Esferas de celulose bacteriana que encapsulam materiais sólidos

Resumo

Este protocolo apresenta um método fácil e barato de formar esferas de celulose bacteriana (BC). Este biomatélado pode funcionar como um meio de encapsulamento para materiais sólidos, incluindo biochar, esferas de polímeros e resíduos de minas.

Resumo

As esferas de celulose bacteriana (BC) têm sido cada vez mais pesquisadas desde a popularização do BC como um novo material. Este protocolo apresenta um método acessível e simples para a produção da esfera BC. Além de produzir essas esferas, também foi identificado um método de encapsulamento para partículas sólidas. Para produzir esferas BC, água, chá preto, açúcar, vinagre e cultura bacteriana são combinados em um frasco perplexo e os conteúdos são agitados. Depois de determinar as condições de cultura adequadas para a formação da esfera bc, sua capacidade de encapsular partículas sólidas foi testada usando biochar, contas de polímero e resíduos de minas. As esferas foram caracterizadas por meio do software ImageJ e da análise gravimétrica térmica (TGA). Os resultados indicam que esferas com diâmetros de 7,5 mm podem ser feitas em 7 dias. Adicionar várias partículas aumenta a faixa de tamanho médio das cápsulas BC. As esferas encapsularam 10 a 20% de sua massa seca. Este método mostra a produção e o encapsulamento da esfera de baixo custo que é possível com materiais facilmente obtidos. As esferas bc podem ser usadas no futuro como um auxílio de remoção de contaminantes, revestimento de fertilizantes de liberação controlada ou alteração do solo.

Introdução

A celulose bacteriana (BC) tem sido notada por seu potencial uso da indústria devido à sua força mecânica, alta pureza e cristalidade, habilidades de retenção de água e estrutura de fibras intrincada^1,2,3,4. Essas características fazem do BC um biomamaterial favorável para uma variedade de aplicações, incluindo usos biomédicos, de processamento de alimentos e de remediação ambiental¹. A formação de um filme bc pode ser feita com culturas de organismo único ou culturas mistas como as usadas para kombucha⁵, uma bebida de chá fermentada. A fabricação de kombucha conta com uma "Cultura Simbiótica de Bactérias e Leveduras", comumente conhecida como SCOBY. Usando essa cultura simbiótica de organismos, uma técnica semelhante é empregada para criar esferas bc. Este bioma material pode ser empregado para ajudar a isolar contaminantes ambientais e ancorar alterações agrícolas como o biochar para alcançar uma produção agrícola mais eficiente.

A literatura anterior tem discutido como as características do BC produzidas em condições agitadas se comparam ao BC produzido em uma cultura estacionária. Uma cultura estacionária resulta em um filme que se forma na interface líquido-ar, enquanto uma cultura abalada resulta em partículas, fios e esferas bc variadas suspensas dentro do líquido⁶. Muitos estudos têm referenciado a alegação de que a produção comercial do BC é mais viável nas condições dinâmicas^6,7, fornecendo fundamentação para a aplicação do método deste artigo. Além disso, várias investigações sobre a estrutura e propriedades das esferas bc foram conduzidas. Toyosaki et al.⁶ compararam frascos de Erlenmeyer perplexos e de paredes lisas em sua agitada produção bc. Um estudo realizado por Hu e Catchmark⁴ determinou condições para esferas bc que foram utilizadas como diretrizes para o atual processo de produção da esfera bc, e seus resultados indicam que o tamanho da esfera não continua a aumentar após 60 horas. Uma revisão da produção bc por Mohammad et al.¹ indica que sacudir a cultura bc garante até mesmo o fornecimento e distribuição de oxigênio, o que é necessário para o crescimento bem sucedido do BC. Holland et al.⁸ estudaram a cristalina e estrutura química de BC usando difração de raios-X e espectroscopia infravermelha de fourier. Presume-se que as cápsulas BC apresentarão características semelhantes e futuras pesquisas investigarão propriedades estruturais. Estudos também exploraram os efeitos benéficos do uso do BC para produzir biocompositos melhorados. Usando a epóxi-resina como base, pesquisadores mostraram que a adição de BC melhora características materiais como vida útil da fadiga, dureza da fratura e resistência à^traçãoe flexural 9^,10. Como mostram pesquisas passadas e atuais, muitos estão interessados em comercializar o uso do BC.

Muitos pesquisadores têm investigado a celulose bacteriana em sistemas de liberação controlada, e o método descrito aqui gera cápsulas que poderiam ser utilizadas como sistemas de liberação controlada. Grande parte desta pesquisa se concentra na liberação controlada no campo biomédico, bem como em alguma exploração na administração de fertilizantes de liberação controlada (CRF). Com base no sucesso da liberação controlada do BC de amoxicilina¹¹, lidocaína¹²e ibuprofeno¹³, BC pode apresentar características de entrega semelhantes com outras substâncias, como um fertilizante pelletizado. Uma visão geral dos CRF's de Shaviv e Mikkelsen¹⁴ reconhece que os CRF's são mais eficientes, economizam mão-de-obra e geralmente causam menos degradação ambiental do que a aplicação convencional de fertilizantes. A celulose bacteriana pode funcionar como um material de encapsulamento favorável para CRF's. Os fertilizantes podem lixiviar as membranas BC ou descarregar conforme a biodegradação^{BC 15,16}. A alta capacidade de inchaço da água do BC também pode atuar como uma alteração benéfica do solo^17,18,19 porque tanto os nutrientes de fertilizante quanto a umidade podem ser liberados no solo através da aplicação de esferas bc. Com essas características, um CRF formado pelo encapsulamento da esfera bc pode ter uma vantagem sobre outros materiais de revestimento de fertilizantes que poderiam ter efeitos negativos durante suas etapas de produção e descarte. Adaptar o BC em um revestimento de fertilizantes pode melhorar ainda mais as tecnologias de CRF. Ao reduzir a taxa de liberação de fertilizantes, as culturas terão tempo suficiente para captar o fertilizante e evitar o excesso de escoamento em corpos d'água, reduzindo assim a eutrofização e zonas nãoxigenadas. Fertilizantes similares de liberação lenta foram preparados e pilotados usando revestimentos de polímeros²⁰.

Ao contrário dos protocolos descritos em pesquisas anteriores, este se concentra na produção de esferas uniformes e coesas, em vez de alto rendimento de celulose. Além disso, o encapsulamento bc de outros sólidos tem sido estudado com filmes de celulose, mas não esferas²¹. Ao expandir a pesquisa sobre esferas de celulose bacteriana, podem ser tomadas novas etapas para produzir BC comercialmente, o que é benéfico devido às características ambientalmente seguras do BC. Este método de fabricação de esferas BC utiliza ingredientes culinários baratos e prontamente disponíveis. Após a montagem inicial, as esferas bc começam a se formar dentro de 2 dias sem interferência. Produzir esferas BC através dessa estratégia requer pouco espaço e tem um subproduto comestível, o chá fermentado 'kombucha'. As técnicas de encapsulamento mencionadas em outros estudos incluem revestimentos formados através da técnica de inversão de fase^22,23,formação matricial^24,secagem de pulverização²⁵e encapsulamento direto durante a^{síntese 26}. O método de encapsulamento direto descrito neste manuscrito é útil para aqueles que desejam um processo fácil e barato que utilize materiais prontamente disponíveis.

Através desta pesquisa, foi criado um protocolo bem sucedido para produção e encapsulamento da esfera bc. As esferas bc podem encapsular partículas sólidas de biochar, rejeitos de minas e microesferas de poliestireno dentro de suas estruturas individuais. Embora ainda não seja amplamente utilizado na indústria, o BC é um material prático, de forma sustentável e natural que poderia ser usado para aplicações futuras.

Protocolo

1. Criação e manutenção da cultura de início de celulose bacteriana

1. Obtenha uma cultura inicial de celulose bacteriana, aproximadamente 50 g, na forma de um SCOBY. Pode ser adquirido comercialmente (por exemplo, de Culturas para a Saúde). Coloque o SCOBY em um béquer 1 L, coberto com uma toalha de papel.
2. Ferva 700 mL de água deionizada, transfira-a para um vaso separado daquele que contém o SCOBY e adicione 85 g de sacarose.
3. Uma vez que a sacarose tenha dissolvido, adicione 2 sacos de chá preto (4,87 g). Torço o chá por 1h, depois retire cuidadosamente os sacos de chá usando uma haste de mexida.
4. Adicione 200 mL de vinagre branco destilado ao chá. Deixe a mistura esfriar a 25 °C. Uma vez resfriado, adicione 700 mL do chá de temperatura ambiente ao béquer contendo o SCOBY.
   ATENÇÃO: Adicionar o chá ácido enquanto estiver muito quente pode prejudicar os organismos do SCOBY.
5. Cubra o béquer com uma toalha de papel e fixe-o com uma faixa elástica, e coloque o béquer em uma área de armazenamento que mantenha uma temperatura de 25 °C. Este navio é comumente referido como cultura de estoque ou um hotel.
6. Para manter o SCOBY saudável, a manutenção é necessária cerca de 2 vezes por mês.
   1. Usando as mãos enluvadas para segurar os tapetes SCOBY, drene o líquido do hotel em um béquer separado. No recipiente com o líquido, adicione chá ácido suficiente para um total de 700 mL de solução.
   2. Dissolva 65 g de sacarose no recipiente com o chá ácido. Enquanto espera a sacarose se dissolver, enxágue cuidadosamente os tapetes SCOBY em água DI.
   3. Uma vez que a sacarose esteja totalmente dissolvida, o líquido pode ser adicionado ao béquer contendo os tapetes SCOBY enxaguados. Cubra o béquer e devolva-o para a área de incubação.

2. Produção de esferas de celulose bacteriana

NOTA: Tenha cuidado ao trabalhar com água fervente. Certifique-se de que os vidros podem suportar as temperaturas da água fervente, está livre de defeitos e é o tamanho apropriado. Um esquema descrevendo a produção de esferas bc é dado na Figura 1.

1. Ferva 350 mL de água deionizada usando uma chaleira de chá. Transfira a água quente para um béquer de 500 mL. Dissolva 42,5 g de sacarose granulada na água quente usando uma haste de mexida.
2. Quando a sacarose estiver totalmente dissolvida, 1 saco íngreme de chá preto (2,54 g) no frasco contendo a sacarose e a água por 1h. Depois disso, retire o saco de chá com uma vara de mexida, tomando cuidado para evitar quebrar o saco de chá e, em seguida, descarte-o no lixo.
3. Adicione 100 mL de vinagre branco destilado ao béquer e, em seguida, mexa completamente a mistura. Transfira 80 mL da mistura de chá ácido para um frasco de 250 mL perplexo. Deixe a mistura de chá esfriar até a temperatura ambiente, 20 - 25 °C.
   NOTA: Neste ponto, a mistura pode ser deixada para esfriar durante a noite ou até estar preparada para o próximo passo.
4. Uma vez que a temperatura líquida esteja em temperatura ambiente (20 - 25 °C), adicione 20 mL de líquido de cultura de inicialização microbiana ao frasco perplexo. Este líquido pode ser obtido de um hotel SCOBY. Cubra o frasco com parafilm.
5. Coloque o frasco perplexo em uma mesa de agitação orbital e coloque a velocidade em 125 rotações por minuto (rpm). Deixe a mistura tremer por 3 dias em uma sala ou incubadora com uma temperatura de 20 a 25 °C para produzir esferas BC.
   NOTA: Se formas irregulares se formarem no conteúdo do frasco ou se os aglomerados de celulose grudam nas paredes do frasco, devem ser removidos para evitar a formação de massas B mais irregulares. Use pinças para remover massas a.C.indesejadas, incluindo cordas finas, anéis, formas tubulares e outras formas claramente não esféricas.
6. Uma vez que as esferas tenham se formado, despeje-as suavemente do frasco e analise, descarte ou use-as de uma maneira não descrita neste papel.

3. Utilização de esferas de celulose bacteriana para encapsular partículas ou contaminantes

1. Siga os passos 2.1-2.5 acima.
2. Depois de tremer por 3 dias, adicione cerca de 0,01 g de material particulado finamente moído ao frasco perplexo. Os sólidos apropriados incluem biochar (260 ± 140 μm), resíduos de minas (350 ± 140 μm) e microesferas de poliestireno (3 μm). Os dados desses materiais estão descritos na seção Resultados Representativos. Consulte a tabela anexada de materiais para obter mais descrições de biochar, resíduos de minas e microesferas.
3. Cubra o frasco novamente com o parafilme e coloque-o de volta em um agitador orbital, usando a mesma velocidade e temperatura ambiente (20 - 25 °C) por mais 3 dias. Remova as partículas encapsuladas bc para análise, eliminação ou outros usos.

Figura 1. Fabricação da esfera de celulose bacteriana e encapsulamento de partículas sólidas. O passo 1 envolve a combinação da cultura do estoque bacteriano com a mídia de chá preto, açúcar e vinagre em um frasco perplexo. Os discos na cultura das ações representam tapetes BC. Em seguida, o frasco perplexo é colocado em uma mesa de agitação orbital por 3 dias. O passo do meio mostra sólidos sendo adicionados ao frasco uma vez que as esferas bc se formaram. O frasco está abalado por mais 3 dias. Na etapa final, as esferas bc continuaram aumentando de tamanho e encapsulando as partículas sólidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

As esferas bc têm a taxa de crescimento mais rápida durante as primeiras 48 horas de cultura(Figura 2). A Figura 2 também mostra como as esferas tendem a atingir um tamanho médio máximo e, em seguida, permanecem constantes. Neste experimento, as esferas atingiram um diâmetro médio de 7,5 ± 0,2 mm. Embora as esferas do BC nunca se deteriorem completamente dentro do período de crescimento de 10 dias, elas começaram a formar tendões que se estendem para ...

Discussão

Este protocolo descreve métodos de produção e encapsulamento da esfera BC que são fáceis de conduzir e econômicos. Através de vários ajustes no protocolo original, foi identificado um processo adequado. Passos críticos devem ser seguidos para garantir esferas viáveis. Todos os ingredientes envolvidos na formação do BC desempenham um papel fundamental na saúde e durabilidade das esferas. A sacarose alimenta organismos, o chá fornece nitrogênio, e o vinagre reduz o pH para condições ideais para evitar cont...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL graduated cylinder
1000 mL beaker
25 mL graduated cylinder
250 mL Erlenmeyer baffled flask	Chemglass	CLS-2040-02
500 mL beaker
Balance
Biochar			Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C
Black tea
Deionized water
Distilled white vinegar
Elastic band
Microbial starter culture	Cultures for Health
Mine waste			Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction.
Mortar and pestle
Orbital shaker			Used various brands
Paper towel
Polystyrene microbeads	Polybead	17138	3 micron diameter
Stir rod
Sucrose
Tea kettle
TGA	TA Instruments	TA Q500	400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2
Thermometer
XRF Analyzer	ThermoFisher Scientific	10131166