Sfere di cellulosa batterica che incapsulano materiali solidi

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo semplice ed economico per formare sfere di cellulosa batterica (BC). Questo biomateriale può funzionare come mezzo di incapsulamento per materiali solidi, tra cui biochar, sfere polimeriche e rifiuti di miniera.

Abstract

Le sfere di cellulosa batterica (BC) sono state sempre più ricercate sin dalla popolarità di BC come nuovo materiale. Questo protocollo presenta un metodo semplice e conveniente per la produzione di sfere BC. Oltre a produrre queste sfere, è stato identificato anche un metodo di incapsulamento per le particelle solide. Per produrre sfere BC, acqua, tè nero, zucchero, aceto e coltura batterica sono combinati in un pallone sconcertato e il contenuto è agitato. Dopo aver determinato le condizioni di coltura adeguate per la formazione della sfera BC, la loro capacità di incapsulare particelle solide è stata testata utilizzando biochar, perline polimeriche e rifiuti di miniera. Le sfere sono state caratterizzate utilizzando il software ImageJ e l'analisi gravimetrica termica (TGA). I risultati indicano che le sfere con diametri di 7,5 mm possono essere realizzate in 7 giorni. L'aggiunta di varie particelle aumenta la gamma di dimensioni medie delle capsule BC. Le sfere incapsulano il 10-20% della loro massa secca. Questo metodo mostra la produzione e l'incapsulamento di sfere a basso costo che è possibile con materiali facilmente ottenibili. Le sfere BC possono essere utilizzate in futuro come ausilio per la rimozione dei contaminanti, rivestimento di fertilizzanti a rilascio controllato o modifica del suolo.

Introduzione

La cellulosa batterica (BC) è stata nota per il suo potenziale uso industriale grazie alla sua resistenza meccanica, all'elevata purezza e cristallinità, alle capacità di ritenzione idrica e all'intricata struttura in^{fibra 1,2,3,4}. Queste caratteristiche rendono BC un biomateriale favorevole per una varietà di applicazioni, tra cui usi biomedici, di lavorazione degli alimenti e di bonifica ambientale¹. La formazione di un film BC può essere fatta con colture di singoli organismi o colture miste come quelle utilizzate per kombucha^5,una bevanda al tè fermentata. Brewing kombucha si basa su una "Cultura simbiotica di batteri e lieviti", comunemente nota come SCOBY. Usando questa cultura simbiotica degli organismi, una tecnica simile viene utilizzata per creare sfere BC. Questo biomateriale può essere utilizzato per aiutare a isolare i contaminanti ambientali e ancorare emendamenti agricoli come biochar per ottenere una produzione agricola più efficiente.

La letteratura precedente ha discusso di come le caratteristiche di BC prodotte in condizioni agitate si confrontano con bc prodotto in una cultura stazionaria. Una coltura stazionaria si traduce in un film che si forma all'interfaccia liquido-aria, mentre una coltura scossa si traduce in particelle, filamenti e sfere BC variabili sospesi all'interno del^{liquido 6}. Molti studi hanno fatto riferimento all'affermazione che la produzione commerciale di BC è più fattibile nelle^{condizioni dinamiche 6,7}, fornendo motivazioni per l'applicazione del metodo di questo documento. Inoltre, sono state condotte varie indagini sulla struttura e le proprietà delle sfere BC. ⁶ hanno confrontato le fiasche Erlenmeyer sconcertate e dalle pareti lisce nella loro agitata produzione BC. Uno studio di Hu e Catchmark^{4 determinò} le condizioni per le sfere BC che furono usate come linee guida per l'attuale processo di produzione della sfera BC, e i loro risultati indicano che la dimensione della sfera non continua ad aumentare dopo 60 ore. Una revisione della produzione bc da parte di Mohammad et^{al. Holland} et al. Si presume che le capsule BC mostreranno caratteristiche simili e la ricerca futura studierà le proprietà strutturali. Gli studi hanno anche esplorato gli effetti benefici dell'uso di BC per produrre biocompositi migliorati. Utilizzando la resina epossidica come base, i ricercatori hanno dimostrato che l'aggiunta di BC migliora le caratteristiche del materiale come la durata della fatica, la tenacità alla frattura e la resistenza alla trazione e^{alla flessione 9,10}. Come dimostrato dalla ricerca passata e attuale, molti sono interessati a commercializzare l'uso bc.

Molti ricercatori hanno studiato la cellulosa batterica nei sistemi a rilascio controllato, e il metodo qui descritto genera capsule che potrebbero essere utilizzate come sistemi a rilascio controllato. Gran parte di questa ricerca si concentra sul rilascio controllato in campo biomedico, così come alcune esplorazioni nella somministrazione di fertilizzanti a rilascio controllato (CRF). Sulla base del successo del rilascio controllato da parte di BC di amoxicillina^11,lidocaina¹²e ibuprofene^13,BC può presentare caratteristiche di consegna simili con altre sostanze, come un fertilizzante pellettizzato. Una panoramica dei CRF di Shaviv e Mikkelsen^{14 riconosce} che i CRF sono più efficienti, risparmiano manodopera e generalmente causano meno degrado ambientale rispetto all'applicazione convenzionale di fertilizzanti. La cellulosa batterica può funzionare come materiale incapsulante favorevole per i CRF. I fertilizzanti possono lisciviare dalle membrane BC o scaricarsi come biodegradi BC^15,16. L'elevata capacità di gonfiore dell'acqua di BC può anche fungere da utile emendamento del suolo 17^,18,^{19 perché}sia i nutrienti fertilizzanti che l'umidità possono rilasciarsi nel terreno attraverso^{l'applicazione}di sfere BC. Con questi tratti, un CRF formato dall'incapsulamento della sfera BC può avere un vantaggio rispetto ad altri materiali di rivestimento dei fertilizzanti che potrebbero avere effetti negativi durante le loro fasi di produzione e smaltimento. L'adattamento di BC in un rivestimento di fertilizzanti può migliorare ulteriormente le tecnologie CRF. Abbassando il tasso di rilascio dei fertilizzanti, le colture avranno tempo sufficiente per assumere il fertilizzante e prevenire l'eccesso di deflusso nei corpi idrici, riducendo così l'eutrofizzazione e le zone nonossigenate. Simili fertilizzanti a lento rilascio sono stati preparati e pilotati utilizzando rivestimenti polimerici²⁰.

A differenza dei protocolli delineati nelle ricerche precedenti, questo si concentra sulla produzione uniforme e coesa della sfera piuttosto che sull'elevata resa di cellulosa. Inoltre, l'incapsulamento BC di altri solidi è stato studiato con pellicole di cellulosa, ma non^{con sfere 21}. Espandendo la ricerca sulle sfere di cellulosa batterica, è possibile compiere ulteriori passi per produrre BC commercialmente, il che è vantaggioso a causa delle caratteristiche sicure per l'ambiente di BC. Questo metodo di fabbricazione della sfera BC utilizza ingredienti culinari economici e prontamente disponibili. Dopo l'assemblaggio iniziale, le sfere BC iniziano a formarsi entro 2 giorni senza interferenze. Produrre sfere BC attraverso questa strategia richiede poco spazio e ha un prodotto di base commestibile, il tè fermentato "kombucha". Le tecniche di incapsulamento menzionate in altri studi includono rivestimenti formati attraverso la tecnica di inversione di^{fase 22,23,}formazione della^{matrice 24,}essiccazione a spruzzo²⁵e incapsulamento diretto durante la^{sintesi 26.} Il metodo di incapsulamento diretto delineato in questo manoscritto è utile per coloro che desiderano un processo facile ed economico che utilizza materiali prontamente disponibili.

Attraverso questa ricerca, è stato creato un protocollo di successo per la produzione e l'incapsulamento della sfera BC. Le sfere BC possono incapsulare particelle solide di biochar, code di miniera e microperline di polistirolo all'interno delle loro singole strutture. Sebbene non sia ancora ampiamente utilizzato nell'industria, BC è un materiale pratico, realizzato in modo sostenibile e naturale che potrebbe essere utilizzato per applicazioni future.

Protocollo

1. Creazione e manutenzione di coltura di starter di cellulosa batterica

1. Ottenere una coltura iniziale di cellulosa batterica, circa 50 g, sotto forma di SCOBY. Può essere acquistato commercialmente (ad esempio, da Cultures for Health). Posizionare lo SCOBY in un becher da 1 L, coperto con un tovagliolo di carta.
2. Far bollire 700 mL di acqua deionizzata, trasferirla su un recipiente separato da quello contenente lo SCOBY e aggiungere 85 g di saccarosio.
3. Una volta sciolto il saccarosio, aggiungere 2 sacchetti di tè nero (4,87 g). Intriso il tè per 1 h, quindi rimuovere con cura le bustine di tè usando un'asta di agitazione.
4. Aggiungere 200 mL di aceto bianco distillato al tè. Lasciare raffreddare la miscela a 25 °C. Una volta raffreddato, aggiungere 700 mL del tè a temperatura ambiente al becher contenente lo SCOBY.
   ATTENZIONE: L'aggiunta del tè acido mentre è troppo caldo può danneggiare gli organismi nello SCOBY.
5. Coprire il becher con un tovagliolo di carta e fissarlo con una fascia elastica e posizionare il becher in un'area di stoccaggio che mantiene una temperatura di 25 °C. Questa nave è comunemente indicata come cultura dello stock o un hotel.
6. Per mantenere sano lo SCOBY, è necessaria la manutenzione circa 2 volte al mese.
   1. Usando le mani guantate per trattenere i tappetini SCOBY, scolare il liquido dall'hotel in un becher separato. Nel contenitore con il liquido, aggiungere abbastanza tè acido per un totale di 700 mL di soluzione.
   2. Sciogliere 65 g di saccarosio nel contenitore con il tè acido. In attesa che il saccarosio si dissolva, sciacquare con cura i tappetini SCOBY in acqua DI.
   3. Una volta che il saccarosio è completamente sciolto, il liquido può essere aggiunto al becher contenente i tappetini SCOBY risciacquati. Coprire il becher e restituirlo nell'area di incubazione.

2. Produzione di sfere di cellulosa batterica

NOTA: Prestare attenzione quando si lavora con acqua bollente. Assicurarsi che le vetrerie possano resistere alle temperature dell'acqua bollente, siano esolente da difetti e siano delle dimensioni appropriate. Uno schema che descrive la produzione di sfere BC è fornito nella figura 1.

1. Far bollire 350 mL di acqua deionizzata usando un bollitore per il tè. Trasferire l'acqua calda in un becher da 500 mL. Sciogliere 42,5 g di saccarosio granulato nell'acqua calda utilizzando una barra di agitazione.
2. Quando il saccarosio è completamente sciolto, ripido 1 sacchetto di tè nero (2,54 g) nel pallone contenente il saccarosio e l'acqua per 1 h. Dopo questo, rimuovere la bustina di tè con un'asta di agitazione, facendo attenzione a evitare di aprire la bustina di tè e quindi smaltirla nella spazzatura.
3. Aggiungere 100 mL di aceto bianco distillato al becher, quindi mescolare accuratamente la miscela. Trasferire 80 ml della miscela di tè acido in un matico sconcertato da 250 ml. Lasciare raffreddare la miscela di tè a temperatura ambiente, 20 - 25 °C.
   NOTA: A questo punto, la miscela può essere lasciata raffreddare durante la notte o fino a quando non viene preparata per il passaggio successivo.
4. Una volta che la temperatura del liquido è a temperatura ambiente (20 - 25 °C), aggiungere 20 ml di liquido di coltura di avviamento microbico al pallone sconcertato. Questo liquido può essere ottenuto da un hotel SCOBY. Coprire il pallone con parafilm.
5. Posizionare il pallone sconcertato su un tavolo di scuotimento orbitale e impostare la velocità su 125 rotazioni al minuto (giri/min). Lasciare tremare la miscela per 3 giorni in una stanza o in un incubatore con una temperatura da 20 a 25 °C per produrre sfere BC.
   NOTA: Se forme irregolari si formano nel contenuto del pallone o se i grumi di cellulosa si attaccano alle pareti del pallone, devono essere rimossi per evitare la formazione di ulteriori masse BC irregolari. Usa le pinzette per rimuovere masse BC indesiderate, tra cui stringhe sottili, anelli, forme tubolari e altre forme chiaramente non sferiche.
6. Una volta che le sfere si sono formate, versarle delicatamente dal pallone e analizzarle, smaltirle o usarle in un modo non delineato in questo documento.

3. Utilizzo di sfere di cellulosa batterica per incapsulare particelle o contaminanti

1. Seguire i passaggi 2.1-2.5 precedenti.
2. Dopo aver tremato per 3 giorni, aggiungere circa 0,01 g di particolato finemente macinato al pallone sconcertato. I solidi appropriati includono biochar (260 ± 140 μm), rifiuti di miniera (350 ± 140 μm) e microperline di polistirolo (3 μm). I dati relativi a questi materiali sono illustrati nella sezione Risultati rappresentativi. Si prega di consultare la tabella dei materiali allegata per ulteriori descrizioni di biochar, rifiuti di miniera e microperline.
3. Coprire nuovamente il pallone con il parafilm e riposizionare su uno shaker orbitale, utilizzando la stessa velocità e temperatura ambiente (20 - 25 °C) per altri 3 giorni. Rimuovere le particelle incapsulate BC per l'analisi, lo smaltimento o altri usi.

Figura 1. Fabbricazione di sfere di cellulosa batterica e incapsulamento di particelle solide. Il passaggio 1 prevede la combinazione di coltura batterica di scorte con tè nero, zucchero e aceto in un pallone sconcertato. I dischi nelle impostazioni cultura stock rappresentano i tappetini BC. Quindi, il pallone sconcertato viene posizionato su un tavolo di scuotimento orbitale per 3 giorni. Il gradino centrale mostra i solidi aggiunti al pallone una volta formate le sfere BC. Il pallone viene agitato per altri 3 giorni. Nella fase finale, le sfere BC hanno continuato ad aumentare di dimensioni e incapsulato le particelle solide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Le sfere BC hanno il tasso di crescita più rapido durante le prime 48 ore di cultura (Figura 2). La figura 2 mostra anche come le sfere tendano a raggiungere una dimensione media massima e quindi rimangano costanti. In questo esperimento, le sfere raggiunsero un diametro medio di 7,5 ± 0,2 mm. Sebbene le sfere BC non si deteriorero mai completamente entro il periodo di crescita di 10 giorni, hanno iniziato a formare viticci che si estendono dal corpo principal...

Discussione

Questo protocollo delinea i metodi di produzione e incapsulamento della sfera BC che sono facili da condurre ed efficaci in termini di costi. Attraverso vari adeguamenti al protocollo originale, è stato individuato un processo adeguato. Occorre seguire misure critiche per garantire sfere vitali. Tutti gli ingredienti coinvolti nella formazione BC svolgono un ruolo chiave nella salute e nella durata delle sfere. Il saccarosio nutre gli organismi, il tè fornisce azoto e l'aceto abbassa il pH a condizioni ottimali per pre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL graduated cylinder
1000 mL beaker
25 mL graduated cylinder
250 mL Erlenmeyer baffled flask	Chemglass	CLS-2040-02
500 mL beaker
Balance
Biochar			Ponderosa pine heat treated under argon gas, heated at 15 °C per minute to 800 °C
Black tea
Deionized water
Distilled white vinegar
Elastic band
Microbial starter culture	Cultures for Health
Mine waste			Collected from Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Mine waste contains soil and metals originating from past copper mining. Mn, Si, Ca, Al, and Fe were the five most prevalent elements measured in the mine waste through x-ray diffraction.
Mortar and pestle
Orbital shaker			Used various brands
Paper towel
Polystyrene microbeads	Polybead	17138	3 micron diameter
Stir rod
Sucrose
Tea kettle
TGA	TA Instruments	TA Q500	400 °C/min to 800 °C, 100 mL/min N2
Thermometer
XRF Analyzer	ThermoFisher Scientific	10131166