Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Resumo

Apresentado aqui é um procedimento para expressar e purificar a minodã 5a seguida de uma discussão de sua caracterização, usando ensaios baseados em microscopia de fluorescência in vitro, e como esses métodos podem ser modificados para a caracterização da minosina não-musculo 2b.

Resumo

As proteínas da miosina se ligam e interagem com a actina filamentosa (F-actin) e são encontradas em organismos através da árvore filogenética. Sua estrutura e propriedades enzimáticas são adaptadas para a função particular que executam em células. Myosin 5a anda processivamente em F-actin para transportar melanomas e vesículas em células. Por outro lado, a miose não-sem-músculo 2b opera como um filamento bipolar contendo aproximadamente 30 moléculas. Move F-actin de polaridade oposta em direção ao centro do filamento, onde as moléculas de minosina trabalham assincronamente para ligar actina, transmitir um golpe de força e dissociar antes de repetir o ciclo. A minosina não-muscle 2b, juntamente com suas outras isoformas de miose não-cancerosa 2, tem papéis que incluem aderência celular, citocinese e manutenção de tensão. A mecanoquímica das miosinas pode ser estudada realizando ensaios de motilidade in vitro usando proteínas purificadas. No ensaio de filamento de actina deslizante, as miosinas são vinculadas a uma superfície de deslizamento de microscópio e translocam fluorescentemente rotulada F-actin, que pode ser rastreada. No ensaio de motilidade de molécula/conjunto único, no entanto, f-actin é vinculado a um deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas de minocina fluorescentemente rotuladas na F-actina é observado. Neste relatório, descreve-se a purificação da miose recombinante 5a de células Sf9 utilizando cromatografia de afinidade. Depois disso, descrevemos dois ensaios baseados em microscopia de fluorescência: o ensaio de filamento de actina deslizante e o ensaio de motilidade invertido. A partir desses ensaios, parâmetros como velocidades de translocação de actina e comprimentos de execução de molécula única e velocidades podem ser extraídos usando o software de análise de imagem. Essas técnicas também podem ser aplicadas para estudar o movimento de filamentos únicos das isoformas de miosina não-musada 2, aqui discutidas no contexto da miose não-musada 2b. Este fluxo de trabalho representa um protocolo e um conjunto de ferramentas quantitativas que podem ser usadas para estudar a dinâmica única de moléculas e conjuntos de miosinas não-omuscle.

Introdução

Miosinas são proteínas motoras que exercem força em filamentos de actina usando a energia derivada da hidrolise da adenosina triphosfato (ATP)¹. Myosins contêm um domínio de cabeça, pescoço e cauda. O domínio principal contém a região de ligação de actina, bem como o local de vinculação ATP e hidrólise. Os domínios do pescoço são compostos por motivos de QI, que se ligam a correntes de luz, calmodulin, ou proteínas semelhantes à calmodulina^2,3. A região da cauda possui várias funções específicas para cada classe de miosinas, incluindo, mas não se limitando à dimerização de duas cadeias ....

Protocolo

1. Purificação de proteínas

1. Lise celular e extração de proteínas
   1. Prepare um buffer de extração de 1,5x com base na Tabela 1. Filtrar e armazenar a 4 °C.
   2. Comece a descongelar as pelotas de célula no gelo. Enquanto as pelotas estão descongelando, suplemente 100 mL de Tampão de Extração com dithiothiothreitol de 1,2 mM (DTT), 5 μg/mL leupepína, 0,5 μM de flúor de fenilmetilasulfonyl (PMSF) e dois comprimidos inibidores de protease. Mantenha-se no gelo.
   3. Uma vez que a pelota tenha descongelado, adicione 1 mL do buffer de extração suplementado por 10 mL de cultura celular. Por exemplo, se as pelotas celulares foram fo....

Resultados

A purificação da minosina pode ser avaliada pela realização da redução do sulfato-poliacrilamida do de sódio (SDS-PAGE) gel-eletroforese como mostrado na Figura 2. Embora este número represente a miosina final, pós-dialisada, o SDS-PAGE pode ser realizado em alíquotas das várias etapas do procedimento de purificação para identificar quaisquer produtos perdidos para o supernante. Myosin 5a HMM tem uma banda na faixa de 120-130 kDa e a mísampara não-hísmo 2b tem uma banda na fa.......

Discussão

Apresentado aqui é um fluxo de trabalho para a purificação e caracterização in vitro de minosina 5a e minosina não-musal 2b. Este conjunto de experimentos é útil para quantificar as propriedades mecanoquímicas de construções purificadas de miose de forma rápida e reprodutível. Embora as duas minodas aqui mostradas sejam apenas dois exemplos específicos das muitas possibilidades, as condições e técnicas podem ser aplicadas, com alguma alfaiataria, à maioria das miosinas e a muitas outras proteínas motor.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309628
2 M CaCl2 Solution	VWR	10128-558
2 M MgCl2 Solution	VWR	10128-298
27 Gauge Needle	Becton Dickinson	309623
5 M NaCl Solution	KD Medical	RGE-3270
Acetic Acid	ThermoFisher Scientific	984303
Amyl Acetate	Ladd Research Industries	10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	A7699
Biotinylated G-Actin	Cytoskeleton, Inc.	AB07
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
bPEG-silane	Laysan Bio, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Catalase	Millipore Sigma	C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay	Millipore Sigma	WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay	Millipore Sigma	WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets	Millipore Sigma	5056489001	This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C.
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Coverslip Rack	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay	VWR International	48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay	Azer Scientific	ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
DYKDDDDK Peptide	GenScript	RP10586	This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Elution Column	Bio-Rad	761-1550	These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol	Fischer Scientific	A4094
G-actin		PMID: 4254541	G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose	Millipore Sigma	G8270
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-295018
HaloTag	Promega	G100A
HCl	Millipore Sigma	320331
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Large-Orifice Pipet Tips	Fischer Scientific	02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	78435
Mark12 Unstained Standard Ladder	ThermoFisher Scientific	LC5677
Methanol	Millipore Sigma	MX0482
Methylcellulose	Millipore Sigma	M0512
Microscope Slides	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silane	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase		PMID: 23148220	FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein.
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
Nitrocellulose	Ladd Research Industries	10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM.
Razor Blades	Office Depot	397492
Rhodamine-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	R415	Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientific	12658-027	This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay	Corning	353025	Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay	Corning	353003	Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips	Thomas Scientific	1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box	Tokai HIT	Custom Thermobox
Microscope Laser Unit	Nikon	LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Model: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Plasma-Cleaner	Diener electronic GmbH + Co. KG	System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)	Qsonica	4418
Standard Incubator	Binder	Model: 56
Waverly Tube Mixer	Waverly	TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements	FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin	https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate	https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software	NIS Elements (AR package)
	http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
	File:TrackMate-manual.pdf
	https://github.com/turalaksel/FASTrack
	https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md