JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Apresentado aqui é um procedimento para expressar e purificar a minodã 5a seguida de uma discussão de sua caracterização, usando ensaios baseados em microscopia de fluorescência in vitro, e como esses métodos podem ser modificados para a caracterização da minosina não-musculo 2b.

Resumo

As proteínas da miosina se ligam e interagem com a actina filamentosa (F-actin) e são encontradas em organismos através da árvore filogenética. Sua estrutura e propriedades enzimáticas são adaptadas para a função particular que executam em células. Myosin 5a anda processivamente em F-actin para transportar melanomas e vesículas em células. Por outro lado, a miose não-sem-músculo 2b opera como um filamento bipolar contendo aproximadamente 30 moléculas. Move F-actin de polaridade oposta em direção ao centro do filamento, onde as moléculas de minosina trabalham assincronamente para ligar actina, transmitir um golpe de força e dissociar antes de repetir o ciclo. A minosina não-muscle 2b, juntamente com suas outras isoformas de miose não-cancerosa 2, tem papéis que incluem aderência celular, citocinese e manutenção de tensão. A mecanoquímica das miosinas pode ser estudada realizando ensaios de motilidade in vitro usando proteínas purificadas. No ensaio de filamento de actina deslizante, as miosinas são vinculadas a uma superfície de deslizamento de microscópio e translocam fluorescentemente rotulada F-actin, que pode ser rastreada. No ensaio de motilidade de molécula/conjunto único, no entanto, f-actin é vinculado a um deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas de minocina fluorescentemente rotuladas na F-actina é observado. Neste relatório, descreve-se a purificação da miose recombinante 5a de células Sf9 utilizando cromatografia de afinidade. Depois disso, descrevemos dois ensaios baseados em microscopia de fluorescência: o ensaio de filamento de actina deslizante e o ensaio de motilidade invertido. A partir desses ensaios, parâmetros como velocidades de translocação de actina e comprimentos de execução de molécula única e velocidades podem ser extraídos usando o software de análise de imagem. Essas técnicas também podem ser aplicadas para estudar o movimento de filamentos únicos das isoformas de miosina não-musada 2, aqui discutidas no contexto da miose não-musada 2b. Este fluxo de trabalho representa um protocolo e um conjunto de ferramentas quantitativas que podem ser usadas para estudar a dinâmica única de moléculas e conjuntos de miosinas não-omuscle.

Introdução

Miosinas são proteínas motoras que exercem força em filamentos de actina usando a energia derivada da hidrolise da adenosina triphosfato (ATP)1. Myosins contêm um domínio de cabeça, pescoço e cauda. O domínio principal contém a região de ligação de actina, bem como o local de vinculação ATP e hidrólise. Os domínios do pescoço são compostos por motivos de QI, que se ligam a correntes de luz, calmodulin, ou proteínas semelhantes à calmodulina2,3. A região da cauda possui várias funções específicas para cada classe de miosinas, incluindo, mas não se limitando à dimerização de duas cadeias pesadas, ligação de moléculas de carga e regulação da minosina através de interações autoinibitórias com os domínios da cabeça1.

As propriedades motile da minosina variam muito entre as classes. Algumas dessas propriedades incluem a razão de serviço (a fração do ciclo mecânico da miosina em que a minoina é obrigada a atuar) e a processividade (a capacidade de um motor de fazer vários passos em sua pista antes do desprendimento)4. As mais de 40 classes de miosinas foram determinadas com base nas análises sequenciais5,6,7,8. As minons classe 2 são classificadas como "convencionais" já que foram as primeiras a serem estudadas; todas as outras classes de miosinas são, portanto, classificadas como "não convencionais".

Myosin 5a (M5a) é uma minosina classe 5 e é um motor processivo, o que significa que pode dar vários passos ao longo de actin antes de dissociar. Possui uma alta relação de dever, indicando que passa grande parte de seu ciclo mecânico vinculado a atuar em9,10,11,12,13,14. Em comum com outras miosinas, a cadeia pesada contém um domínio motor n-terminal que inclui tanto um actin-binding quanto um sítio de hidrólise ATP seguido por uma região do pescoço que serve como um braço de alavanca, com seis motivos de QI que se ligam a cadeias de luz essenciais (ELC) e calmodulin (CaM)15. A região da cauda contém bobinas enroladas α helicoidais, que escurecem a molécula, seguidas de uma região de cauda globular para carga de ligação. Sua cinética reflete seu envolvimento no transporte de melanócitos em melanócitos e do ântico endoplasmático nos neurônios Purkinje16,17. M5a é considerado o motor prototípico de transporte de carga18.

As miosinas classe 2, ou as miosinas convencionais, incluem as miosinas que alimentam a contração do músculo esquelético, cardíaco e liso, além das isoformas de minosina não muscular 2 (NM2), NM2a, 2b e 2c19. Os isoformes NM2 são encontrados no citoplasma de todas as células e têm papéis compartilhados em citocina, adesão, morfogênese tecidual e migração celular19,20,21,22. Este artigo discute protocolos convencionais de minosina no contexto da minosina não-muscle 2b (NM2b)23. NM2b, em comparação com M5a, tem uma baixa taxa de imposto e é enzimaticamente mais lento com um Vmáximo de 0,2 s-123 em comparação com o Vmáximo de M5a de ≈18 s-124. Notavelmente, construções TN2b truncadas com duas cabeças não se movem prontamente processivamente em actin; em vez disso, cada encontro com actina resulta em um golpe de força seguido de dissociação da molécula25.

O NM2b contém duas correntes pesadas de miosina, cada uma com um domínio de cabeça globular, um braço de alavanca (com um ELC e uma cadeia leve regulatória (RLC)), e um domínio de barra de bobina/cauda de bobina α helicoidal, aproximadamente 1.100 aminoácidos de comprimento, que escurece essas duas cadeias pesadas. A atividade enzimática e o estado estrutural do NM2b são regulados pela fosforilação da RLC23. NM2b não fosforylated, na presença de FORÇAS Iônicas ATP e fisiológicas (aproximadamente 150 mM de sal), adota uma conformação compacta em que as duas cabeças participam de uma interação assimétrica e a cauda dobra sobre as cabeças em dois lugares23. Neste estado, a minosina não interage fortemente com a actina e tem atividade enzimática muito baixa. Após a fosforilação RLC por quinase da cadeia de luz da miosina dependente da calmodulina (MLCK) ou quinase proteica associada a Rho, a molécula se estende e se associa a outras micosinas através da região da cauda para formar filamentos bipolares de aproximadamente 30 moléculas de minosina23. A fosforilação acima mencionada do RLC também leva ao aumento da atividade ATPase ativada por actina de NM2b em aproximadamente quatrovezes 26,27,28. Este arranjo de filamento bipolar, com muitos motores de miose em cada extremidade, é otimizado para papéis na manutenção de contração e tensão, onde os filamentos actin com polaridades opostas podem ser movidos em relação uns aos outros23,29. Assim, o NM2b tem se mostrado um conjunto de motores ao interagir com actin. O grande número de motores dentro deste filamento permite que os filamentos NM2b se movam processivamente em filamentos de actina, tornando possível a processividade de filamento in vitro para caracterizar29.

Embora tenha sido feito progresso na compreensão do papel das miosinas na célula, há a necessidade de entender suas características individuais no nível da proteína. Para entender as interações de actomiosina a um simples nível de interação proteína-proteína, em vez de dentro de uma célula, podemos expressar e purificar miosinas recombinantes para uso em estudos in vitro. Os resultados de tais estudos então informam os mecanobiologistas sobre as propriedades biofísicas de miosinas específicas que acabam por conduzir processos celulares complexos12,13,14,25,29. Normalmente, isso é realizado adicionando uma etiqueta de afinidade a uma construção de minosina truncada ou de comprimento completo e purificando através da cromatografia de afinidade29,30,31. Além disso, a construção pode ser projetada para incluir um fluorohore geneticamente encoável ou uma etiqueta para rotulagem de proteínas com um fluoróforo sintético. Adicionando tal rótulo fluorescente, estudos de imagem de molécula única podem ser realizados para observar a mecânica da miosina e cinética.

Após a purificação, a minosina pode ser caracterizada de várias maneiras. A atividade atpase pode ser medida por métodos colorimétricos, fornecendo insights sobre o consumo global de energia e a afinidade ativa do motor em diferentes condições32. Para aprender sobre a mecanoquímica de sua motilidade, mais experimentos são necessários. Este artigo detalha dois métodos à base de microscopia de fluorescência in vitro que podem ser usados para caracterizar as propriedades motil de uma proteína de minosina purificada.

O primeiro desses métodos é o ensaio de filamento de actina deslizante, que pode ser usado para estudar quantitativamente as propriedades do conjunto de motores de miosina, bem como estudar qualitativamente a qualidade de um lote de proteína purificada33. Embora este artigo discuta o uso de microscopia de fluorescência interna total (TIRF) para este ensaio, esses experimentos podem ser efetivamente realizados usando um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com uma câmera digital, comumente encontrado em muitos laboratórios34. Neste ensaio, uma camada saturada de motores de miosina é anexada a um deslizamento de tampa. Isso pode ser realizado usando nitrocelulose, anticorpos, membranas, superfícies derivadassio 2(como trimetilcloosilano), entre outros29,33,35,36,37,38. Filamentos de actina fluorescentemente rotulados são passados através da câmara de deslizamento de cobertura, sobre a qual a actina se liga à mosina anexada à superfície. Após a adição de ATP (e quinases no estudo de NM2), a câmara é imageada para observar a translocação de filamentos de actina pelas miosinas ligadas à superfície. O software de rastreamento pode ser usado para correlacionar a velocidade e o comprimento de cada filamento de actin de deslizamento. O software de análise também pode fornecer uma medida do número de filamentos de actin móveis e estacionários, o que pode ser útil para determinar a qualidade de uma determinada preparação de mosina. A proporção de filamentos parados também pode ser intencionalmente modulada por amarração superficial de actina a outras proteínas e medida para determinar a dependência de carga da minoina39. Como cada filamento de actina pode ser impulsionado por um grande número de motores disponíveis, este ensaio é muito reprodutível, com a velocidade medida final sendo robusta para perturbações como alterações na concentração inicial de mosina ou a presença de fatores adicionais na solução. Isso significa que pode ser facilmente modificado para estudar a atividade da mosina em diferentes condições, como fosforilação alterada, temperatura, força iônica, viscosidade da solução e os efeitos da carga induzida por amarras superficiais. Embora fatores como "cabeças mortas" de miose de ligação forte incapazes de hidrolise ATP possam causar filamentos de actin paralisados, existem múltiplos métodos para mitigar tais problemas e permitir medições precisas. As propriedades cinéticas da miosina variam muito entre as classes e, dependendo da miosina específica utilizada, a velocidade do planto de filamento actin neste ensaio pode variar de menos de 20 nm/s (miosina 9)40,41, e até 60.000 nm/s(myosin characeano 11)42.

O segundo ensaio inverte a geometria do ensaio de filamento de planagemactin 12. Aqui, os filamentos de actina são anexados à superfície do deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas únicas de M5a ou de filamentos bipolares individuais de NM2b são visualizados. Este ensaio pode ser usado para quantificar os comprimentos de execução e velocidades de moléculas de miosina únicas ou filamentos em actina. Uma mancha de cobertura é revestida com um composto químico que bloqueia a ligação não específica e funcionaliza simultaneamente a superfície, como biotina-polietileno glicol (biotina-PEG). A adição de derivados de avidin modificados, em seguida, primes a superfície e actina biotinilada é passada através da câmara, resultando em uma camada de F-actin firmemente amarrado ao fundo da câmara. Finalmente, a minosina ativada e fluorescente (tipicamente 1-100 nM) é fluída através da câmara, que é então imagem para observar o movimento da mosina sobre os filamentos estacionários de actina.

Essas modalidades representam métodos rápidos e reprodutíveis que podem ser empregados para examinar a dinâmica tanto das miosinas não musculares quanto das miosinas musculares. Este relatório descreve os procedimentos para purificar e caracterizar tanto m5a quanto NM2b, representando miosinas não convencionais e convencionais, respectivamente. Isso é seguido por uma discussão de algumas das adaptações específicas da minosina, que podem ser realizadas para alcançar uma captura bem sucedida de movimento nos dois tipos do ensaio.

Expressão e biologia molecular
O cDNA para a minosina de interesse deve ser clonado em um vetor pFastBac1 modificado que codifica para uma tag BANDEIRA de terminal C (DYKDDDDK) se expressando M5a-HMM, ou uma tag BANDEIRA N-terminal se expressar a molécula de comprimento completo de NM2b23,43,44,45,46. As tags FLAG do terminal C no NM2b resultam em uma afinidade enfraquecida da proteína para a coluna de afinidade bandeira. Em contraste, a proteína marcada por BANDEIRA N geralmente se liga bem à coluna de afinidade BANDEIRA23. A proteína marcada n-terminalmente retém atividade enzimática, atividade mecânica e regulação dependente de fosforilação23.

Neste artigo, foi utilizado um rato truncado M5a heavy meromyosin (HMM) com um GFP entre a tag FLAG e o C-terminus da cadeia pesada de miosina. Observe que, ao contrário do NM2b, o M5a-HMM pode ser marcado e purificado com sucesso com as tags FLAG N ou C-terminal e, em ambos os casos, a construção resultante estará ativa. A cadeia pesada M5a foi truncada no aminoácido 1090 e contém um linker de três aminoácidos (GCG) entre o GFP e a região da bobina enrolada do M5a47. Nenhum linker adicional foi adicionado entre o GFP e o FLAG-tag. M5a-HMM foi co-expressado com calmodulin. A construção humana nM2b foi co-expressa com ELC e RLC. O N-termini do RLC foi fundido com um GFP através de um linker de cinco aminoácidos (SGLRS). Diretamente anexado à tag FLAG era um HaloTag. Entre o HaloTag e o N-terminus da cadeia pesada de minosina havia um linker feito de dois aminoácidos (AS).

Ambas as preparações de minosina foram purificadas a partir de um litro de cultura celular Sf9 infectada com baculovírus a uma densidade de aproximadamente 2 x 106 células/mL. Os volumes do baculovírus para cada subunidade dependiam da multiplicidade de infecção do vírus, conforme determinado pelas instruções do fabricante. No caso do M5a, as células foram co-infectadas com dois baculovírus diferentes- um para calmodulin, e um para cadeia pesada M5A. No caso do NM2b, as células foram co-infectadas com três vírus diferentes- um para ELC, um para RLC e um para cadeia pesada NM2b. Para laboratórios que trabalham com uma diversidade de miose (ou outras proteínas multi-complexas), essa abordagem é eficiente, pois permite muitas combinações de cadeias pesadas e leves e cadeias leves comumente usadas, como a calmodulina, podem ser co-transfetadas com muitas cadeias pesadas de micosina diferentes. Todo o trabalho celular foi concluído em um armário de biossegurança com técnica estéril adequada para evitar contaminação.

Para a expressão de M5a e NM2b, as células Sf9 que produzem as miosinas recombinantes foram coletadas de 2 a 3 dias após a infecção, via centrifugação, e armazenadas a -80 °C. As pelotas celulares foram obtidas pela centrifugação das células Sf9 co-infectadas a 4 °C por 30 min a 2.800 x g. O processo de purificação de proteínas é detalhado abaixo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Purificação de proteínas

  1. Lise celular e extração de proteínas
    1. Prepare um buffer de extração de 1,5x com base na Tabela 1. Filtrar e armazenar a 4 °C.
    2. Comece a descongelar as pelotas de célula no gelo. Enquanto as pelotas estão descongelando, suplemente 100 mL de Tampão de Extração com dithiothiothreitol de 1,2 mM (DTT), 5 μg/mL leupepína, 0,5 μM de flúor de fenilmetilasulfonyl (PMSF) e dois comprimidos inibidores de protease. Mantenha-se no gelo.
    3. Uma vez que a pelota tenha descongelado, adicione 1 mL do buffer de extração suplementado por 10 mL de cultura celular. Por exemplo, se as pelotas celulares foram formadas a partir de 500 mL de cultura celular, em seguida, adicione 50 mL de tampão de extração suplementar à pelota.
    4. Sonicar as pelotas de células enquanto as mantém no gelo. Para cada pelota, utilize as seguintes condições: 5 s ON, 5 s OFF, duração de 5 min, potência 4-5.
    5. Colete todos os lysate homogeneizados em um béquer e adicione ATP (solução de estoque de 0,1 M; pH 7.0) de tal forma que a concentração final de ATP seja de 1 mM. Mexa por 15 minutos em uma sala fria. O ATP dissocia a minoina ativa da actina, permitindo que ela seja separada na etapa de centrifugação seguinte. É, portanto, essencial avançar para o próximo passo imediatamente para minimizar a possibilidade de esgotamento e revincagem da ATP.
    6. Centrifugar os lysates a 48.000 x g por 1 h a 4 °C. Enquanto isso estiver ocorrendo, comece a lavar 1-5 mL de um chorume de 50% de resina de afinidade Anti-FLAG (para uma pelota formada a partir de 1 L de células) com soro fisco tamponado de 100 mL (PBS), de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, para 5 mL de resina, lave 10 mL de um chorume de 50%. Na etapa final de lavagem, resuspenja a resina com 1-5 mL de PBS com volume suficiente para criar um chorume de 50%.
    7. Após a centrifugação de lise, combine o supernasce com o chorume de resina lavada e a rocha suavemente na sala fria por 1-4 h. Enquanto espera, faça os buffers descritos na Tabela 1 e mantenha-os no gelo.
  2. Preparação de purificação de afinidade flag
    1. Centrifugar a solução na etapa 1.7 a 500 x g por 5 min a 4 °C. A resina será embalada na parte inferior do tubo. Sem perturbar a resina, remova o supernatante.
    2. Resuspenda a resina em 50 mL de Buffer A conforme detalhado na Tabela 1 e centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C. Sem perturbar a resina, remova o supernatante.
    3. Resuspenda a resina em 50 mL de Buffer B conforme detalhado na Tabela 1 e centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C. Repita esta etapa mais uma vez e resuspense a resina em 20 mL de Buffer B. Em seguida, misture a resina e o tampão cuidadosamente invertendo suavemente o tubo manualmente aproximadamente 10 vezes.
  3. Elução e concentração de proteínas
    1. Faça 30 mL de Amortecedor de Elução como descrito na Tabela 1 e deixe esfriar no gelo.
    2. Coloque a coluna de eluição em uma sala fria. Despeje suavemente o chorume de resina na coluna. Lave a coluna com volumes de 1-2 colunas de Buffer B enquanto a resina embala na parte inferior, garantindo que a resina não seque.
    3. Flua 1 mL do Buffer de Elução através da resina e colete o fluxo através de um tubo de 1,5 mL. Repita de tal forma que 12, 1 mL frações são coletadas.
    4. Neste ponto, realize um teste bruto de Bradford nas frações para determinar qualitativamente quais frações são as48mais concentradas . Em uma fileira de uma placa de 96 poços, pipeta 60 μL 1x reagente Bradford. À medida que as frações são coletadas, misture 20 μL de cada fração por poço. Uma coloração azul mais escura indica as frações mais concentradas.
    5. Em um tubo de 50 mL, colete a proteína restante tubondo suavemente o buffer de elução restante através da coluna, para liberar qualquer mose restante ligada à resina na coluna fluindo através. Este fluxo será concentrado na próxima etapa. Certifique-se de que a resina seja então regenerada para reutilização e armazenada de acordo com as instruções do fabricante.
    6. Acumule as três frações mais concentradas e concentre ainda mais o fluxo no tubo de 50 mL, bem como as frações restantes de 1 mL usando um tubo concentrador de 100.000 MWCO. Carregue a amostra agrupada no tubo concentrador e centrífuga a 750 x g por 15 minutos a 4 °C e repita até que toda a proteína elucida tenha sido concentrada a um volume final de aproximadamente 0,5-1 mL.
      NOTA: Este tamanho de poros permite a retenção das moléculas de minosina, que têm massas várias vezes o corte de peso molecular. As correntes de luz permanecem firmemente ligadas aos domínios do motor durante este período de concentração, conforme verificado pela realização da eletroforese de gel SDS-PAGE no produto final.
  4. Diálise e congelamento de flash
    1. Faça 2 L de Tampão de Diálise, conforme descrito na Tabela 1. Carregue a amostra em um saco de diálise ou câmara e digele durante a noite na sala fria. Observe que a composição dos buffers de diálise difere para NM2b e M5a.
      NOTA: No caso do NM2b, o objetivo desta etapa de diálise é formar filamentos de miosina no buffer de baixa resistência iônica. A sedimentação desses filamentos fornece então uma etapa adicional de purificação e permite a concentração da amostra. Haverá, portanto, um precipitado branco visível na câmara de diálise no dia seguinte. Esses filamentos serão coletados por centrifugação e despolmerizados na etapa 5.1. No caso do M5a-HMM, após a diálise noturna, a proteína será suficientemente pura para o uso em ensaios subsequentes. Outras etapas de purificação, como filtração de gel ou cromatografia de troca iônica, podem ser realizadas, se necessário. Para recuperação de M5a após a diálise, vá para a etapa 5.2.
  5. Recuperando a minosina após a diálise
    1. Para NM2b, descarregue cuidadosamente toda a amostra do saco de diálise ou câmara e centrífuga a 4 °C por 15 min a 49.000 x g para coletar os filamentos de miosina. Descarte o supernatante e adicione incrementalmente o buffer de armazenamento à pelota, conforme descrito na Tabela 1 até que ele tenha dissolvido. A tubulação suave para cima e para baixo ajuda a solubilizar a pelota. Normalmente, isso não requer mais de 500 μL por tubo. Depois de garantir que a pelota seja totalmente dissolvida no buffer de armazenamento de alta resistência iônica, uma etapa de centrifugação adicional (15 min a 49.000 x g) pode ser realizada para remover agregados indesejados, se necessário, uma vez que a minosina agora será não polimerizada e permanecerá no supernatário.
    2. Para M5a-HMM, colete cuidadosamente toda a amostra da câmara de diálise e centrífuga a 4 °C por 15 min a 49.000 x g no caso de quaisquer agregados indesejados estarem presentes. Pegue o supernatante.
  6. Determinação de concentração e congelamento de flash
    1. Para determinar a concentração do produto, meça a absorvência utilizando um espectrofotômetro nos comprimentos de onda 260, 280, 290 e 320 nm. Calcule a concentração em mg/mL (cmg/mL) com a Equação 1,onde A280 representa a absorção em 280 nm e A320 representa a absorção em 320 nm. A concentração resultante em mg/mL pode ser convertida em μM de moléculas de mosina com a Equação 2,onde M é o peso molecular de toda a proteína (incluindo as cadeias pesadas, cadeias leves, fluoroforos e todas as tags).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      moléculas μM = 1000cmg/mL/M (2)
      NOTA: Se uma diluição for necessária, deve ser feita em um tampão de alta resistência iônica. O coeficiente de extinção (ε) pode ser determinado importando a sequência de aminoácidos da proteína em um programa como o ExPASy. O rendimento típico do M5a-HMM é de aproximadamente 0,5-1 mL de 1-5 mg/mL de proteína e para o NM2b de comprimento completo é de 0,5-1 mL de 0,5-2 mg/mL. O coeficiente de extinção do M5a-HMM utilizado neste artigo foi de 0,671. O coeficiente de extinção do NM2b utilizado neste artigo foi de 0,611.
    2. Guarde a miose purificada de uma das duas maneiras. Alíquota entre 10-20 μL em um tubo de paredes finas, como um tubo de reação em cadeia de polimerização, e deixe cair o tubo em um recipiente de nitrogênio líquido para congelamento de flash. Alternativamente, pipeta diretamente entre 20-25 μL de minosina em nitrogênio líquido e armazenar as contas congeladas de proteína em tubos criogênicos estéreis. Em ambos os casos, os tubos resultantes podem ser armazenados em -80 °C ou nitrogênio líquido para uso futuro.
      NOTA: Uma vez que ambos os ensaios de motilidade descritos abaixo requerem quantidades muito pequenas de proteína, o armazenamento em pequenas alíquotas, como descrito, é econômico.

2. Ensaio de filamento de actina de deslizamento

  1. Preparação do Coverlip
    1. Faça uma solução de 1% de nitrocelulose em acetato de amilo.
    2. Obtenha um prato de cultura tecidual (150 x 25 mm) e adicione um papel filtro circular (125 mm de diâmetro) na parte inferior do prato.
    3. Carregue oito coberturas quadradas de 22 mm de espessura nº 1,5 mm em um rack e lave com aproximadamente 2-5 mL de etanol à prova de 200, seguido por 2-5 mL de água destilada (dH2O). Repita esta etapa de lavagem, terminando com água. Em seguida, seque as tampas completamente usando uma linha de ar filtrada ou linha N2.
    4. Pegue uma mancha de cobertura e pipeta lentamente 10 μL da solução de nitrocelulose de 1% ao longo de uma borda do deslizamento. Em seguida, em um movimento suave, esfregue-o através do resto da tampa usando o lado de uma ponta de pipeta de 200 μL de lado liso. Coloque esta mancha no prato de cultura tecidual com o lado nitrocelulose para cima. Repita para as tampas restantes e deixe-as secar enquanto preparam os reagentes restantes e use tampas dentro de 24 horas após o revestimento.
  2. Preparação da câmara
    1. Limpe um slide de microscópio com um papel de lente óptica para limpar grandes detritos. Corte duas peças de fita dupla face, aproximadamente 2 cm de comprimento.
    2. Coloque uma peça ao longo do meio da borda longa do slide do microscópio. Certifique-se de que a borda da fita se alinha com a borda do slide. Coloque a segunda peça de fita cerca de 2 mm abaixo da primeira peça de fita de tal forma que os dois estejam paralelos e alinhados. Isso cria uma câmara de fluxo que pode conter aproximadamente 10 μL de solução (ver Figura 1).
    3. Pegue uma das tampas revestidas de nitrocelulose da Parte 1. Coloque cuidadosamente a mancha na fita de tal forma que o lado revestido com nitrocelulose esteja fazendo contato direto com a fita ( ver Figura 1). Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente para baixo na interface de fita deslizante para garantir que o deslizamento tenha aderido corretamente ao slide. Corte o excesso de fita pendurada sobre a borda do slide com uma lâmina de barbear.
  3. Preparação actin
    1. Faça 20 μM F-actin polimerizando actina globular (G-actin) em tampão de polimerização (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) a 4 °C durante a noite.
    2. Diluir F-actin a 5 μM no tampão de motilidade (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). Rotule com pelo menos 1,2x de excesso molar de rhodamina-phalloidin. Deixe (coberto de papel alumínio) por pelo menos 2 h no gelo. Isso pode ser usado por até 1-2 meses, armazenado no gelo.
  4. Realizando o ensaio de filamento de planagem myosin 5a
    NOTA: Nesta seção, são fornecidos os detalhes do ensaio de deslizamento myosin 5a (HMM).
    1. Prepare as soluções para minosina 5a descritas na Tabela 2 e mantenha-as no gelo.
    2. Flua em 10 μL da minosina 5a (50-100 nM) através da câmara de fluxo e espere por 1 min.
    3. Flua em 10 μL do BSA de 1 mg/mL em 50 mM MB com 1 mM DTT (tampão "sal baixo"). Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal, colocando suavemente o canto do papel na saída da câmara de fluxo.
    4. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    5. Flua em 10 μL da solução de actin preto (5 μM F-actin, 1 μM calmodulin e 1 mM ATP em 50 mM MB com 1 mM DTT) para eliminar "cabeças mortas", como discutido na seção Discussão.
      1. Pipeta a solução com uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G para corte dos filamentos de actin antes de introduzir a solução para a câmara. Repita esta etapa mais duas vezes e espere 1 min após a terceira vez. Aproximadamente 20 eventos de pipetação são suficientes.
      2. Para realizar o giro "cabeça morta", adicione uma quantidade estequiométrica de F-actin à mosina na presença de 1 mM ATP e 1 mM MgCl2 em uma concentração de sal de 500 mM. Em seguida, ultracentrifuuge a 480.000 x g para 15 min a 4 °C. A minosina morta estará na pelota.
    6. Flua em 50 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT e 1 mM ATP para esgotar a câmara de filamentos de ato livre.
    7. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes para esgotar a câmara de qualquer ATP.
    8. Flua em 10 μL de 20 nM rhodamine actin (Rh-Actin) solução contendo 1 mM DTT em 50 mM MB e espere por 1 min para permitir a vinculação rigorosa de filamentos actin ao myosin 5a anexado à superfície do deslizamento de cobertura.
    9. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT para lavar filamentos Rh-Actin não ligados à superfície. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    10. Flua em 30 μL de Buffer Final.
    11. Grave imagens em um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 561 nm para visualizar Rh-Actin. Um tempo de exposição adequado é de 200 ms a 1,4 mW de potência laser para uma duração total de aquisição de 0,5-1 min.
      NOTA: Certifique-se de que a taxa de aquisição seja dimensionada adequadamente para a velocidade dos filamentos móveis. Uma consideração importante antes de coletar dados para uso com programas de rastreamento é a taxa de quadros de aquisição. Movimentos de subpixel entre quadros resultarão em uma superestimação da velocidade, e movimentos de várias centenas de nanômetros são necessários para obter valores precisos. Uma taxa de aquisição ótima apresenta o planante de pelo menos um pixel de distância entre os quadros. No caso do microscópio TIRF utilizado para a imagem aqui, este limiar se traduz em 130 nm; portanto, uma minosina esperada para viajar 1 μm/s deve ser imageda a uma taxa de 5 quadros/s (intervalo de 0,2 s) para alcançar 200 nm de movimento, enquanto uma mosina esperada para viajar 10 nm/s requer 0,05 quadros/s (intervalos de 20 s). Os dados podem, portanto, ser retirados nesta fase, se necessário (consulte Discussão para obter mais detalhes).
  5. Realizando o ensaio de filamento de planagem de minosina não-musada 2b
    NOTA: Nesta seção, são fornecidos os detalhes do ensaio de deslizamento de minodão não-sem-músculo de comprimento completo 2b. O protocolo de ensaio de planagem de mísamo não-músculo 2b é diferente do protocolo myosin 5a em certos passos. Certifique-se de que os buffers corretos sejam usados para cada uma dessas etapas. Por exemplo, o ensaio NM2b requer a fixação da mosina ao deslizamento de cobertura em tampão de sal alto, enquanto o M5a pode ser anexado ao deslizamento de cobertura em tampões de sal altos ou baixos. Além disso, o ensaio de filamento de planagem M5a utiliza uma menor concentração de miose para mitigar a frequência de filamentos actin se rompendo durante a aquisição.
    1. Prepare as soluções para nM2b conforme descrito na Tabela 2 e mantenha-as no gelo.
    2. Flua em 10 μL da mosina não moída 2b (0,2 μM) em 500 mM M Motility Buffer (MB) (tampão "sal alto") e 1 mM dithiothreitol (DTT) através da câmara de fluxo e esperar por 1 min.
      NOTA: Os tampões de sal elevados dissociam filamentos de miosina e permitem a fixação de moléculas únicas de miosina à superfície, pois a mísmo não-hídis 2b pode polimerizar em filamentos na concentração iônica < 150 mM.
    3. Flua em 10 μL do albumina de soro bovino de 1 mg/mL (BSA) em 500 mM MB com 1 mM DTT (tampão de "sal alto") conforme descrito na Tabela 2. Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal.
    4. Lave com 10 μL de 500 mM MB com 1 mM DTT conforme descrito na Tabela 2. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    5. Flua em 10 μL da solução de actina negra, conforme descrito na Tabela 2, para eliminar "cabeças mortas", como discutido mais adiante na seção Discussão. A solução de actina preta contém 5 μM de F-actin não rotulado, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2, 1 μM CaM, e 1 mM DTT em 50 mM NaCl mCl mCl tampão de motilidade para fosforrylate o nãomuscleosin 2b na superfície da câmara.
      1. Pipeta a solução com uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G para corte dos filamentos de actin antes de introduzir a solução para a câmara. Repita esta etapa mais duas vezes e espere 1 min após a terceira vez. Aproximadamente, 20 eventos de tubulação são suficientes.
    6. Flua em 50 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT e 1 mM ATP para esgotar a câmara de filamentos de ato livre.
    7. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes para esgotar a câmara de qualquer ATP.
    8. Flua em 10 μL de solução rh-actina de 20 nM contendo 1 mM DTT em 50 mM MB e espere 1 min para permitir a vinculação rigorosa de filamentos de actina ao mosina não mocle 2b anexado à superfície do deslizamento de cobertura.
    9. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT para lavar filamentos Rh-Actin não ligados à superfície. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    10. Flua em 30 μL de Buffer Final. Para o ensaio de filamento de planagem de miose não-sem-músculo 2b, o Buffer Final também inclui calmodulin, CaCl2e quinase da cadeia de luz da micosina para fornecer fosforilação completa da minosina não-musculo 2b durante a imagem de vídeo. 0,7% de metilcelulose também pode ser incluído no Buffer Final se os filamentos de actina estiverem apenas frouxamente ligados ou não estiverem vinculados à superfície. Isso é discutido ainda na seção discussão.
    11. Grave imagens em um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 561 nm. Um tempo de exposição adequado é de 200 ms a 1,4 mW de potência laser para uma duração total de aquisição de 0,5 -3 min.
      NOTA: Certifique-se de que a taxa de aquisição seja dimensionada adequadamente para a velocidade dos filamentos móveis. Uma consideração importante antes de coletar dados para uso com programas de rastreamento é a taxa de quadros de aquisição. Movimentos de subpixel entre quadros resultarão em uma superestimação da velocidade, e movimentos de várias centenas de nanômetros são necessários para obter valores precisos. Uma taxa de aquisição ótima apresenta o planante de pelo menos um pixel de distância entre os quadros. No caso do microscópio TIRF utilizado para a imagem aqui, este limiar se traduz em 130 nm; portanto, uma minosina esperada para viajar 1 μm/s deve ser imageda a uma taxa de 5 quadros/s (intervalo de 0,2 s) para alcançar 200 nm de movimento, enquanto uma mosina esperada para viajar 10 nm/s requer 0,05 quadros/s (intervalos de 20 s). Os dados podem, portanto, ser amostrados nesta fase, se necessário (consulte Discussão para obter mais detalhes).

3. Ensaio de TIRF de molécula única

  1. Preparação do Coverlip
    1. Divida o pó de caldo em alíquotas de 10 mg (em tubos de 1,5 mL) de metoxi-Peg-silane (mPEG) e 10 mg de biotin-Peg-silane (bPEG). Armazene a -20 °C em um recipiente lacrado e sem umidade e use dentro de 6 meses.
    2. Carregue oito camadas de espessura nº 1,5H (alta precisão) 22 mm de cobertura quadrada em um rack e lave com 2-5 mL de etanol à prova de 200, seguido por 2-5 mL de água destilada. Repita esta etapa de lavagem, terminando com água. Em seguida, seque as tampas completamente usando uma linha de ar ou N2 e limpa de plasma com argônio por 3 minutos.
    3. Coloque as tampas limpas no papel filtro (90 mm) em um prato de cultura de tecido (100 x 20 mm) e incubar em um forno de 70 °C enquanto realiza as etapas seguintes.
      NOTA: A limpeza plasmática pode ser substituída por outros métodos químicos de limpeza49.
    4. Prepare 80% de solução de etanol com dH2O e ajuste o pH para 2.0 usando HCl. Adicione 1 mL deste a uma alíquota de 10 mg de mPEG e 1 mL a uma alíquota de 10 mg de bPEG. Vórtice para dissolver, que não deve levar mais de 30 s.
    5. Pegue 100 μL da solução bPEG e adicione 900 μL de 80% de etanol (pH 2.0). Esta solução é de 1 mg/mL bPEG. Em seguida, faça uma solução de ambos os PEGs da seguinte forma, misturando-se completamente.
      1. 200 μL de 10 mg/mL mPEG (concentração final: 2 mg/mL).
      2. 10 μL do bPEG de 1 mg/mL (concentração final: 10 μg/mL).
      3. 790 μL da solução de 80% de etanol (pH 2.0).
    6. Tire as tampas do forno. Dispense cuidadosamente 100 μL da solução PEG no centro de cada deslizamento de cobertura, garantindo que apenas a superfície superior esteja molhada. Em seguida, coloque os deslizamentos de volta no forno e incubar por 20 a 30 min.
    7. Quando as tampas começarem a assumir uma aparência furada, com pequenos círculos aparentes através da superfície, remova-os do forno.
    8. Lave cada tampa com 100% de etanol, seque com uma linha de ar e coloque de volta no forno. Incubar apenas pelo tempo necessário para criar câmaras na etapa 2.
  2. Preparação da câmara
    1. Limpe um slide de microscópio para uso na fabricação da câmara. Corte duas peças de fita dupla face, aproximadamente 2 cm de comprimento.
    2. Coloque uma peça ao longo do meio da borda longa do slide do microscópio. Certifique-se de que a borda da fita se alinha com a borda do slide. Coloque a segunda peça de fita cerca de 2 mm abaixo da primeira peça de fita de tal forma que os dois estejam paralelos e alinhados.
    3. Pegue uma das tampas funcionais do forno (criada em 3.1). Coloque cuidadosamente a mancha na fita de tal que o lado revestido com PEG esteja de brusão e fazendo contato direto com a fita, como mostrado na Figura 1. Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente para baixo na interface de fita deslizante para garantir que o deslizamento tenha aderido corretamente ao slide.
    4. Corte o excesso de fita que paira sobre o slide com uma lâmina de barbear. Estas câmaras podem ser usadas imediatamente ou colocadas em um tubo de 50 mL e armazenadas em um congelador de -80 °C para uso futuro. É importante armazenar imediatamente ou a superfície se degradará.
  3. Realizando o ensaio de microscopia myosin 5a TIRF
    1. Prepare as soluções para minosina 5a ensaio de motilidade invertida descrito na Tabela 3 e mantenha-as no gelo.
    2. Lave a câmara com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT.
    3. Flua em 10 μL do BSA de 1 mg/mL em 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal.
    4. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    5. Flua em 10 μL da solução NeutrAvidin em 50 mM MB com 1 mM DTT e espere por 1 min.
    6. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    7. Flua em 10 μL de rhodamina biotinilada actina (bRh-Actin) contendo 1 mM DTT em 50 mM MB e espere por 1 min. Para este passo, use uma ponta de pipeta grande e entediada e evite pipetar para cima e para baixo para minimizar o corte dos filamentos fluorescentes de actina para garantir que filamentos de ato longo possam ser anexados à superfície (20-30 μm ou mais). Uma alternativa eficaz é cortar o cone de uma ponta de pipeta padrão (com uma abertura de ≈1-1,5 mm).
    8. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    9. Flua em 30 μL de Buffer Final com myosina 5a de 10 nM adicionada, em seguida, imediatamente carregar no microscópio TIRF e registrar depois de encontrar o foco ideal para a modalidade de imagem TIRF. Os tempos de exposição entre 100-200 ms são apropriados a 1,4 mW de potência laser para a mosina actina e gfp. O tempo de aquisição adequado para análise de velocidade é de 3 minutos.
  4. Realizando o ensaio de microscopia de mísmo não-músculo 2b TIRF
    NOTA: Nesta seção, são fornecidos os detalhes do ensaio tirf de miosina não-hídula 2b utilizando filamentos polimerizados e fosforilados. O protocolo detalhado (seções 4.1-4.3) para fosforilação e polimerização da mísampara não-hísmo-2b em um tubo está incluído.
    1. Para fosforilar o NM2b purificado, faça uma mistura de quinase de 10x com as seguintes condições: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MM MLCK e ATP de 0,1 mM. Isso pode ser levado a volume com 500 mM MB com 10 mM DTT. Adicione a mistura de quinase de 10x à miosina a uma razão volumosa de 1:10 e deixe incubar por 20-30 min à temperatura ambiente. Normalmente, a concentração de miosina para esta etapa é de 1 μM.
    2. Para polimerizar a miosina fosforílalada em filamentos, reduza a concentração de sal do NM2b para 150 mM NaCl. Para isso, faça um tampão de motilidade 1x (1x MB) sem sal diluindo o 4x MB quatro vezes em dH2O. Este 1x MB pode ser usado para diminuir a concentração de sal porque o NM2b foi congelado em um tampão de sal de 500 mM.
    3. Para cada 3 μL de estoque NM2b, adicione 7 μL de 1x MB para diminuir a concentração de sal para 150 mM NaCl e incubar no gelo por 20-30 min para formar filamentos NM2b.
      NOTA: A ordem nas seções 4.1-4.3 não é crucial enquanto o NM2b for fosforilado e a concentração final de sal seja de 150 mM. A incubação na ordem de 30 min-1 h permite tempo suficiente para fosforilação completa e polimerização.
    4. Prepare as soluções para o ensaio de motilidade invertida de 2b invertidos descrito na Tabela 3 e mantenha-as no gelo.
    5. Lave a câmara com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT.
    6. Flua em 10 μL do BSA de 1 mg/mL em 150 mM MB com 1 mM DTT Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal.
    7. Lave com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    8. Flua em 10 μL da solução NeutrAvidin em 150 mM MB com 1 mM DTT e espere por 1 min.
    9. Lave com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    10. Flua em 10 μL de bRh-Actin e espere por 1 min. Para este passo, use uma ponta de pipeta grande e entediada e evite pipetar para cima e para baixo para minimizar o corte dos filamentos fluorescentes de actina, para garantir que filamentos de ato longo possam ser anexados à superfície (20-30 μm ou mais). Uma alternativa eficaz é cortar o cone de uma ponta de pipeta padrão.
    11. Lave com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    12. Flua em 10 μL da solução de minosina não moída 2b (aproximadamente 30 nM) e espere por 1 min.
    13. Lave com 10 μL de 150 MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
    14. Flua em 30 μL de Buffer Final, depois carregue imediatamente no microscópio TIRF e registre após encontrar o foco ideal para a modalidade de imagem TIRF. Os tempos de exposição entre 100-200 ms são apropriados a 1,4 mW de potência laser para a mosina actina e gfp. O tempo de aquisição adequado para análise de velocidade é de 3 minutos.

4. Análise de imagem

  1. Análise de imagem para ensaio de filamento de actina de deslizamento
    NOTA: As imagens podem ser analisadas utilizando o software e os manuais vinculados na Lista de Materiais. É importante notar que o programa descrito aqui requer pilhas de TIFF para análise. O processo de análise do ensaio de filamento de planagem é o seguinte50.
    1. Carregue pilhas de filmes brutos em uma estrutura de pasta especificada e insira o diretório mais alto das pastas de filme no programa.
      NOTA: O programa analisa os arquivos ao longo deste diretório e subdiretórios, tratando os diretórios de nível mais baixo como replicação. Serão produzidas estatísticas médias para cada grupo de réplicas. Neste caso, um único filme foi usado para cada minosina. Ao caracterizar uma nova miose ou investigar uma nova condição experimental, recomenda-se analisar filmes de três campos de vista (FOV) por câmara para um total de três câmaras e repetir este fluxo de trabalho para três preparações da miosina que estão sendo investigadas.
    2. Use o script "stack2tifs" em conjunto com a taxa de quadros inserida pelo usuário para converter cada pilha TIFF em uma pasta contendo uma série de arquivos TIFF individuais e um arquivo de metadados correspondente.txt contendo o tempo de início de cada quadro. Para dados que não estão no formato de pilha TIFF, uma conversão deve ser aplicada primeiro usando softwares como os listados na Tabela de Materiais.
      NOTA: Este script é a parte do pacote de software. As informações do roteiro podem ser encontradas aqui: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Use o parâmetro -px, que é o tamanho do pixel (em nm) durante a aquisição. Neste caso, o tamanho do pixel é de 130 nm. Use os parâmetros -xmax e -ymax para dimensionar os eixos para as saídas de gráficos de dispersão. Estes correspondem ao maior comprimento de filamento plotado e à velocidade máxima plotada (em nm/s).
      NOTA: Estes são valores estimados e podem ser definidos em valores acima do esperado para garantir que os dados estejam contidos na parcela. Após a análise, os dados brutos também podem ser exportados para uso em outros softwares estatísticos ou gráficos para visualização e análise.
    4. Use o parâmetro -minv, que é um parâmetro de corte de velocidade mínima, para definir os filamentos que não estão se movendo e podem, portanto, ser excluídos da análise. Para uma minosina lenta como o NM2b, este parâmetro deve ser baixo (neste exemplo, 5 nm/s) para evitar cortar movimentos de deslizamento verdadeiros. Para uma mosina rápida como m5a, este parâmetro pode ser maior (neste exemplo, 100 nm/s) para aplicar um filtro mais rigoroso, mantendo a verdadeira distribuição de velocidade de deslizamento.
    5. Use o parâmetro de corte -pt para identificar o movimento suave. Para cada janela de amostragem, um valor é calculado equivalente a 100 x Velocidade De desvio padrão/velocidade média. Faixas com valores mais elevados do que o corte, têm velocidades mais variáveis e são excluídas de análises posteriores. Neste exemplo, foi utilizado um valor de corte de 33. Faixas com valores mais elevados têm velocidades mais variáveis e são excluídas de análises posteriores.
    6. Use -maxd para definir uma distância máxima permitida de ligação entre os quadros. Trata-se de uma distância calculada de quadro a quadro movida pelo centroid do filamento em unidades de nm. Pode ser útil para excluir movimentos esporádicos ou ligação incorreta entre filamentos. Nos exemplos aqui, o parâmetro foi deixado no valor padrão de 2.000 nm.
  2. Análise de imagem para ensaio de microscopia TIRF
    NOTA: O processo de análise do ensaio tirf de molécula única no software de imagem especificamente listado no Tabela de Materiais é o seguinte29.
    1. Clique e arraste o vídeo de microscopia gravado para o espaço de trabalho do software para abri-lo51. Então, dividir os canais de aquisição. Clique em Imagem > Cores > Canais Divididos.
      NOTA: No caso de avelrecido deriva de estágio durante a aquisição, as imagens devem ser estabilizadas para corrigir a deriva instrumental no plano de imagem. Neste caso, nenhuma compensação pela deriva do eixo Z foi utilizada, pois o microscópio utilizado para obter esses dados estabiliza bem o foco Z. Para estabilizar a imagem no programa de análise de imagens, instale o plug-in estabilizador apropriado que está ligado na Lista de Materiais. O estabilizador de imagem assume posições fixas para os objetos na imagem e usa uma média de rolamento dos quadros anteriores como referência. O procedimento recomendado é, portanto, começar com o canal contendo imagens de actina rotulada, uma vez que esta é em uma posição fixa.
    2. Clique em Plugins, e encontre estabilizador de imagem; certifique-se de que a tradução está selecionada e mantenha as configurações padrão. Verifique a caixa ao lado dos Coeficientes de Transformação de Log. A aplicação desta etapa log permite que os parâmetros de turno calculados sejam aplicados ao outro canal na próxima etapa. Permita que o processo seja concluído.
    3. Em seguida, abra o canal com minosina rotulada e aplique a estabilização clicando em Plugins > Aplicador de Registro estabilizador de imagem. Se as imagens de actin não puderem ser adquiridas durante a mesma aquisição devido a um requisito para imagens de taxa mais alta em um único canal, a deriva estabilizará a pilha de imagens selecionando uma região que contém objetos estáticos, como um marcador fiduciário biotinína ou fluoroforos ligados não especificamente à superfície biotin-PEG. Esta região pode ser cortada da pilha original e estabilizada, seguida pela aplicação dos valores de mudança resultantes para a pilha original.
      NOTA: Na prática, a deriva observada nos experimentos de motilidade será insignificante em relação ao movimento das miosinas que se movem a várias centenas de nm/s, mas para as miosinas mais lentas isso se torna uma consideração importante.
    4. Em seguida, abra TrackMate, clique em Plugins; em seguida, em seu menu suspenso clique em Rastreamento e, finalmente, no TrackMate. Neste ponto, a análise da imagem está sujeita à otimização com base nos parâmetros do fluorohore e das condições de ensaio. No entanto, parâmetros de partida ideais são os seguintes.
      1. Configurações de calibração: mantenha todos os valores padrão.
      2. Detector: Detector de log.
      3. Diâmetro estimado da bolha: 0,5-1,0 míc bilhão.
      4. Limiar: 25-200. (Isso pode ser determinado clicando em Visualização depois de escolher um número para ver se as manchas detectadas correspondem ao filme e ajustando adequadamente.)
      5. Limiar inicial: não definido.
      6. Vista: HyperStack Displayer.
      7. Coloque filtros nas manchas: não definidos.
      8. Rastreador: Rastreador de LAP simples.
        NOTA: Estes dependem da taxa de quadros e da velocidade da miosina e devem ser grandes o suficiente para conectar posições subsequentes, excluindo conexões indesejadas entre diferentes partículas.
      9. Ligação máxima: 1,0 mícd.
      10. Distância máxima de fechamento de lacunas: 1,0 míccro.
      11. Lacuna máxima de fechamento de lacunas: 1.
      12. Definir filtros nas faixas: Deslocamento de faixa (>0.39-para incluir apenas pontos movendo mais de 3 pixels), pontos nas faixas (>3-para incluir apenas faixas com pelo menos 3 pontos). Outros filtros como o Minimal Velocity podem ser introduzidos para excluir pontos que param por longos períodos. Os resultados da filtragem devem ser verificados por inspeção visual das faixas para garantir que as faixas espúrias (ou seja, o movimento da miosina no fundo que não esteja ao longo de uma pista de actina) sejam removidas mantendo as faixas associadas à actina.
    5. Uma vez que a tela Opções de exibição apareça, clique em Análise para obter as saídas relevantes. Salve as três tabelas produzidas (Track Statistics, Links em Estatísticas de Faixas e Pontos em Estatísticas de Faixas). A tabela Track Statistics conterá os dados de velocidade e deslocamento que podem ser posteriormente analisados para caracterizar uma nova proteína ou os efeitos de uma determinada condição experimental, por exemplo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

A purificação da minosina pode ser avaliada pela realização da redução do sulfato-poliacrilamida do de sódio (SDS-PAGE) gel-eletroforese como mostrado na Figura 2. Embora este número represente a miosina final, pós-dialisada, o SDS-PAGE pode ser realizado em alíquotas das várias etapas do procedimento de purificação para identificar quaisquer produtos perdidos para o supernante. Myosin 5a HMM tem uma banda na faixa de 120-130 kDa e a mísampara não-hísmo 2b tem uma banda na fa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Apresentado aqui é um fluxo de trabalho para a purificação e caracterização in vitro de minosina 5a e minosina não-musal 2b. Este conjunto de experimentos é útil para quantificar as propriedades mecanoquímicas de construções purificadas de miose de forma rápida e reprodutível. Embora as duas minodas aqui mostradas sejam apenas dois exemplos específicos das muitas possibilidades, as condições e técnicas podem ser aplicadas, com alguma alfaiataria, à maioria das miosinas e a muitas outras proteínas motor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não declaram conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Fang Zhang pela assistência técnica com a preparação dos reagentes utilizados para a coleta desses dados. Este trabalho foi apoiado pelos fundos do Programa de Pesquisa Intramuros DA NHLBI/NIH HL001786 para j.R.S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionVWR10128-298
27 Gauge NeedleBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
Acetic AcidThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinylated G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding AssayMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor TabletsMillipore Sigma5056489001This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coverslips: Inverted Motility AssayAzer ScientificES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5AThe diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
EthanolFischer ScientificA4094
G-actinPMID: 4254541G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
GlucoseMillipore SigmaG8270
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
Leupeptin Protease InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Unstained Standard LadderThermoFisher ScientificLC5677
MethanolMillipore SigmaMX0482
MethylcelluloseMillipore SigmaM0512
Microscope SlidesFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor BladesOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding AssayCorning353025Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted AssayCorning353003Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette TipsThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
CentrifugeThermoFisher Scientific75006590
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope CameraAndorModel: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control BoxTokai HITCustom Thermobox
Microscope Laser UnitNikonLU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench CentrifugeThermoFisher ScientificModel: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)Qsonica4418
Standard IncubatorBinderModel: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

Referências

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Bioqu micaQuest o 168miosinafilamentos de actinapurifica o de prote nasmicroscopia de fluoresc nciaensaio de motilidadeensaio de mol cula nicafilamentos bipolaresmicroscopia total de fluoresc ncia de reflex o interna

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados