Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

Resumo

O protocolo descreve o isolamento, a cultura e o perfil das células endoteliais da artéria mesentérica humana. Além disso, é fornecido um método para preparar a artéria humana para transcrição espacial. Os ensaios proteômicos, transcriptomics e funcionais podem ser realizados em células isoladas. Este protocolo pode ser reaproveitado para qualquer artéria de médio ou grande porte.

Resumo

As células endoteliais (CE) são cruciais para a função vascular e do corpo inteiro através de sua resposta dinâmica às pistas ambientais. Elucidar o transcritor e o epigenome das CE é primordial para entender seus papéis no desenvolvimento, saúde e doença, mas é limitado na disponibilidade de células primárias isoladas. As tecnologias recentes permitiram o perfil de alto rendimento do transcritor e do epigenome ce, levando à identificação de subpopulações de células EC até então desconhecidas e trajetórias de desenvolvimento. Embora as culturas CE sejam uma ferramenta útil na exploração da função e disfunção da CE, as condições de cultura e múltiplas passagens podem introduzir variáveis externas que alteram as propriedades da CE nativa, incluindo morfologia, estado epigenético e programa de expressão genética. Para superar essa limitação, o presente artigo demonstra um método de isolar as CEs primárias humanas das artérias mesentéricas doadoras com o objetivo de capturar seu estado natal. Os CES na camada intimal são dissociados mecanicamente e bioquimicamente com o uso de enzimas particulares. As células resultantes podem ser usadas diretamente para RNA em massa ou sequenciamento de RNA de células únicas ou banhadas para cultura. Além disso, um fluxo de trabalho é descrito para a preparação do tecido arterial humano para transcrição espacial, especificamente para uma plataforma comercialmente disponível, embora este método também seja adequado para outras técnicas de perfil de transcriptome espacial. Essa metodologia pode ser aplicada a diferentes vasos coletados de uma variedade de doadores em estados de saúde ou doenças para obter insights sobre a regulação transcricional e epigenética da CE, um aspecto crucial da biologia celular endotelial.

Introdução

Forrando o lúmen dos vasos sanguíneos, as células endoteliais (CE) são reguladores cruciais do tom vascular e da perfusão tecidual. Os CES são notáveis em sua capacidade de reagir ao ambiente extracelular e adaptar-se às mudanças na dinâmica e composição do fluxo sanguíneo. Essas respostas dinâmicas são mediadas através de uma rede de eventos de sinalização intracelular, incluindo modulações transcricionais e pós-transcricionais com resolução spatio-temporal. A desregulação dessas respostas está implicada em muitas patologias, incluindo, mas não se limitando a doenças cardiovasculares, diabetes e câncer ^1,2.

Uma grande proporção de estudos faz uso de linhas celulares ou modelos animais para interrogar o transcriptome ce. A primeira é uma ferramenta útil, dada a relativa facilidade de uso e a barata. No entanto, a cultura serial pode introduzir alterações fenotípicas nas CE, como características fibroblásticas e falta de polarização, desconectando-as de seu estado in vivo ³. As células primárias, por exemplo, a veia umbilical humana EC (HUVEC) têm sido uma escolha popular desde a década de 1980, mas são derivadas de um leito vascular de desenvolvimento que não existe em adultos, portanto improvável de representar plenamente CEs maduros. Os animais, especialmente os modelos de camundongos, representam melhor o ambiente fisiológico ou fisioterápico das CE e permitem o interrogatório de transcritos como resultado da perturbação genética. As ECs de Murine podem ser isoladas de vários tecidos, incluindo os tecidos de aorta, pulmões e adiposos usando procedimentos baseados em enzimas 4,5,6,7. No entanto, as células isoladas não podem ser usadas para múltiplas passagens, a menos que transformadas⁶ e muitas vezes são limitadas em número, o que requer a junção de vários animais ^5,8,9.

O advento de novas tecnologias explorando a arquitetura de embarcações a nível transcriptômico, particularmente com resolução unicelular, possibilitou uma nova era de biologia endotelial ao revelar novas funções e propriedades das CE 5,10,11,12,13,14. Um rico recurso construído pelos investigadores de Tabula Muris coletou perfis transcriômicos unicelulares de 100.000 células, incluindo CEs em 20 diferentes órgãos murinos¹⁵, que revelaram genes de marcadores EC comuns e assinaturas transcriômicas únicas com diferenças interetos intra-tecidos ^5,13. No entanto, há diferenças claras entre camundongos e humanos no genoma, epigenome e transcriptome, especialmente nas regiões não codificadoras 16,17,18. Essas desvantagens supracitadas enfatizam a importância da análise das CES utilizando amostras humanas para obter um perfil fiel das CE em seu estado natal em saúde e doença.

A maioria dos métodos de isolamento da CE depende da dissociação física através da homogeneização, corte fino e picar o tecido antes da incubação com enzimas proteolíticas para tempos diferentes. As enzimas e condições também variam consideravelmente entre os tipos de tecido, da trippsina à colagem, utilizadas sozinhas ou em combinação 19,20,21. Mais enriquecimento ou purificação à base de anticorpos são frequentemente incluídos para aumentar a pureza das CE. Tipicamente, anticorpos contra marcadores de membrana CE, por exemplo, CD144 e CD31 são conjugados a contas magnéticas e adicionados à suspensão celular^22,23. Tal estratégia pode ser geralmente adaptada para o isolamento da CE a partir de múltiplos tecidos humanos e de camundongos, incluindo as técnicas introduzidas neste protocolo.

Em seu estado natal, as CE interagem com vários tipos de células e podem existir em nichos vasculares onde a proximidade celular é crucial para a função. Embora estudos de sequenciamento de RNA unicelular e uni nuclear (scRNA e snRNA-seq) tenham sido primordiais para os recentes avanços na descrição da heterogeneidade ce, o processo de dissociação interrompe o contexto tecidual e o contato celular, que também são importantes para entender a biologia da CE. Desenvolvido em 2012 e nomeado Método do Ano em 2020²⁴, o perfil de transcriptome espacial tem sido utilizado para traçar o perfil da expressão genética global, mantendo as características espaciais em vários tecidos, incluindo cérebro²⁵, tumor²⁶ e tecido adiposo²⁷. As tecnologias podem ser direcionadas, utilizando sondas especializadas específicas para sequências específicas de RNA ligadas a reagentes de afinidade ou tags fluorescentes, detectando genes selecionados na resolução subcelular 28,29,30,31. Eles também podem ser não^{alvos 32,33}, tipicamente usando oligonucleotídeos espacialmente barrados para capturar RNA, que juntos são convertidos em cDNA para posterior preparação da biblioteca seq e, portanto, tem a vantagem de deduzir a expressão genética de tecido inteiro de forma imparcial. No entanto, a resolução espacial não é atualmente alcançada em um único nível celular com tecnologias comercialmente disponíveis. Isso pode ser superado até certo ponto com a integração de dados com dados scRNA-seq, permitindo, em última análise, o mapeamento de transcriptome unicelular em um contexto complexo de tecido, mantendo suas informações espaciais originais³⁴.

Aqui, um fluxo de trabalho é descrito para traçar o perfil de transcriptome CE utilizando artéria mesentérica superior humana, uma artéria periférica que tem sido usada para estudar vasodilatação, remodelação vascular, estresse oxidativo e inflamação 35,36,37. Duas técnicas são descritas: 1) para isolar e enriquecer as CEs da intimação dos vasos sanguíneos que combinam dissociação mecânica e digestão enzimática adequada para sequenciamento de transcrição unicelular ou cultura in vitro subsequente; 2) preparar seções arteriais para o perfil do transcriptome espacial (Figura 1). Essas duas técnicas podem ser realizadas de forma independente ou complementar para traçar CEs e suas células circundantes. Além disso, este fluxo de trabalho pode ser adaptado para uso em qualquer artéria média ou grande.

Protocolo

Estudos de tecido humano foram realizados em espécimes desidentídos obtidos do Centro de Recursos Celulares ilhotas do sul da Califórnia na Cidade da Esperança. Os consentimentos de pesquisa para o uso de tecidos humanos pós-morte foram obtidos dos parentes mais próximos dos doadores, e a aprovação ética para este estudo foi concedida pelo Conselho de Revisão Institucional da Cidade da Esperança (IRB nº 01046).

1. Dissociação física (tempo estimado: 1-2 h)

1. Coloque uma artéria fresca em um prato de 10 cm e lave com o soro fisiológico tamponado de fosfato de Dulbecco (D-PBS).
2. Com fórceps estéreis e tesouras de dissecção, remova a gordura e os tecidos conjuntivos externos até que o vaso esteja limpo. Meça o comprimento do vaso com uma régua colocada fora do prato e tire fotos para registros (Figura 1A).
3. Tampão de digestão apropriado pré-aquecido a 37 °C: para enzima de dissociação de células de uso de scRNA-seq; para ensaios de cultura celular usar 1-6 mg/mL de Colagenase D, 3 mg/mL de protease derivada de bactérias, 100 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5 mM de glicose, com 1 mM de CaCl₂ ^6,38 (pH 7.0, não requer ajuste) adicionado 5 min antes do uso.
4. Pegue a artéria mesentérica (tipicamente com um diâmetro de 6-8 mm) e corte longitudinalmente com uma tesoura para abrir o lúmen do vaso verticalmente.
5. Utilizando agulhas, conecte o recipiente à cera preta nos quatro cantos, deixando a intima exposta (Figura 1B).
6. Adicione 1 mL de tampão de digestão pré-aquecido à intima. Pegue um bisturi estéril e raspe o lúmen do vaso suavemente duas vezes.
   NOTA: O objetivo deste procedimento é dissociar a camada intimal, que pode precisar de prática. É preciso ter força suficiente para remover o endotélio, mas não tanto que as camadas mais profundas do tecido também sejam removidas, o que reduzirá a representação da CE.
7. Transfira o tampão de digestão para um tubo de 5 mL. Adicione 1 mL de tampão de digestão à intima e pipeta para cima e para baixo cuidadosamente para coletar as células restantes e adicionar ao tubo de 5 mL. Incubar células a 37 °C, girando a 150 rpm por 5 min.
8. Adicione 2 mL de m199 médio (ou D-PBS se continuar com scRNA-seq) à suspensão celular para saciar a reação enzimática. Misture suavemente e centrífuga a 4 °C, 600 x g por 5 min.
9. Remova o supernasce e armazene o supernatante separadamente para a cultura como um controle para observar se todas as células são capturadas na pelota na etapa 1.8. Resuspense a pelota celular em 1 mL de m199 médio (ou D-PBS se proceder com scRNA-seq).
10. Avalie a viabilidade celular misturando 10 μL de azul trypan com 10 μL de estoque celular. Observe a morfologia celular e conte as células usando um hemótmetro.
    NOTA: Neste ponto, as células podem ser usadas para quantificação de proteínas ou RNA ou cultivadas in vitro usando mídia de cultura CE seguindo os protocolos padrão³⁹. Alternativamente, eles podem ser preparados para sequenciamento como descrito na próxima seção.
11. Para a cultura, cubra dois poços de uma placa de 6 poços, pipetando 500 μL de reagente de fixação em poços por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do reagente de fixação e lavagem com D-PBS estérei, dispense o estoque completo da célula em um poço, e o supernatante manteve como controle no segundo poço.

2. Preparação para estudos de scRNA-seq (tempo estimado: 3-4 h)

1. Centrifugar o estoque celular da etapa 1.11 a 4 °C, 600 x g por 5 min. Remova o supernatante e resuspenque a pelota suavemente com uma pipeta P1000 e ponta de furo largo em 1 mL de 0,04% de albumina de soro bovino (BSA) em D-PBS. Misture bem para garantir uma suspensão de célula única.
2. Passe a solução através de um filtro de 40 μm para remover detritos celulares. Se os detritos permanecerem, passe por um segundo filtro em 4 mL de 0,04% BSA em D-PBS.
3. Centrifugar a 4 °C, 600 x g por 5 min. Remova o supernatante e resuspenque a pelota em 500 μL de 0,04% BSA em D-PBS usando uma pipeta P1000 com uma ponta de pipeta larga. Misture bem para garantir uma suspensão de célula única.
4. Avalie a viabilidade celular misturando 10 μL de estoque celular com 10 μL de azul trypan. Usando um hemótmetro, observe a morfologia, determine se há uma suspensão unicelular sem aglomerados, verifique se há detritos teciduais e calcule o número de células vivas e mortas.
5. Se as células estiverem agrupadas ou os detritos permanecerem, repita a lavagem com 0,04% de BSA em D-PBS ou passe novamente pelo coador de 40 μm.
   NOTA: Embora isso reduza o rendimento, é importante que as células existam em uma suspensão de célula única limpa para sequenciamento ideal.
6. A suspensão unicelular pode ser usada para scRNA-seq.

3. Perfil de transcriptome espacial (tempo estimado: 3-4 h)

1. Adicione isopentano (2-metilbutano) a um recipiente de metal e esfrie em nitrogênio líquido (LN₂) ou gelo seco (LN₂ é preferido, pois trará a temperatura mais baixa do que o gelo seco). Despeje o composto de temperatura de corte ideal (OUT) em poços de criomolds plásticos rotulados tomando cuidado para não criar bolhas e remover aquelas que aparecem. Deixe criomold em gelo seco para esfriar.
2. Corte pelo menos duas seções coronais, 1 cm de comprimento do vaso. Usando fórceps longos (12"), submergir o tecido em isocento até congelar. Submergir rapidamente o tecido em OUTUBRO na orientação com o lúmen visível no centro. Tome cuidado para remover quaisquer bolhas, especialmente aquelas próximas ao tecido.
3. Usando fórceps longos (12"), segure os criomoldes e segure-os no recipiente de metal. Embora a base dos moldes deva estar no líquido, não deve ser muito profunda para permitir que isopentane corra sobre o tecido. Observe o congelamento, o OCT ficará branco progressivamente do lado de fora em 1-2 min.
4. Armazene essas seções em um recipiente lacrado a -80 °C por até 6 meses.
   NOTA: Mantenha amostras em gelo seco o tempo todo e não permita mais de um ciclo de congelamento. Este tecido pode ser usado para análise histológica, fluorescência de RNA/DNA na hibridização situ (FISH), ou transcrição espacial, que será descrita agora.
5. Configure a temperatura criostat para -20 °C para a câmara e -10 °C para a cabeça do espécime. Equilibre as seções do vaso embutido oct, facas, pincéis e slides a -20 °C no criostat por aproximadamente 30 minutos. Durante o equilíbrio, limpe a máquina e todos os equipamentos que possam tocar as seções, incluindo a lâmina, com 70% de etanol seguido da solução de descontaminação RNase.
6. Conecte a amostra distribuindo uma pequena quantidade de OCT no bloco criostat circular e colocando a amostra em cima antes de congelar. Coloque o bloco no centro da cabeça da amostra e enrosque o bloco no lugar usando uma alça preta alta à esquerda. Corte qualquer excesso de OCT em torno da nave.
7. Ajuste a espessura de corte para 10 μm no criostat, corte aproximadamente 60 seções e coloque-as em um tubo pré-resfriado de 1,5 mL. Estas seções serão usadas para avaliar a qualidade do RNA. Após a remoção do criostat, adicione imediatamente 1 mL de reagente de extração de RNA e vórtice até que as seções sejam completamente dissolvidas.
8. Adicione 200 μL de clorofórmio e misture até que a solução se assemelhe a um milkshake de morango. Centrifugar a 11.200 x g por 10 min a 4 °C.
9. Colete a fase aquosa (fase clara em cima de camadas brancas e rosas) e adicione 500 μL de isopropanol a ele. Misture invertendo os tubos mais de 10 vezes e coloque a -80 °C por pelo menos 20 min.
10. Centrifugar a 11.200 x g por 10 min a 4 °C. Dissolva a pelota de RNA purificada em 5 μL de água sem RNase. Examine o número de integridade do RNA (RIN).
    NOTA: As amostras com RIN ≥ 7 são preferidas, mas rin ≥ 6 é aceitável. O número de seções teciduais e o volume de solução para a dissolução de RNA podem exigir otimização dependendo do sistema usado para garantir que a concentração final de RNA esteja dentro da faixa de função RIN para permitir uma avaliação rin precisa.
11. Pratique seções de corte e colocação adequadamente dentro dos quadros fiduciários usando lâminas de vidro simples antes de prosseguir para a otimização de tecido comercialmente disponível ou slides de expressão genética. Isso pode ser conseguido desenhando quadrados de 6,5 mm x 6,5 mm em um escorregador de vidro simples, resfriando a -20 °C no criostat e colocando seções nesta área de captura.
12. Corte seções de 10 μm com placa anti-rolo no lugar, gire e achate cuidadosamente tocando suavemente a seção através do OCT circundante.
13. O uso de pincéis criostat sem RNase coloca a seção de tecido dentro do quadrado, usando apenas o OCT circundante. Coloque imediatamente um dedo (em luvas) na parte de trás da área de captura para derreter a seção para o slide.
14. Uma vez que a seção tenha aderido, coloque o slide na criobar para permitir que a seção congele. Deve-se tomar cuidado para evitar a dobra tecidual e o excesso de tecido nas bordas demarcadas do quadro fiduciário. Se necessário, corte o tecido em metades ou trimestres ao longo do lúmen usando uma lâmina para garantir que a seção do vaso se encaixe dentro do quadro de 6,5 mm x 6,5 mm.
15. Corte 10 seções de μm de tecido conforme 3,12-3,14 na otimização do tecido ou slides de expressão genética. Transfira o slide para um e-mail de slides colocado em gelo seco. Armazene slides a -80 °C por até 4 semanas antes de prosseguir com os protocolos espaciais publicados^33,34.

4. Análise de dados de sequenciamento (tempo estimado: até 1 semana, dependendo da familiaridade com o software)

NOTA: Apenas para análise transcriômica espacial, pule para a etapa 4.8. os dados scRNA-seq são processados usando o pipeline padronizado alinhado ao transcriptome de referência hg38 humano. O pacote R Seurat (v3.2.2) é usado para analisar dados scRNA-seq seguindo as diretrizes^{publicadas 40}.

1. Filtro usando métricas de controle de qualidade bem estabelecidas: células raras com um número muito alto de genes (potencialmente multiplets) e células com altas porcentagens mitocondriais (células de baixa qualidade ou moribundos frequentemente apresentam contaminação mitocondrial) são removidas.
2. Normalize os dados usando o "sctransform", um método para melhorar a integração da amostra em comparação com a normalização do log. Esses dados normalizados são usados para redução de dimensionalidade e agrupamento, enquanto os níveis de expressão normalizados por troncos são usados para análise com base nos níveis de expressão genética, como a classificação do tipo celular⁴¹.
3. Selecione genes marcadores por tipo de célula, por exemplo, molécula de adesão celular endotelial plaquetária-1 (PECAM1) e fator von Willebrand (VWF) para CES, lucan (LUM) e procórgeno C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) para fibroblastos, gene de translocação de células B 1 (BTG1) e CD52 para macrófagos, C1QA e C1QB para monócitos, e cadeia pesada de mísina 11 (MYH11) e transgelin (TAGLN) para células musculares lisas vasculares³⁶.
4. Calcule o nível médio de expressão entre células únicas entre cada par de marcadores, a fim de ter um único marcador com um nível médio de expressão associado a cada célula tipo⁴².
5. Aplique um Modelo de Mistura Gaussiana (GMM) com dois componentes nos dados de expressão de cada marcador em células únicas, a fim de separar as células em dois conjuntos, ou seja, expressar o marcador e expressar o marcador humildemente. Desta forma, para cada marcador, cada célula é atribuída a um dos dois componentes⁴².
6. Use enriquecimento estatístico para o conjunto de genes marcadores, um teste exato de Fisher, para atribuir um tipo de célula a cada aglomerado. Ao fazer isso, um conjunto de valores p são obtidos por cluster, cada um correspondendo a um tipo de célula. O tipo de célula com o menor valor p é atribuído a esse cluster.
7. Processe os dados transcriômicos espaciais usando os dutos da Space Ranger resultando em descodificação espacial e geração de métricas de controle de qualidade (QC), incluindo leituras total alinhadas ao transcriptome humano hg38, o número médio de Identificador Molecular Único (UMI) ou genes por ponto³⁵.
   NOTA: O pacote R Seurat (v3.2.2) é usado para analisar os dados processados pela Space Ranger seguindo as diretrizes^{publicadas 40}.
8. Normalize os dados utilizando o "sctransform", método demonstrado para melhorar a análise a jusante em comparação com a normalização do tronco dada a heterogeneidade do tecido e a variância muito alta na contagem entre as manchas.

Resultados

A análise de CEs da artéria mesentérica usando uma combinação de dissociação mecânica e enzimática ou criopreservação para uso em vários ensaios a jusante é retratada aqui (Figura 1). As CE podem ser perfiladas nas artérias mesentéricas usando as seguintes etapas: A) dissociação mecânica da intima juntamente com digestão de colagem às células culturais; B) geração de suspensão unicelular para scRNA-seq; ou C) seções transversais da artéria podem ser incorporadas em...

Discussão

O fluxo de trabalho apresentado detalha um conjunto de técnicas para traçar CEs de uma única peça de artéria humana com resolução unicelular e espacial. Existem várias etapas críticas e fatores limitantes no protocolo. Uma chave para o perfil do transcriptome é o frescor do tecido e da integridade do RNA. É importante manter os tecidos no gelo o máximo possível antes do processamento para minimizar a degradação do RNA. Normalmente, os tecidos pós-morte são processados entre 8-14 h após a hora da morte. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184