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Résumé

Présenté ici est une procédure pour exprimer et purifier la myosine 5a suivie d’une discussion sur sa caractérisation, en utilisant à la fois des essais in vitro de microscopie à fluorescence in vitro à molécule unique et comment ces méthodes peuvent être modifiées pour la caractérisation de la myosine 2b nonmuscle.

Résumé

Les protéines de myosine se lient et interagissent avec l’actine filamenteuse (F-actine) et se trouvent dans les organismes à travers l’arbre phylogénétique. Leur structure et leurs propriétés enzymatiques sont adaptées à la fonction particulière qu’ils exécutent dans les cellules. La myosine 5a marche processivement sur la F-actine pour transporter les mélanosomes et les vésicules dans les cellules. Inversement, la myosine 2b nonmuscle fonctionne comme un filament bipolaire contenant environ 30 molécules. Il déplace la F-actine de polarité opposée vers le centre du filament, où les molécules de myosine travaillent de manière asynchrone pour lier l’actine, donner un coup de puissance et se dissocier avant de répéter le cycle. La myosine 2b non musculaire, ainsi que ses autres isoformes de myosine 2 non musculaires, ont des rôles qui incluent l’adhésion cellulaire, la cytocinèse et le maintien de la tension. La mécanochimie des myosines peut être étudiée en effectuant des tests de motilité in vitro à l’aide de protéines purifiées. Dans le test du filament d’actine planant, les myosines sont liées à une surface de couverture de microscope et transloquent de la F-actine étiquetée par fluorescence, qui peut être suivie. Dans le test de motilité d’une molécule unique / ensemble, cependant, la F-actine est liée à un couvercle et le mouvement des molécules de myosine étiquetées par fluorescence sur la F-actine est observé. Dans ce rapport, la purification de la myosine 5a recombinante à partir de cellules Sf9 par chromatographie d’affinité est décrite. Ensuite, nous décrivons deux essais basés sur la microscopie à fluorescence: le test du filament d’actine glissant et le test de motilité inversée. À partir de ces essais, des paramètres tels que les vitesses de translocation de l’actine et les longueurs et vitesses d’exécution d’une seule molécule peuvent être extraits à l’aide du logiciel d’analyse d’images. Ces techniques peuvent également être appliquées pour étudier le mouvement de filaments simples des isoformes de la myosine 2 nonmuscle, discutées ici dans le contexte de la myosine 2b nonmuscle. Ce flux de travail représente un protocole et un ensemble d’outils quantitatifs qui peuvent être utilisés pour étudier la molécule unique et la dynamique d’ensemble des myosines nonmuscles.

Introduction

Les myosines sont des protéines motrices qui exercent une force sur les filaments d’actine en utilisant l’énergie dérivée de l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP)1. Les myosines contiennent un domaine de la tête, du cou et de la queue. Le domaine principal contient la région de liaison à l’actine ainsi que le site de liaison et d’hydrolyse de l’ATP. Les domaines du cou sont composés de motifs IQ, qui se lient à des chaînes légères, à la calmoduline ou à des protéines de type calmoduline2,3. La région de la queue a plusieurs fonctions spécifiques à chaque classe de myosines, y compris, mais sans s’y limiter, la dimérisation de deux chaînes lourdes, la liaison des molécules de cargaison et la régulation de la myosine via des interactions auto-inhibitoires avec les domaines de la tête1.

Les propriétés mobiles de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre. Certaines de ces propriétés comprennent le rapport de service (la fraction du cycle mécanique de la myosine dans laquelle la myosine est liée à l’actine) et la processivité (la capacité d’un moteur à effectuer plusieurs pas sur sa voie avant le détachement)4. Les plus de 40 classes de myosines ont été déterminées sur la base d’analyses deséquences 5,6,7,8. Les myosines de classe 2 sont classées comme « conventionnelles » puisqu’elles ont été les premières à être étudiées ; toutes les autres classes de myosines sont donc classées comme « non conventionnelles ».

La myosine 5a (M5a) est une myosine de classe 5 et est un moteur processif, ce qui signifie qu’elle peut prendre plusieurs étapes le long de l’actine avant de se dissocier. Il a un rapport de service élevé, indiquant qu’il passe une grande partie de son cycle mécanique lié à l’actine9,10,11,12,13,14. Comme d’autres myosines, la chaîne lourde contient un domaine moteur N-terminal qui comprend à la fois un site d’hydrolyse de liaison à l’actine et un site d’hydrolyse de l’ATP, suivi d’une région du cou qui sert de bras de levier, avec six motifs IQ qui se lient aux chaînes légères essentielles (ELC) et à la calmoduline (CaM)15. La région de la queue contient des bobines enroulées α-hélicoïdales, qui dimérisent la molécule, suivies d’une région de queue globulaire pour la liaison de la cargaison. Sa cinétique reflète son implication dans le transport des mélanosomes dans les mélanocytes et du réticulum endoplasmique dans les neurones de Purkinje16,17. M5a est considéré comme le prototype du moteur de transport demarchandises 18.

Les myosines de classe 2, ou les myosines conventionnelles, comprennent les myosines qui alimentent la contraction des muscles squelettiques, cardiaques et lisses en plus des isoformes de myosine 2 (NM2) non musculaires, NM2a, 2b et 2c19. Les isoformes NM2 se trouvent dans le cytoplasme de toutes les cellules et ont des rôles partagés dans la cytocinèse, l’adhésion, la morphogenèse tissulaire et la migration cellulaire19,20,21,22. Cet article traite des protocoles conventionnels de myosine dans le contexte de la myosine 2b (NM2b)non musculclée 23. NM2b, par rapport à M5a, a un faible rapport de service et est enzymatiquement plus lent avec un Vmax de 0,2 s-123 par rapport au Vmax de M5a de ≈18 s-124. Notamment, les constructions NM2b tronquées avec deux têtes ne se déplacent pas facilement de manière processive sur l’actine; au contraire, chaque rencontre avec l’actine entraîne un coup de puissance suivi d’une dissociation de la molécule25.

NM2b contient deux chaînes lourdes de myosine, chacune avec un domaine de tête globulaire, un bras de levier (avec un ELC et une chaîne légère régulatrice (RLC)), et un domaine de tige / queue enroulée α-hélicoïdale, d’environ 1 100 acides aminés de long, qui dimérise ces deux chaînes lourdes. L’activité enzymatique et l’état structurel du NM2b sont régulés par phosphorylation du RLC23. Le NM2b non phosphorylé, en présence d’ATP et de forces ioniques physiologiques (environ 150 mM de sel), adopte une conformation compacte dans laquelle les deux têtes font participer à une interaction asymétrique et la queue se replie sur les têtes en deux endroits23. Dans cet état, la myosine n’interagit pas fortement avec l’actine et a une très faible activité enzymatique. Lors de la phosphorylation RLC par la kinase à chaîne légère de la myosine dépendante de la calmoduline (MLCK) ou la protéine kinase associée à rho, la molécule s’étend et s’associe à d’autres myosines à travers la région de la queue pour former des filaments bipolaires d’environ 30 molécules de myosine23. La phosphorylation susmentionnée du RLC entraîne également une augmentation de l’activité de l’ATPase activée par l’actine de NM2b d’environ quatre fois26,27,28. Cet arrangement de filament bipolaire, avec de nombreux moteurs de myosine à chaque extrémité, est optimisé pour les rôles de contraction et de maintien de la tension, où les filaments d’actine avec des polarités opposées peuvent être déplacés les uns par rapport aux autres23,29. En conséquence, il a été démontré que le NM2b agit comme un ensemble de moteurs lorsqu’il interagit avec l’actine. Le grand nombre de moteurs à l’intérieur de ce filament permet aux filaments NM2b de se déplacer de manière processive sur les filaments d’actine, ce qui rend la processivité du filament in vitro possible pour caractériser29.

Bien que des progrès aient été réalisés dans la compréhension du rôle des myosines dans la cellule, il est nécessaire de comprendre leurs caractéristiques individuelles au niveau des protéines. Pour comprendre les interactions de l’actomyosine à un niveau d’interaction protéine-protéine simple, plutôt qu’à l’intérieur d’une cellule, nous pouvons exprimer et purifier les myosines recombinantes pour une utilisation dans des études in vitro. Les résultats de telles études informent ensuite les mécanobiologistes sur les propriétés biophysiques de myosines spécifiques qui conduisent finalement des processus cellulaires complexes12,13,14,25,29. Typiquement, cela est accompli en ajoutant une étiquette d’affinité à une construction de myosine pleine longueur ou tronquée et en purifiant par chromatographie d’affinité29,30,31. De plus, la construction peut être modifiée pour inclure un fluorophore génétiquement codé ou une étiquette pour le balisage des protéines avec un fluorophore synthétique. En ajoutant une telle étiquette fluorescente, des études d’imagerie à molécule unique peuvent être effectuées pour observer la mécanique et la cinétique de la myosine.

Après la purification, la myosine peut être caractérisée de plusieurs façons. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par des méthodes colorimétriques, fournissant un aperçu de la consommation d’énergie globale et de l’affinité actine du moteur dans différentes conditions32. Pour en savoir plus sur la mécanochimie de sa motilité, d’autres expériences sont nécessaires. Cet article détaille deux méthodes basées sur la microscopie à fluorescence in vitro qui peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés mobiles d’une protéine de myosine purifiée.

La première de ces méthodes est le test du filament d’actine planant, qui peut être utilisé pour étudier quantitativement les propriétés d’ensemble des moteurs de myosine, ainsi que pour étudier qualitativement la qualité d’un lot de protéine purifiée33. Bien que cet article traite de l’utilisation de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) pour ce test, ces expériences peuvent être réalisées efficacement à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique, que l’on trouve couramment dans de nombreux laboratoires34. Dans ce test, une couche saturante de moteurs à myosine est attachée à un couvercle. Cela peut être accompli en utilisant de la nitrocellulose, des anticorps, des membranes, des surfaces dérivatisées enSiO2(telles que le triméthylchlorosilane), entre autres29,33,35,36,37,38. Les filaments d’actine marqués par fluorescence sont passés à travers la chambre de couverture, sur laquelle l’actine se lie à la myosine attachée à la surface. Lors de l’ajout d’ATP (et de kinases dans l’étude de NM2), la chambre est imagée pour observer la translocation des filaments d’actine par les myosines liées à la surface. Un logiciel de suivi peut être utilisé pour corréler la vitesse et la longueur de chaque filament d’actine planant. Un logiciel d’analyse peut également fournir une mesure du nombre de filaments d’actine mobiles et stationnaires, ce qui peut être utile pour déterminer la qualité d’une préparation de myosine donnée. La proportion de filaments bloqués peut également être intentionnellement modulée par attache de surface de l’actine à d’autres protéines et mesurée pour déterminer la dépendance à la charge de la myosine39. Étant donné que chaque filament d’actine peut être propulsé par un grand nombre de moteurs disponibles, ce test est très reproductible, la vitesse finale mesurée étant robuste aux perturbations telles que les altérations de la concentration de myosine de départ ou la présence de facteurs supplémentaires dans la solution. Cela signifie qu’il peut être facilement modifié pour étudier l’activité de la myosine dans différentes conditions, telles que la phosphorylation altérée, la température, la force ionique, la viscosité de la solution et les effets de la charge induite par les attaches de surface. Bien que des facteurs tels que les « têtes mortes » de myosine à forte liaison incapables d’hydrolyse de l’ATP puissent provoquer des filaments d’actine bloqués, de multiples méthodes existent pour atténuer ces problèmes et permettre des mesures précises. Les propriétés cinétiques de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre et, selon la myosine spécifique utilisée, la vitesse de glissement du filament d’actine dans ce test peut varier de moins de 20 nm / s (myosine9) 40,41, et jusqu’à 60 000 nm / s (myosine characée 11)42.

Le second essai inverse la géométrie du test du filament d’actine glissant12. Ici, les filaments d’actine sont attachés à la surface de couverture et le mouvement de molécules uniques de M5a ou de filaments bipolaires individuels de NM2b est visualisé. Ce test peut être utilisé pour quantifier les longueurs et les vitesses d’exécution de molécules ou de filaments de myosine simples sur l’actine. Un couvercle est recouvert d’un composé chimique qui bloque la liaison non spécifique et fonctionnalise simultanément la surface, tel que la biotine-polyéthylène glycol (biotine-PEG). L’ajout de dérivés d’avidine modifiés amorce ensuite la surface et l’actine biotinylée est passée à travers la chambre, ce qui donne une couche de F-actine liée de manière stable au fond de la chambre. Enfin, la myosine activée et étiquetée par fluorescence (généralement 1-100 nM) est acheminée à travers la chambre, qui est ensuite imagée pour observer le mouvement de la myosine sur les filaments d’actine stationnaires.

Ces modalités représentent des méthodes rapides et reproductibles qui peuvent être utilisées pour examiner la dynamique des myosines non musculaires et musculaires. Ce rapport décrit les procédures pour purifier et caractériser à la fois M5a et NM2b, représentant respectivement les myosines non conventionnelles et conventionnelles. Ceci est suivi d’une discussion de certaines des adaptations spécifiques à la myosine, qui peuvent être effectuées pour obtenir une capture réussie du mouvement dans les deux types de test.

Expression et biologie moléculaire
L’ADNc de la myosine d’intérêt doit être cloné sur un vecteur pFastBac1 modifié qui code soit pour une balise FLAG terminale C (DYKDDDDK) si elle exprime M5a-HMM, soit pour une balise FLAG N-terminale si elle exprime la molécule pleine longueur de NM2b23,43,44,45,46. Les marqueurs FLAG C-terminal sur NM2b entraînent une affinité affaiblie de la protéine pour la colonne d’affinité FLAG. En revanche, la protéine marquée N-terminally FLAG se lie généralement bien à la colonne d’affinité FLAG23. La protéine marquée N-terminale conserve l’activité enzymatique, l’activité mécanique et la régulation dépendante de la phosphorylation23.

Dans cet article, une construction de type M5a de type Mromyosine lourde (HMM) de souris tronquée avec un GFP entre l’étiquette FLAG et le terminus C de la chaîne lourde de myosine a été utilisée. Notez que contrairement à NM2b, M5a-HMM peut être étiqueté et purifié avec succès avec des balises FLAG N ou C-terminal et dans les deux cas, la construction résultante sera active. La chaîne lourde M5a a été tronquée à l’acide aminé 1090 et contient un tritrateur d’acides aminés (GCG) entre le GFP et la région de la bobine enroulée du M5a47. Aucun éditeur de liens supplémentaire n’a été ajouté entre le GFP et la balise FLAG. M5a-HMM a été co-exprimé avec la calmoduline. La construction NM2b humaine pleine longueur a été co-exprimée avec ELC et RLC. Le N-termini du RLC a été fusionné avec un GFP via un linker de cinq acides aminés (SGLRS). Directement attaché à la balise FLAG était un HaloTag. Entre le HaloTag et le N-terminus de la chaîne lourde de la myosine se trouvait un linker composé de deux acides aminés (AS).

Les deux préparations de myosine ont été purifiées à partir d’un litre de culture cellulaire Sf9 infectée par le baculovirus à une densité d’environ 2 x 106 cellules / mL. Les volumes du baculovirus pour chaque sous-unité dépendaient de la multiplicité d’infection du virus telle que déterminée par les instructions du fabricant. Dans le cas de M5a, les cellules ont été co-infectées par deux baculovirus différents, l’un pour la calmoduline et l’autre pour la chaîne lourde M5a. Dans le cas du NM2b, les cellules ont été co-infectées par trois virus différents: un pour ELC, un pour RLC et un pour nm2b chaîne lourde. Pour les laboratoires travaillant avec une diversité de myosines (ou d’autres protéines multi-complexes), cette approche est efficace car elle permet de nombreuses combinaisons de chaînes lourdes et légères et les chaînes légères couramment utilisées telles que la calmoduline peuvent être co-transfectées avec de nombreuses chaînes lourdes de myosine différentes. Tous les travaux cellulaires ont été effectués dans une armoire de biosécurité avec une technique stérile appropriée pour éviter la contamination.

Pour l’expression de M5a et NM2b, les cellules Sf9 produisant les myosines recombinantes ont été collectées 2 à 3 jours après l’infection, par centrifugation, et stockées à -80 °C. Les pastilles cellulaires ont été obtenues en centrifugant les cellules Sf9 co-infectées à 4 °C pendant 30 min à 2 800 x g. Le processus de purification des protéines est détaillé ci-dessous.

Protocole

1. Purification des protéines

  1. Lyse cellulaire et extraction de protéines
    1. Préparez un tampon d’extraction 1,5x basé sur le tableau 1. Filtrer et conserver à 4 °C.
    2. Commencez à décongeler les granulés de cellules sur la glace. Pendant que les granulés sont en train de décongeler, complétez 100 mL de tampon d’extraction avec 1,2 mM de dithiothréitol (DTT), 5 μg/mL de leupeptine, 0,5 μM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et deux comprimés inhibiteurs de protéase. Restez sur la glace.
    3. Une fois la pastille décongelée, ajouter 1 mL du tampon d’extraction complété par 10 mL de culture cellulaire. Par exemple, si les pastilles cellulaires ont été formées à partir de 500 mL de culture cellulaire, ajoutez 50 mL de tampon d’extraction complété à la pastille.
    4. Soniquez les pastilles cellulaires tout en les gardant sur la glace. Pour chaque pastille, utilisez les conditions suivantes: 5 s ON, 5 s OFF, durée de 5 min, puissance 4-5.
    5. Recueillir tout le lysate homogénéisé dans un bécher et ajouter de l’ATP (solution mère de 0,1 M; pH 7,0) de telle sorte que la concentration finale d’ATP soit de 1 mM. Remuer pendant 15 min dans une chambre froide. L’ATP dissocie la myosine active de l’actine, ce qui lui permet d’être séparée dans l’étape de centrifugation suivante. Il est donc essentiel de passer immédiatement à l’étape suivante afin de minimiser la possibilité d’épuisement et de reconnexion de l’ATP à l’actine.
    6. Centrifuger les lysates à 48 000 x g pendant 1 h à 4 °C. Pendant ce temps, commencez à laver 1 à 5 mL d’une boue à 50% de résine d’affinité anti-FLAG (pour une pastille formée de 1 L de cellules) avec 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), conformément aux instructions du fabricant. Par exemple, pour 5 mL de résine, laver 10 mL d’une boue à 50 %. Lors de la dernière étape de lavage, resuspendez la résine avec 1 à 5 mL de PBS avec un volume suffisant pour créer une boue de 50%.
    7. Après la centrifugation du lysate, mélanger le surnageant avec la boue de résine lavée et bercer doucement dans la chambre froide pendant 1 à 4 h. En attendant, faites les tampons décrits dans le tableau 1 et gardez-les sur la glace.
  2. Préparation de purification d’affinité FLAG
    1. Centrifuger la solution à l’étape 1.7 à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. La résine sera emballée au fond du tube. Sans déranger la résine, retirez le surnageant.
    2. Resuspendre la résine dans 50 mL de tampon A comme indiqué dans le tableau 1 et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Sans déranger la résine, retirez le surnageant.
    3. Resuspendre la résine dans 50 mL de tampon B comme indiqué dans le tableau 1 et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Répétez cette étape une fois de plus et ressuspendez la résine dans 20 mL de tampon B. Ensuite, mélangez soigneusement la résine et le tampon en inversant doucement le tube à la main environ 10 fois.
  3. Élution et concentration des protéines
    1. Préparez 30 mL de tampon d’élution comme décrit dans le tableau 1 et laissez-le refroidir sur la glace.
    2. Installez la colonne d’élution dans une chambre froide. Versez doucement la boue de résine dans la colonne. Lavez la colonne avec 1-2 volumes de colonne de Buffer B comme les emballages de résine sur le fond, en s’assurant que la résine ne sèche pas.
    3. Faire circuler 1 mL du tampon d’élution à travers la résine et recueillir l’écoulement dans un tube de 1,5 mL. Répétez de telle sorte que 12, 1 mL de fractions sont collectées.
    4. À ce stade, effectuez un test de Bradford brut sur les fractions pour déterminer qualitativement quelles fractions sont les plus concentrées48. Sur une rangée d’une plaque de 96 puits, pipette 60 μL 1x réactif Bradford. Au fur et à mesure que les fractions sont collectées, mélanger 20 μL de chaque fraction par puits. Une coloration bleu plus foncé indique les fractions les plus concentrées.
    5. Dans un tube de 50 mL, recueillir la protéine restante en pipetant doucement le tampon d’élution restant à travers la colonne, pour libérer toute myosine restante liée à la résine dans le flux de la colonne. Ce flux sera concentré à l’étape suivante. Assurez-vous que la résine est ensuite régénérée pour être réutilisée et stockée conformément aux instructions du fabricant.
    6. Regrouper les trois fractions les plus concentrées et concentrer davantage l’écoulement dans le tube de 50 mL ainsi que les fractions restantes de 1 mL à l’aide d’un tube de concentration de 100 000 MWCO. Charger l’échantillon regroupé sur le tube de concentration et centrifuger à 750 x g pendant 15 min à 4 °C et répéter jusqu’à ce que toutes les protéines éluées aient été concentrées dans un volume final d’environ 0,5 à 1 mL.
      REMARQUE: Cette taille de pore permet la rétention des molécules de myosine, qui ont des masses plusieurs fois supérieures à la coupure de poids moléculaire. Les chaînes légères restent étroitement liées aux domaines moteurs pendant ce temps de concentration, comme vérifié en effectuant une électrophorèse sur gel SDS-PAGE sur le produit final.
  4. Dialyse et congélation éclair
    1. Faire 2 L de tampon de dialyse, comme décrit dans le tableau 1. Chargez l’échantillon dans un sac ou une chambre de dialyse et dialysez pendant la nuit dans la chambre froide. Notez que la composition des tampons de dialyse diffère pour NM2b et M5a.
      REMARQUE: Dans le cas du NM2b, le but de cette étape de dialyse est de former des filaments de myosine dans le tampon de faible force ionique. La sédimentation de ces filaments fournit alors une étape de purification supplémentaire et permet la concentration de l’échantillon. Il y aura donc un précipité blanc visible dans la chambre de dialyse le lendemain. Ces filaments seront collectés par centrifugation et dépolymérisés à l’étape 5.1. Dans le cas de M5a-HMM, après la dialyse de nuit, la protéine sera suffisamment pure pour être utilisée dans les essais ultérieurs. D’autres étapes de purification telles que la filtration sur gel ou la chromatographie par échange ionique peuvent être effectuées, si nécessaire. Pour la récupération M5a après dialyse, passez à l’étape 5.2.
  5. Récupération de la myosine après dialyse
    1. Pour le NM2b, décharger soigneusement l’échantillon entier du sac ou de la chambre de dialyse et centrifuger à 4 °C pendant 15 min à 49 000 x g pour prélever les filaments de myosine. Jetez le surnageant et ajoutez progressivement le tampon de stockage à la pastille comme décrit dans le tableau 1 jusqu’à ce qu’il se soit dissous. Un pipetage doux de haut en bas aide à solubiliser la pastille. Normalement, cela ne nécessite pas plus de 500 μL par tube. Après s’être assuré que la pastille est complètement dissoute dans le tampon de stockage à haute résistance ionique, une étape de centrifugation supplémentaire (15 min à 49 000 x g)peut être effectuée pour éliminer les agrégats indésirables si nécessaire, car la myosine sera maintenant non plomérisée et restera dans le surnageant.
    2. Pour M5a-HMM, prélever soigneusement l’échantillon entier de la chambre de dialyse et centrifuger à 4 °C pendant 15 min à 49 000 x g en cas de présente d’agrégats indésirables. Prenez le surnageant.
  6. Détermination de la concentration et congélation éclair
    1. Pour déterminer la concentration du produit, mesurez l’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre aux longueurs d’onde 260, 280, 290 et 320 nm. Calculer la concentration en mg/mL(cmg/mL)à l’avec l’équation 1, où A280 représente l’absorption à 280 nm et A320 représente l’absorption à 320 nm. La concentration résultante en mg/mL peut être convertie en μM de molécules de myosine avec l’équation 2, où M est le poids moléculaire de la protéine entière (y compris les chaînes lourdes, les chaînes légères, les fluorophores et toutes les étiquettes).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      Molécules μM = 1000cmg/mL/M(2)
      REMARQUE: Si une dilution est nécessaire, elle doit être effectuée dans un tampon à haute résistance ionique. Le coefficient d’extinction (ε) peut être déterminé en important la séquence d’acides aminés de la protéine dans un programme tel que ExPASy. Le rendement typique pour le M5a-HMM est d’environ 0,5-1 mL de protéines 1-5 mg/mL et pour le NM2b sur toute la longueur est de 0,5-1 mL de 0,5-2 mg/mL. Le coefficient d’extinction du M5a-HMM utilisé dans cet article était de 0,671. Le coefficient d’extinction du NM2b utilisé dans cet article était de 0,611.
    2. Conservez la myosine purifiée de l’une des deux façons. Aliquote entre 10 et 20 μL dans un tube à paroi mince, tel qu’un tube de réaction en chaîne de polymérisation, et déposer le tube dans un récipient d’azote liquide pour la congélation éclair. Alternativement, pipetez directement entre 20-25 μL de myosine dans l’azote liquide et stockez les billes de protéines congelées dans des tubes cryogéniques stériles. Dans les deux cas, les tubes résultants peuvent être stockés dans -80 °C ou dans de l’azote liquide pour une utilisation future.
      REMARQUE: Étant donné que les deux tests de motilité décrits ci-dessous nécessitent de très petites quantités de protéines, le stockage dans de petites aliquotes, comme décrit, est économique.

2. Dosage du filament d’actine glissant

  1. Préparation du couvercle
    1. Faire une solution de nitrocellulose à 1% dans l’acétate d’amyle.
    2. Obtenez un plat de culture tissulaire (150 x 25 mm) et ajoutez un papier filtre circulaire (125 mm de diamètre) au fond du plat.
    3. Charger huit couvercles carrés de 22 mm d’épaisseur n° 1,5 sur une grille et laver avec environ 2 à 5 mL d’éthanol à l’épreuve des 200, suivi de 2 à 5 mL d’eau distillée (dH2O). Répétez cette étape de lavage, en terminant par de l’eau. Ensuite, séchez complètement les couvercles à l’aide d’une ligne d’air filtrée ou d’une ligne N2.
    4. Prenez un couvercle et pipetez lentement 10 μL de la solution de nitrocellulose à 1% le long d’un bord du glissement. Ensuite, en un seul mouvement lisse, étalez-le sur le reste du couvercle à l’aide du côté d’une pointe de pipette lisse de 200 μL. Placez ce couvercle sur le plat de culture tissulaire avec le côté nitrocellulose vers le haut. Répétez l’opération pour les couvercles restants et laissez-les sécher pendant la préparation des réactifs restants et utilisez des couvercles dans les 24 heures suivant le revêtement.
  2. Préparation de la chambre
    1. Essuyez une lame de microscope avec un papier à lentille optique pour nettoyer les gros débris. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face, d’environ 2 cm de long.
    2. Placez une pièce au milieu du long bord de la lame du microscope. Assurez-vous que le bord de la bande s’aligne sur le bord de la diapositive. Placez le deuxième morceau de ruban adhésif à environ 2 mm en dessous du premier morceau de ruban de manière à ce que les deux soient parallèles et alignés. Cela crée une chambre d’écoulement qui peut contenir environ 10 μL de solution (voir Figure 1).
    3. Prenez l’un des couvercles recouverts de nitrocellulose de la partie 1. Collez soigneusement le couvercle sur le ruban adhésif de manière à ce que le côté recouvert de nitrocellulose entre en contact direct avec le ruban (voir figure 1). À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface glissière-ruban adhésif pour vous assurer que le couvercle a bien adhéré à la glissière. Coupez l’excès de ruban adhésif suspendu sur le bord de la glissière avec une lame de rasoir.
  3. Préparation de l’actine
    1. Fabriquer 20 μM de F-actine en polymérisant de l’actine globulaire (G-actine) dans un tampon de polymérisation (50 mM KCl, 2 mM MgCl2,1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) à 4 °C pendant la nuit.
    2. Diluer la F-actine à 5 μM dans un tampon de motilité (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, 1 mM TNT (pH 7,4)). Étiquette avec au moins 1,2x excès molaire de rhodamine-phalloïdine. Laisser (recouvert de papier d’aluminium) pendant au moins 2 h sur de la glace. Cela peut être utilisé jusqu’à 1-2 mois, stocké sur de la glace.
  4. Réalisation du test du filament d’actine planante de myosine 5a
    REMARQUE: Dans cette section, les détails du test de glissement de la myosine 5a (HMM) sont fournis.
    1. Préparer les solutions pour la myosine 5a décrites dans le tableau 2 et les conserver sur la glace.
    2. Faire circuler 10 μL de myosine 5a (50-100 nM) dans la chambre d’écoulement et attendre 1 min.
    3. Débit dans 10 μL du BSA de 1 mg/mL dans 50 mM MB avec 1 mM TNT (tampon « faible teneur en sel »). Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement.
    4. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    5. Écoulement dans 10 μL de la solution d’actine noire (5 μM de F-actine, 1 μM de calmoduline et 1 mM d’ATP dans 50 mM MB avec 1 mM de TNT) pour éliminer les « têtes mortes », comme discuté dans la section Discussion.
      1. Pipeter la solution avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 27 G pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire la solution dans la chambre. Répétez cette étape deux fois de plus et attendez 1 min après la troisième fois. Environ 20 événements de pipetage suffisent.
      2. Pour effectuer le spin « tête morte », ajouter une quantité stœchiométrique de F-actine à la myosine en présence de 1 mM d’ATP et de 1 mM deMgCl2 à une concentration de sel de 500 mM. Puis ultracentrifugeuse à 480 000 x g pendant 15 min à 4 °C. La myosine morte sera dans la pastille.
    6. Écoulement dans 50 μL de 50 mM MB avec 1 mM TNT et 1 mM ATP pour épuiser la chambre des filaments d’actine libres.
    7. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus pour épuiser la chambre de tout ATP.
    8. Écoulement dans 10 μL de solution d’actine rhodamine (Rh-Actine) de 20 nM contenant 1 mM de TNT dans 50 mM MB et attendre 1 min pour permettre la liaison rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 5a fixée à la surface du couvercle.
    9. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM de TNT pour éliminer les filaments de Rh-Actine non liés à la surface. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    10. Débit dans 30 μL de tampon final.
    11. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nm pour visualiser Rh-Actin. Un temps d’exposition approprié est de 200 ms à une puissance laser de 1,4 mW pour une durée totale d’acquisition de 0,5-1 min.
      REMARQUE: Assurez-vous que le taux d’acquisition est mis à l’échelle de manière appropriée à la vitesse des filaments en mouvement. Une considération importante avant de collecter des données à utiliser avec des programmes de suivi est la fréquence d’images d’acquisition. Les mouvements de sous-pixels entre les images entraîneront une surestimation de la vitesse, et des mouvements de plusieurs centaines de nanomètres sont nécessaires pour obtenir des valeurs précises. Un taux d’acquisition optimal offre un glissement d’actin sur au moins une distance de pixel entre les images. Dans le cas du microscope TIRF utilisé pour l’imagerie ici, ce seuil se traduit par 130 nm; par conséquent, une myosine censée se déplacer à 1 μm/s doit être imagée à une vitesse de 5 images/s (intervalle de 0,2 s) pour atteindre 200 nm de mouvement tandis qu’une myosine censée se déplacer à 10 nm/s nécessite 0,05 image/s (intervalles de 20 s). Les données peuvent donc être sous-échantillonnées à ce stade si nécessaire (voir Discussion pour plus de détails).
  5. Réalisation du test du filament d’actine glissante de la myosine 2b non-musculaire
    REMARQUE: Dans cette section, les détails du test de glissement de la myosine 2b non musculaire sur toute la longueur sont fournis. Le protocole de dosage du filament d’actine planante de la myosine 2b non dumuscle est différent du protocole de la myosine 5a à certaines étapes. Assurez-vous que les tampons appropriés sont utilisés pour chacune de ces étapes. Par exemple, le test NM2b nécessite la fixation de la myosine au couvercle dans un tampon à haute teneur en sel, tandis que le M5a peut être fixé au glissement de couverture dans des tampons à sel élevé ou faible. De plus, le test du filament d’actine plané M5a utilise une concentration plus faible de myosine pour atténuer la fréquence de rupture des filaments d’actine lors de l’acquisition.
    1. Préparez les solutions pour nm2b comme décrit dans le tableau 2 et conservez-les sur la glace.
    2. Débit dans 10 μL de la myosine 2b non musculclée (0,2 μM) dans un tampon de motilité (MB) de 500 mM (« tampon à haute teneur en sel ») et de 1 mM de dithiothréitol (DTT) à travers la chambre d’écoulement et attendez 1 min.
      REMARQUE: Les tampons riches en sel dissocient les filaments de myosine et permettent la fixation de molécules de myosine simples à la surface, car la myosine 2b non pulmonaire peut polymériser en filaments à une concentration ionique <150 mM.
    3. Débit dans 10 μL de l’albumine sérique bovine (BSA) de 1 mg/mL dans 500 mM MB avec 1 mM de TNT (tampon « à haute teneur en sel ») tel que décrit dans le tableau 2. Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal.
    4. Laver avec 10 μL de 500 mM MB avec 1 mM TNT comme décrit dans le tableau 2. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    5. Écoulement dans 10 μL de la solution d’actine noire tel que décrit dans le tableau 2 pour éliminer les « têtes mortes », comme discuté plus loin dans la section Discussion. La solution d’actine noire contient 5 μM de F-actine non étiquetée, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mMCaCl2,1 μM CaM et 1 mM DTT dans un tampon de motilité NaCl de 50 mM pour phosphoryler la myosine 2b non musclée à la surface de la chambre.
      1. Pipeter la solution avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 27 G pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire la solution dans la chambre. Répétez cette étape deux fois de plus et attendez 1 min après la troisième fois. Environ 20 événements de pipetage suffisent.
    6. Écoulement dans 50 μL de 50 mM MB avec 1 mM TNT et 1 mM ATP pour épuiser la chambre des filaments d’actine libres.
    7. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus pour épuiser la chambre de tout ATP.
    8. S’écouler dans 10 μL de solution de Rh-Actine de 20 nM contenant 1 mM de TNT dans 50 mM MB et attendre 1 min pour permettre la fixation rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 2b non musculclée fixée à la surface du couvercle.
    9. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM de TNT pour éliminer les filaments de Rh-Actine non liés à la surface. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    10. Débit dans 30 μL de tampon final. Pour le dosage du filament d’actine planante de la myosine 2b non dumuscle, le tampon final comprend également de la calmoduline, du CaCl2et de la kinase à chaîne légère de la myosine myosine 2b pour fournir une phosphorylation complète de la myosine 2b non musclée pendant l’imagerie vidéo. 0,7% de méthylcellulose peut également être inclus dans le tampon final si les filaments d’actine ne sont que faiblement liés ou ne sont pas liés à la surface. Cette question est abordée plus en détail dans la section Discussion.
    11. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nm. Un temps d’exposition approprié est de 200 ms à une puissance laser de 1,4 mW pour une durée totale d’acquisition de 0,5 à3 min.
      REMARQUE: Assurez-vous que le taux d’acquisition est mis à l’échelle de manière appropriée à la vitesse des filaments en mouvement. Une considération importante avant de collecter des données à utiliser avec des programmes de suivi est la fréquence d’images d’acquisition. Les mouvements de sous-pixels entre les images entraîneront une surestimation de la vitesse, et des mouvements de plusieurs centaines de nanomètres sont nécessaires pour obtenir des valeurs précises. Un taux d’acquisition optimal offre un glissement d’actin sur au moins une distance de pixel entre les images. Dans le cas du microscope TIRF utilisé pour l’imagerie ici, ce seuil se traduit par 130 nm; par conséquent, une myosine censée se déplacer à 1 μm/s doit être imagée à une vitesse de 5 images/s (intervalle de 0,2 s) pour atteindre 200 nm de mouvement tandis qu’une myosine censée se déplacer à 10 nm/s nécessite 0,05 image/s (intervalles de 20 s). Les données peuvent donc être sous-échantillonnées à ce stade, si nécessaire (voir Discussion pour plus de détails).

3. Essai TIRF à molécule unique

  1. Préparation du couvercle
    1. Diviser la poudre sous-stock en aliquotes de 10 mg (dans des tubes de 1,5 mL) de méthoxy-peg-silane (mPEG) et en aliquotes de 10 mg de biotine-peg-silane (bPEG). Conserver à -20 °C dans un récipient scellé et sans humidité et utiliser dans les 6 mois.
    2. Chargez huit couvercles carrés de 22 mm d’épaisseur n° 1,5H (haute précision) sur une grille et lavez-les avec 2 à 5 mL d’éthanol résistant à 200, suivis de 2 à 5 mL d’eau distillée. Répétez cette étape de lavage, en terminant par de l’eau. Ensuite, séchez complètement les couvercles à l’aide d’une ligne d’air ou N2 et nettoyez le plasma avec de l’argon pendant 3 min.
    3. Placez les couvercles propres sur du papier filtre (90 mm) dans un plat de culture tissulaire (100 x 20 mm) et incubés dans un four à 70 °C tout en effectuant les étapes suivantes.
      REMARQUE: Le nettoyage au plasma peut être remplacé par d’autres méthodes de nettoyage chimique49.
    4. Préparer une solution d’éthanol à 80 % avec dH2O et ajuster le pH à 2,0 à l’aide de HCl. Ajouter 1 mL de cette solution à une aliquote de 10 mg de mPEG et 1 mL à une aliquote de 10 mg de bPEG. Vortex à dissoudre, ce qui ne devrait pas prendre plus de 30 s.
    5. Prendre 100 μL de la solution de bPEG et ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % (pH 2,0). Cette solution est de 1 mg/mL de bPEG. Ensuite, faites une solution des deux PÉG comme suit, en mélangeant soigneusement.
      1. 200 μL de 10 mg/mL mPEG (concentration finale : 2 mg/mL).
      2. 10 μL du bPEG de 1 mg/mL (concentration finale : 10 μg/mL).
      3. 790 μL de la solution d’éthanol à 80 % (pH 2,0).
    6. Sortez les couvercles du four. Distribuer soigneusement 100 μL de la solution de PEG sur le centre de chaque couvercle, en veillant à ce que seule la surface supérieure soit humide. Ensuite, replacez les feuillets au four et incubez pendant 20 à 30 min.
    7. Lorsque les couvercles commencent à prendre un aspect troué, avec de petits cercles apparents sur la surface, retirez-les du four.
    8. Lavez chaque couvercle avec 100% d’éthanol, séchez-le avec une ligne d’air et replacez-le dans le four. Incuber uniquement pendant le temps nécessaire à la création des chambres à l’étape 2.
  2. Préparation de la chambre
    1. Nettoyez une lame de microscope pour l’utiliser dans la fabrication de la chambre. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face, d’environ 2 cm de long.
    2. Placez une pièce au milieu du long bord de la lame du microscope. Assurez-vous que le bord de la bande s’aligne sur le bord de la diapositive. Placez le deuxième morceau de ruban adhésif à environ 2 mm en dessous du premier morceau de ruban de manière à ce que les deux soient parallèles et alignés.
    3. Prenez l’un des couvercles fonctionnalisés du four (créés en 3.1). Collez soigneusement le couvercle sur le ruban adhésif de manière à ce que le côté recouvert de PEG soit face vers le bas et en contact direct avec le ruban adhésif, comme illustré à la figure 1. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface glissière-ruban adhésif pour vous assurer que le couvercle a bien adhéré à la glissière.
    4. Coupez l’excès de ruban adhésif suspendu au-dessus de la glissière avec une lame de rasoir. Ces chambres peuvent être utilisées immédiatement ou placées par paires dans un tube de 50 mL et stockées dans un congélateur à -80 °C pour une utilisation future. Il est important de stocker immédiatement ou la surface se dégradera.
  3. Réalisation du test de microscopie TIRF à la myosine 5a
    1. Préparer les solutions pour le test de motilité inversée de la myosine 5a décrit dans le tableau 3 et les conserver sur la glace.
    2. Laver la chambre avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT.
    3. Débit dans 10 μL du BSA de 1 mg/mL dans 50 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal.
    4. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    5. Débit dans 10 μL de la solution NeutrAvidin dans 50 mM MB avec 1 mM TNT et attendre 1 min.
    6. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    7. Débit dans 10 μL d’actine rhodamine biotinylée (bRh-Actine) contenant 1 mM de TNT dans 50 mM MB et attendre 1 min. Pour cette étape, utilisez une pointe de pipette à grand alésage et évitez de pipeter de haut en bas pour minimiser le cisaillement des filaments d’actine fluorescents afin de vous assurer que de longs filaments d’actine peuvent être attachés à la surface (20-30 μm ou plus). Une alternative efficace consiste à couper le cône d’une pointe de pipette standard (avec une ouverture de ≈1-1,5 mm).
    8. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    9. Débiter dans 30 μL de tampon final avec 10 nM de myosine 5a ajoutée, puis charger immédiatement sur le microscope TIRF et enregistrer après avoir trouvé la mise au point optimale pour la modalité d’imagerie TIRF. Les temps d’exposition compris entre 100 et 200 ms sont appropriés à une puissance laser de 1,4 mW pour l’actine et la myosine étiquetée GFP. Un temps d’acquisition approprié pour l’analyse de la vitesse est de 3 min.
  4. Réalisation du test de microscopie TIRF à la myosine 2b non dumuscle
    REMARQUE: Dans cette section, les détails du dosage de la myosine 2b TIRF non du champignon utilisant des filaments polymérisés et phosphorylés sont fournis. Un protocole détaillé (sections 4.1-4.3) pour la phosphorylation et la polymérisation de la myosine 2b nonmuscle dans un tube est inclus.
    1. Pour phosphoryler le NM2b purifié, faites un mélange de kinases 10x avec les conditions suivantes: 2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK et 0,1 mM ATP. Cela peut être porté au volume avec 500 mM MB avec 10 mM DTT. Ajouter le mélange de kinases 10x à la myosine à un rapport volumétrique de 1:10 et laisser incuber pendant 20-30 min à température ambiante. Typiquement, la concentration de myosine pour cette étape est de 1 μM.
    2. Pour polymériser la myosine phosphorylée en filaments, abaissez la concentration en sel du NM2b à 150 mM de NaCl. Pour ce faire, faites un tampon de motilité 1x (1x MB) sans sel en diluant le 4x MB quatre fois dans dH2O. Ce 1x MB peut être utilisé pour abaisser la concentration de sel parce que le NM2b a été congelé dans un tampon de sel de 500 mM.
    3. Pour chaque 3 μL de NM2b de base, ajouter 7 μL de 1x MB pour abaisser la concentration de sel à 150 mM de NaCl et incuber sur de la glace pendant 20 à 30 min pour former des filaments NM2b.
      NOTE: L’ordre des sections 4.1 à 4.3 n’est pas crucial tant que le NM2b est phosphorylé et que la concentration finale en sel est de 150 mM. L’incubation de l’ordre de 30 min-1 h laisse suffisamment de temps pour une phosphorylation et une polymérisation complètes.
    4. Préparer les solutions pour le test de motilité inversée de la myosine 2b non dumuscle décrite au tableau 3 et les conserver sur la glace.
    5. Lavez la chambre avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT.
    6. Débit dans 10 μL du BSA de 1 mg/mL dans 150 mM MB avec 1 mM TNT Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal.
    7. Laver avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    8. Débit dans 10 μL de la solution NeutrAvidin dans 150 mM MB avec 1 mM TNT et attendre 1 min.
    9. Laver avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    10. Débiter dans 10 μL de bRh-Actin et attendre 1 min. Pour cette étape, utilisez une pointe de pipette à grand alésage et évitez de pipeter de haut en bas pour minimiser le cisaillement des filaments d’actine fluorescents, afin de vous assurer que de longs filaments d’actine peuvent être attachés à la surface (20-30 μm ou plus). Une alternative efficace consiste à couper le cône d’une pointe de pipette standard.
    11. Laver avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    12. Débiter dans 10 μL de la solution de myosine 2b non muscululique (environ 30 nM) et attendre 1 min.
    13. Laver avec 10 μL de 150 Mo avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    14. Débitez 30 μL de tampon final, puis chargez immédiatement sur le microscope TIRF et enregistrez après avoir trouvé la mise au point optimale pour la modalité d’imagerie TIRF. Les temps d’exposition compris entre 100 et 200 ms sont appropriés à une puissance laser de 1,4 mW pour l’actine et la myosine étiquetée GFP. Un temps d’acquisition approprié pour l’analyse de la vitesse est de 3 min.

4. Analyse d’images

  1. Analyse d’image pour le dosage du filament d’actine glissant
    REMARQUE: Les images peuvent être analysées à l’aide du logiciel et des manuels liés dans la liste des matériaux. Il est important de noter que le programme décrit ici nécessite des piles TIFF pour l’analyse. Le processus d’analyse du test du filament d’actine planant est le suivant50.
    1. Téléchargez des piles de films bruts dans une structure de dossiers spécifiée et entrez le répertoire le plus haut des dossiers de films dans le programme.
      REMARQUE: Le programme analyse les fichiers dans ce répertoire et sous-répertoires, en traitant les répertoires de niveau inférieur comme des répliques. Des statistiques moyennes pour chaque groupe de répétitions seront produites. Dans ce cas, un seul film a été utilisé pour chaque myosine. Lors de la caractérisation d’une nouvelle myosine ou de l’étude d’une nouvelle condition expérimentale, il est recommandé d’analyser des films à partir de trois champs de vision (FOV) par chambre pour un total de trois chambres et de répéter ce flux de travail pour trois préparations de la myosine étudiée.
    2. Utilisez le script « stack2tifs » en conjonction avec la fréquence d’images saisie par l’utilisateur pour convertir chaque pile TIFF en un dossier contenant une série de fichiers TIFF individuels et un fichier de métadonnées.txt correspondant contenant l’heure de début de chaque image. Pour les données qui ne sont pas au format de pile TIFF, une conversion doit d’abord être appliquée à l’aide d’un logiciel tel que ceux répertoriés dans la table des matériaux.
      REMARQUE : Ce script est la partie du progiciel. Les informations du script peuvent être trouvées ici: « https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs »
    3. Utilisez le paramètre -px, qui est la taille du pixel (en nm) lors de l’acquisition. Dans ce cas, la taille des pixels est de 130 nm. Utilisez les paramètres -xmax et -ymax pour mettre à l’échelle les axes des sorties du nuage de points. Ceux-ci correspondent à la plus longue longueur de filament tracée et à la vitesse maximale tracée (en nm/s).
      REMARQUE : Il s’agit de valeurs estimées qui peuvent être définies sur des valeurs plus élevées que prévu pour s’assurer que les données sont contenues dans le graphique. Après l’analyse, les données brutes peuvent également être exportées pour être utilisées dans d’autres logiciels statistiques ou graphiques pour la visualisation et l’analyse.
    4. Utilisez le paramètre -minv, qui est un paramètre de coupure de vitesse minimale, pour définir les filaments qui ne bougent pas et qui peuvent donc être exclus de l’analyse. Pour une myosine lente telle que NM2b, ce paramètre doit être faible (dans cet exemple, 5 nm/s) pour éviter de couper les mouvements de glissement réels. Pour une myosine rapide telle que M5a, ce paramètre peut être plus élevé (dans cet exemple, 100 nm/s) pour appliquer un filtre plus strict, tout en conservant la distribution réelle de la vitesse de glisse.
    5. Utilisez le paramètre de coupure -pt pour identifier les mouvements fluides. Pour chaque fenêtre d’échantillonnage, une valeur équivalente à 100 x l’écart type de vitesse/vitesse moyenne est calculée. Les pistes avec des valeurs plus élevées que la coupure, ont des vitesses plus variables et sont exclues d’une analyse plus approfondie. Dans cet exemple, une valeur seuil de 33 a été utilisée. Les pistes avec des valeurs plus élevées ont des vitesses plus variables et sont exclues d’une analyse plus approfondie.
    6. Utilisez -maxd pour définir une distance de liaison maximale autorisée entre les images. Il s’agit d’une distance d’image à image calculée déplacée par le centroïde du filament en unités de nm. Il peut être utile pour exclure les mouvements sporadiques ou la liaison incorrecte entre les filaments. Dans les exemples ici, le paramètre a été laissé sur la valeur par défaut de 2 000 nm.
  2. Analyse d’images pour le test de microscopie TIRF
    REMARQUE: Le processus d’analyse du test TIRF à molécule unique sur le logiciel d’imagerie spécifiquement répertorié dans le Tableau des matériaux est le suivant29.
    1. Cliquez et faites glisser la vidéo de microscopie enregistrée vers l’espace de travail du logiciel pour l’ouvrir51. Ensuite, divisez les canaux d’acquisition. Cliquez sur Image > Color > Split Channels.
      REMARQUE: En cas de dérive d’étage appréciable pendant l’acquisition, les images doivent être stabilisées pour corriger la dérive instrumentale sur le plan d’imagerie. Dans ce cas, aucune compensation pour la dérive de l’axe Z n’a été utilisée car le microscope utilisé pour obtenir ces données stabilise bien le foyer Z. Pour stabiliser l’image sur le programme d’analyse d’image, installez le plug-in stabilisateur approprié qui est lié à la Liste des matériaux. Le stabilisateur d’image prend des positions fixes pour les objets de l’image et utilise une moyenne mobile des images précédentes comme référence. La procédure recommandée est donc de commencer par le canal contenant des images d’actine étiquetée, car il est dans une position fixe.
    2. Cliquez sur Plugins, puis trouvez Stabilisateur d’image; assurez-vous que l’option Traduction est sélectionnée et conservez les paramètres par défaut. Cochez la case en regard de Log Transformation Coefficients. L’application de cette étape journal permet d’appliquer les paramètres de décalage calculés à l’autre canal à l’étape suivante. Laissez le processus se terminer.
    3. Ensuite, ouvrez le canal avec la myosine étiquetée et appliquez la stabilisation en cliquant sur Plugins > Image Stabilizer Log Applier. Si les images d’actine ne peuvent pas être acquises au cours de la même acquisition en raison de la nécessité d’une imagerie à plus haut débit dans un seul canal, la dérive stabilise la pile d’images en sélectionnant une région qui contient des objets statiques tels qu’un marqueur fiduciaire biotinylé ou des fluorophores liés non spécifiquement à la surface de la biotine-PEG. Cette région peut être recadrée à partir de la pile d’origine et stabilisée, suivie de l’application des valeurs de décalage résultantes à la pile d’origine.
      NOTE: En pratique, la dérive observée dans les expériences de motilité sera négligeable par rapport au mouvement des myosines qui se déplacent à plusieurs centaines de nm / s, mais pour les myosines les plus lentes, cela devient une considération importante.
    4. Ensuite, ouvrez TrackMate, cliquez sur Plugins; puis, dans son menu déroulant, cliquez sur Tracking et enfin sur TrackMate. À ce stade, l’analyse de l’image est sujette à une optimisation basée sur les paramètres du fluorophore et des conditions de dosage. Cependant, les paramètres de départ idéaux sont les suivants.
      1. Paramètres d’étalonnage : conservez toutes les valeurs par défaut.
      2. Détecteur: Détecteur LoG.
      3. Diamètre estimé de la tache: 0,5-1,0 micron.
      4. Seuil: 25-200. (Cela peut être déterminé en cliquant sur Aperçu après avoir choisi un nombre pour voir si les taches détectées correspondent au film et en les ajustant de manière appropriée.)
      5. Seuil initial : non défini.
      6. Affichage : HyperStack Displayer.
      7. Définir des filtres sur les spots: pas défini.
      8. Tracker: Tracker LAP simple.
        REMARQUE: Ceux-ci dépendent de la fréquence d’images et de la vitesse de la myosine et doivent être suffisamment grands pour connecter les positions suivantes tout en excluant les connexions indésirables entre différentes particules.
      9. Distance maximale de liaison: 1,0 micron.
      10. Distance maximale de fermeture de l’espace: 1,0 micron.
      11. Espace maximal de fermeture de l’espace de trame: 1.
      12. Définissez des filtres sur les pistes : Déplacement des pistes (>0,39- pour inclure uniquement les taches se déplaçant de plus de 3 pixels), Taches dans les pistes (>3- pour inclure uniquement les pistes avec au moins 3 points). D’autres filtres tels que la vitesse minimale peuvent être introduits pour exclure les taches qui calent pendant de longues périodes. Les résultats du filtrage doivent être vérifiés par inspection visuelle des pistes pour s’assurer que les traces fallacieuses (c.-à-d. le mouvement de la myosine en arrière-plan qui n’est pas le long d’une piste d’actine) sont enlevées tout en conservant les traces associées à l’actine.
    5. Une fois que l’écran Options d’affichage apparaît, cliquez sur Analyse pour les résultats pertinents. Enregistrez les trois tables produites (Statistiques de piste, Liens dans Statistiques de piste et Spots dans Statistiques de piste). Le tableau Track Statistics contiendra les données de vitesse et de déplacement qui pourront ensuite être analysées pour caractériser une nouvelle protéine ou les effets d’une certaine condition expérimentale, par exemple.

Résultats

La purification de la myosine peut être évaluée en effectuant une électrophorèse sur gel-polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) réductrice comme le montre la figure 2. Bien que cette figure représente la myosine finale post-dialysée, SDS-PAGE peut être effectuée sur des aliquotes des différentes étapes de la procédure de purification pour identifier les produits perdus par le surnageant. Myosin 5a HMM a une bande dans la gamme 120-130 kDa et la myosine 2b non mus...

Discussion

Présenté ici est un flux de travail pour la purification et la caractérisation in vitro de la myosine 5a et de la myosine 2b nonmuscle. Cet ensemble d’expériences est utile pour quantifier les propriétés mécanochimiques des constructions de myosine purifiée de manière rapide et reproductible. Bien que les deux myosines présentées ici ne soient que deux exemples spécifiques parmi les nombreuses possibilités, les conditions et les techniques peuvent être appliquées, avec une certaine adaptation, à la plup...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Fang Zhang pour son assistance technique dans la préparation des réactifs utilisés pour la collecte de ces données. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros NHLBI/NIH HL001786 à J.R.S.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionVWR10128-298
27 Gauge NeedleBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
Acetic AcidThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinylated G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding AssayMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor TabletsMillipore Sigma5056489001This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coverslips: Inverted Motility AssayAzer ScientificES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5AThe diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
EthanolFischer ScientificA4094
G-actinPMID: 4254541G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
GlucoseMillipore SigmaG8270
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
Leupeptin Protease InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Unstained Standard LadderThermoFisher ScientificLC5677
MethanolMillipore SigmaMX0482
MethylcelluloseMillipore SigmaM0512
Microscope SlidesFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor BladesOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding AssayCorning353025Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted AssayCorning353003Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette TipsThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
CentrifugeThermoFisher Scientific75006590
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope CameraAndorModel: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control BoxTokai HITCustom Thermobox
Microscope Laser UnitNikonLU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench CentrifugeThermoFisher ScientificModel: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)Qsonica4418
Standard IncubatorBinderModel: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

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