M., Liu, D. R. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11399-11404 (2011).
  17. Weiner, E. M., Robson, S., Marohn, M., Clubb, R. T. The sortase A enzyme that attaches proteins to the cell wall of Bacillus anthracis contains an unusual active site architecture. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 23433-23443 (2010).
  18. Sokolowska-Wedzina, A., et al. Efficient production and purification of extracellular domain of human FGFR-Fc fusion proteins from Chinese hamster ovary cells. Protein Expression and Purification. 99, 50-57 (2014).
  19. Merrifield, R. B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society. 85 (14), 2149-2154 (1963).
  20. Chen, Y. Drug-to-antibody ratio (DAR) by UV/Vis spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1045, 267-273 (2013).
  21. Falck, G., Müller, K. M. Enzyme-based labeling strategies for antibody-drug conjugates and antibody mimetics. Antibodies. 7 (1), 4 (2018).
  22. Shental-Bechor, D., Arviv, O., Hagai, T., Levy, Y. Folding of conjugated proteins. Annual Reports in Computational Chemistry. , 263-277 (2010).
  23. Bigman, L. S., Levy, Y. Entropy-enthalpy compensation in conjugated proteins. Chemical Physics. 514, 95-105 (2018).
  24. Danielsson, J., et al. Thermodynamics of protein destabilization in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (40), 12402-12407 (2015).
  25. Świderska, K. W., Szlachcic, A., Czyrek, A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific conjugation of fibroblast growth factor 2 (FGF2) based on incorporation of alkyne-reactive unnatural amino acid. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 25 (14), 3685-3693 (2017).
  26. Krzyscik, M. A., Zakrzewska, M., Otlewski, J. Site-specific, stoichiometric-controlled, PEGylated conjugates of fibroblast growth factor 2 (FGF2) with hydrophilic auristatin Y for highly selective killing of cancer cells overproducing fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1). Molecular Pharmaceutics. 17 (7), 2734-2748 (2020).
  27. Borek, A., Sokolowska-Wedzina, A., Chodaczek, G., Otlewski, J. Generation of high-affinity, internalizing anti-FGFR2 single-chain variable antibody fragment fused with Fc for targeting gastrointestinal cancers. PLOS ONE. 13 (2), 0192194 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

2G

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены