전사체 수준에서 인간 일차 장간막 동맥 내피 세포의 분리 및 프로파일링

요약

이 프로토콜은 인간 장간막 동맥으로부터 내피 세포의 분리, 배양 및 프로파일링을 기술한다. 추가적으로, 공간 전사체학을 위한 인간 동맥을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 단백체학, 전사체학, 및 기능적 검정은 단리된 세포 상에서 수행될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 중간 또는 대형 동맥에 대해 용도를 변경할 수 있습니다.

초록

내피 세포 (ECs)는 환경 신호에 대한 역동적 인 반응을 통해 혈관 및 전신 기능에 중요합니다. ECs의 전사체 및 후성 게놈을 밝히는 것은 발달, 건강 및 질병에서 그들의 역할을 이해하는 데 가장 중요하지만 분리 된 일차 세포의 가용성에는 제한적입니다. 최근의 기술들은 EC 전사체 및 에피게놈의 고처리량 프로파일링을 가능하게 하여, 이전에 알려지지 않은 EC 세포 하위집단 및 발달 궤적의 확인으로 이어졌다. EC 배양은 EC 기능 및 기능 장애의 탐구에 유용한 도구이지만, 배양 조건 및 다중 계대는 형태학, 후성 유전 적 상태 및 유전자 발현 프로그램을 포함하여 천연 EC의 특성을 변화시키는 외부 변수를 도입 할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 본 논문은 인간 일차 EC를 기증자 장간막 동맥으로부터 분리하여 본래의 상태를 포획하는 것을 목표로 하는 방법을 시연한다. 내막 층의 EC는 특정 효소의 사용과 함께 기계적, 생화학적으로 해리됩니다. 수득된 세포는 벌크 RNA 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 직접 사용되거나 배양을 위해 플레이팅될 수 있다. 또한, 공간 전사체학, 특히 상업적으로 이용가능한 플랫폼을 위한 인간 동맥 조직의 제조를 위한 워크플로우가 기술되지만, 이 방법은 다른 공간 전사체 프로파일링 기술에도 적합하다. 이 방법론은 내피 세포 생물학의 중추적 인 측면 인 EC 전사 및 후성 유전 적 조절에 대한 통찰력을 얻기 위해 건강 또는 질병 상태의 다양한 기증자로부터 수집 된 다른 혈관에 적용될 수 있습니다.

서문

혈관의 내강을 감싸는 내피 세포 (ECs)는 혈관 색조 및 조직 관류의 중요한 조절자입니다. EC는 세포 외 환경에 반응하고 혈류의 역학 및 구성의 변화에 적응하는 능력이 뛰어납니다. 이러한 동적 반응은 시공간적 분해능을 갖는 전사 및 전사 후 조절을 포함하는 세포내 신호전달 사건의 네트워크를 통해 매개된다. 이러한 반응의 조절 장애는 심혈관 질환, 당뇨병 및 암 ^1,2를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 병리에 연루되어 있습니다.

많은 연구가 EC 전사체를 조사하기 위해 세포주 또는 동물 모델을 사용합니다. 전자는 상대적으로 사용하기 쉽고 저렴하다는 점을 감안할 때 유용한 도구입니다. 그러나, 연속 배양은 섬유아세포의 특징과 분극의 부족과 같은 ECs에 표현형 변화를 도입하여 생체내 상태⁽³)로부터 분리시킬 수 있다. 일차 세포, 예를 들어, 인간 탯줄 정맥 EC (HUVEC)는 1980 년대부터 대중적인 선택이었지만 성인에는 존재하지 않는 발달 혈관 층에서 파생되므로 성숙한 EC를 완전히 대표하지는 않을 것입니다. 동물, 특히 마우스 모델은 ECs의 생리적 또는 병리생리학적 환경을 더 잘 나타내며 유전적 교란의 결과로 전사체의 심문을 허용한다. 뮤 린 ECs는 효소 기반 절차 4,5,6,7을 사용하여 대동맥, 폐 및 지방 조직을 포함한 다양한 조직으로부터 분리될 수 있다. 그러나, 단리된^{세포는 형질전환6}이 아니라면 다중 계대에 사용될 수 없으며, 종종 그 수가 제한되며, 이는 다수의 동물 ^5,8,9로부터의 풀링을 필요로 한다.

전사체 수준, 특히 단일 세포 분해능을 통해 혈관 구조를 탐구하는 새로운 기술의 출현은 ECs 5,10,11,12,13,14의 새로운 기능과 특성을 밝혀냄으로써 내피 생물학의 새로운 시대를 열었습니다. Tabula Muris 조사관이 구축 한 풍부한 자원은 20 개의 다른 뮤린 기관¹⁵에 걸쳐 EC를 포함한 100,000 개의 세포의 단일 세포 전사체 프로파일을 수집하여 일반적인 EC 마커 유전자와 조직 간 및 조직 내 차이가있는 고유 한 전사체 서명 ^5,13을 밝혀 냈습니다. 그럼에도 불구하고, 게놈, 에피게놈 및 전사체, 특히 비코딩 영역^16,17,18에서 마우스와 인간 사이에 분명한 차이가 있다. 앞서 언급 한 이러한 단점은 건강 및 질병에서 기본 상태에서 EC의 충실한 프로파일을 얻기 위해 인간 샘플을 사용하여 EC를 분석하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다.

대부분의 EC 분리 방법은 단백질 분해 효소로 인큐베이션하기 전에 조직을 균질화, 미세하게 절단 및 다듬어 다른 시간 동안 물리적 해리에 의존합니다. 효소 및 조건은 또한 트립신에서 콜라게나제에 이르기까지 조직 유형마다 상당히 다양하며, 단독으로 또는 조합하여 사용되는 ^19,20,21이다. 추가의 항체-기반 농축 또는 정제는 종종 ECs의 순도를 증가시키기 위해 포함된다. 전형적으로, EC 막 마커, 예를 들어, CD144 및 CD31에 대한 항체는 자성 비드에 접합되고 세포 현탁액^22,23에 첨가된다. 이러한 전략은 일반적으로 이 프로토콜에 도입된 기술을 포함하여 다수의 인간 및 마우스 조직으로부터의 EC 단리를 위해 적응될 수 있다.

EC는 원래 상태에서 여러 세포 유형과 상호 작용하며 세포 근접성이 기능에 중요한 혈관 틈새 시장에 존재할 수 있습니다. 단일 세포 및 단일 핵 RNA-시퀀싱 (scRNA 및 snRNA-seq) 연구가 EC 이질성을 설명하는 데있어 최근의 돌파구에 가장 중요했지만, 해리 과정은 조직 맥락과 세포 - 세포 접촉을 방해하며, 이는 EC 생물학을 이해하는 데에도 중요합니다. 2012년에 개발되어 2020년 24년에 올해의 방법(Method of the Year)으로 명명된 공간 전사체 프로파일링은 뇌(²⁵), 종양(²⁶), 지방조직⁽²⁷)을 포함한 다양한 조직에서의 공간적 특징을 유지하면서 글로벌 유전자 발현을 프로파일링하는 데 활용되고 있다. 이 기술은 친화성 시약 또는 형광 태그에 부착 된 특정 RNA 서열에 특이적인 특수 프로브를 사용하여 타겟팅 할 수 있으므로 세포 내 해상도 28,29,30,31에서 선택된 유전자를 검출 할 수 있습니다. 이들은 또한 비표적화된^32,33일 수 있으며, 전형적으로 공간적으로 바코드된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNA를 포획할 수 있으며, 이는 함께 후속 서열 라이브러리 제조를 위해 cDNA로 전환되고^, 따라서 편향되지 않은 방식으로 전체 조직 유전자 발현을 추론하는 이점을 갖는다. 그러나, 공간 분해능은 현재 상업적으로 이용가능한 기술로 단일 세포 수준에서 달성되지 않는다. 이것은 scRNA-seq 데이터와의 데이터 통합으로 어느 정도 극복될 수 있으며, 궁극적으로는 원래의 공간 정보⁽³⁴⁾를 유지하면서 복잡한 조직 컨텍스트에서 단일 세포 전사체의 매핑을 허용한다.

본원에서, 워크플로우는 인간 우수한 장간막 동맥, 혈관확장, 혈관 리모델링, 산화 스트레스, 및 염증^35,36,37을 연구하는데 사용되어 온 말초 동맥을 사용하여 EC 전사체를 프로파일링하기 위해 기술된다. 두 가지 기술이 기재되어 있다: 1) 단일 세포 전사체 시퀀싱 또는 후속 시험관내 배양에 적합한 기계적 해리 및 효소적 소화를 결합하는 혈관의 내막으로부터 ECs를 단리하고 풍부하게 하는 단계; 2) 공간 전사체 프로파일링을 위한 동맥 절편을 준비한다(도 1). 이 두 기술은 EC와 그 주변 셀을 프로파일링하기 위해 독립적으로 또는 상보적으로 수행될 수 있습니다. 또한이 워크 플로는 모든 중간 또는 대형 동맥에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

프로토콜

인간 조직 연구는 City of Hope의 Southern California Islet Cell Resource Center에서 얻은 미확인 표본에 대해 수행되었습니다. 사후 인간 조직의 사용에 대한 연구 동의는 기증자의 다음 친족으로부터 얻어졌으며,이 연구에 대한 윤리적 승인은 희망의 도시 기관 검토위원회 (IRB No. 01046)에 의해 부여되었습니다.

1. 물리적 해리 (예상 시간 : 1-2 시간)

1. 신선한 동맥을 10cm 접시에 놓고 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (D-PBS)로 씻으십시오.
2. 멸균 포셉과 해부 가위로 혈관이 깨끗해질 때까지 지방과 외부 결합 조직을 제거하십시오. 접시 외부에 놓인 눈금자로 용기의 길이를 측정하고 기록을 위해 사진을 찍습니다(그림 1A).
3. 적절한 소화 완충액을 37°C로 예비-가온: scRNA-seq 사용을 위해 세포-해리 효소; 세포 배양 분석의 경우 1-6 mg/mL의 콜라게나제 D, 3 mg/mL의 박테리아 유래 프로테아제, 100 mM의 HEPES, 120 mM의 NaCl, 50 mM의 KCl, 5 mM의 글루코스, 1 mM의_CaCl2 ^6,38 (pH 7.0, 조정이 필요하지 않음)을 사용 5분 전에 첨가한다.
4. 장간막 동맥 (일반적으로 직경 6-8mm)을 가져 와서 가위로 길이 방향으로 잘라 혈관 내강을 수직으로 엽니 다.
5. 바늘을 사용하여 네 모서리의 검은 왁스에 용기를 부착하여 내막이 노출되도록 합니다(그림 1B).
6. 내막에 미리 가온된 소화 완충액 1 mL를 첨가하십시오. 멸균 메스를 가져 와서 혈관의 내강을 부드럽게 두 번 긁어냅니다.
   참고: 이 절차의 목적은 연습이 필요할 수 있는 내막 계층을 분리하는 것입니다. 내피를 제거하기 위해 충분한 힘을 가할 필요가 있지만, 조직의 더 깊은 층도 제거되어 EC 표현을 감소시킬 정도로 많지는 않습니다.
7. 소화 완충액을 5 mL 튜브로 옮긴다. 1 mL의 소화 완충액을 인티마에 넣고 피펫을 위아래로 조심스럽게 올려 나머지 세포를 모으고 5 mL 튜브에 첨가하십시오. 세포를 37°C에서 인큐베이션하고, 5분 동안 150 rpm에서 회전시킨다.
8. 2 mL의 M199 배지 (또는 scRNA-seq로 진행하는 경우 D-PBS)를 세포 현탁액에 첨가하여 효소 반응을 켄칭한다. 부드럽게 혼합하고 5분 동안 4°C, 600 x g 에서 원심분리한다.
9. 상층액을 제거하고 상층액을 별도로 보관하여 대조군으로 배양하여 모든 세포가 단계 1.8에서 펠렛에 포획되는지 관찰한다. 세포 펠릿을 1 mL의 M199 배지에 재현탁시킨다 (또는 scRNA-seq로 진행하는 경우 D-PBS).
10. 10 μL의 트리판 블루와 10 μL의 세포 스톡을 혼합하여 세포 생존율을 평가하였다. 세포 형태를 관찰하고 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수하십시오.
    참고: 이 시점에서, 세포는 단백질 또는 RNA 정량화에 사용되거나 표준 프로토콜³⁹에 따라 EC 배양 배지를 사용하여 시험관내에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 이들은 다음 섹션에서 설명된 바와 같이 시퀀싱을 위해 준비될 수 있다.
11. 배양을 위해, 500 μL의 부착 시약을 실온에서 30분 동안 웰 내로 피펫팅함으로써 6-웰 플레이트의 두 웰을 코팅한다. 부착 시약을 제거하고 멸균된 D-PBS로 세척한 후, 전체 세포 스톡을 하나의 웰에 분배하고, 상청액을 대조군으로서 두 번째 웰 내로 유지하였다.

2. scRNA-seq 연구를 위한 제조 (추정 시간: 3-4 h)

1. 단계 1.11로부터 세포 스톡을 4°C, 600 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 D-PBS 중의 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 1 mL에 P1000 피펫 및 와이드보어 팁으로 부드럽게 재현탁시켰다. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 잘 혼합하십시오.
2. 용액을 40 μm 스트레이너를 통해 통과시켜 세포 파편을 제거한다. 파편이 남아 있으면 두 번째 스트레이너를 통과하여 D-PBS 중의 0.04% BSA 4 mL를 넣습니다.
3. 4°C, 600 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 넓은 보어 피펫 팁이 있는 P1000 피펫을 사용하여 D-PBS 중의 0.04% BSA의 500 μL의 펠렛을 재현탁시켰다. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 잘 혼합하십시오.
4. 10 μL의 세포 스톡과 10 μL의 트리판 블루를 혼합하여 세포 생존율을 평가한다. 혈구 세포계를 사용하여 형태를 관찰하고, 클러스터가없는 단일 세포 현탁액이 있는지 여부를 결정하고, 조직 파편을 확인하고, 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 계산하십시오.
5. 세포가 클러스터링되거나 파편이 남아 있는 경우, D-PBS 중 0.04% BSA로 세척을 반복하거나 40μm 스트레이너를 다시 통과시킨다.
   참고: 이렇게 하면 수율이 감소하지만, 최적의 시퀀싱을 위해 세포가 깨끗한 단일 세포 현탁액에 존재하는 것이 중요합니다.
6. 상기 단세포 현탁액은 scRNA-seq를 사용할 수 있다.

3. 공간 전사체 프로파일링 (예상 시간: 3-4 h)

1. 금속 캐니스터에 이소펜탄(2-메틸부탄)을 첨가하고 액체 질소(LN2) 또는 드라이아이스(_LN2)에서 냉각시켜 드라이아이스보다 낮은 온도를 가져올 것이므로 바람직하다. 라벨이 붙은 플라스틱 냉동 금형의 웰에 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)을 부어 거품이 생기지 않도록주의하고 나타나는 것을 제거하십시오. 드라이 아이스에 cryomold를 두어 차가워지게하십시오.
2. 용기 길이 1cm의 적어도 두 개의 코로나 섹션을 자릅니다. 긴 (12") 포셉을 사용하여 동결 될 때까지 조직을 이소펜탄에 잠급니다. 중앙에서 보이는 내강과 배향하여 OCT의 조직을 빠르게 잠수시킵니다. 모든 거품, 특히 조직 옆에있는 거품을 제거하도록주의하십시오.
3. 긴 (12") 포셉을 사용하여 냉동 금형을 잡고 금속 용기에 고정하십시오. 곰팡이의 바닥은 액체에 있어야하지만 이소펜탄이 조직 위로 흘러 들어가기에는 너무 깊어서는 안됩니다. 동결을 관찰하면 OCT는 1-2 분 안에 외부에서 점진적으로 흰색이됩니다.
4. 이러한 섹션을 -80°C의 밀봉된 용기에 최대 6개월 동안 보관하십시오.
   참고: 항상 드라이 아이스에 샘플을 유지하고 하나 이상의 동결 - 해동 사이클을 허용하지 마십시오. 이 조직은 조직학적 분석, RNA/DNA 형광 계내 혼성화(FISH) 또는 공간 전사체에 사용될 수 있으며, 이는 현재 설명될 것이다.
5. 냉동 온도 온도를 챔버의 경우 -20 °C로, 시편 헤드의 경우 -10 °C로 설정하십시오. OCT 임베디드 용기 섹션, 나이프, 브러시 및 슬라이드를 약 30분 동안 냉동 상태에서 -20°C로 평형화시킨다. 평형을 유지하면서 블레이드를 포함한 섹션에 닿을 수있는 기계 및 모든 장비를 70 % 에탄올로 청소하고 RNase 오염 제거 용액을 사용하십시오.
6. 소량의 OCT를 원형 냉동 장치 블록에 분배하고 샘플이 얼기 전에 위에 올려 놓음으로써 샘플을 부착하십시오. 블록을 시편 헤드의 중앙에 놓고 왼쪽의 키가 큰 검은 손잡이를 사용하여 블록을 제자리에 조이십시오. 선박을 둘러싼 과도한 OCT를 잘라냅니다.
7. 냉동 스탯 상에서 절단 두께를 10 μm로 설정하고, 대략 60개의 절편을 절단하여 미리 냉각된 1.5 mL 튜브에 넣는다. 이들 절편은 RNA 품질을 평가하는데 사용될 것이다. cryostat에서 제거되면, 절편이 완전히 용해 될 때까지 즉시 RNA 추출 시약 1 mL와 와류를 첨가하십시오.
8. 클로로포름 200μL를 넣고 용액이 딸기 밀크 쉐이크와 비슷해질 때까지 혼합하십시오. 4°C에서 10분 동안 11,200 x g 에서 원심분리한다.
9. 수성 상 (흰색과 분홍색 층 위에 맑은 상)을 수집하고 500 μL의 이소프로판올을 첨가하십시오. 튜브를 10회 이상 반전시켜 혼합하고 -80°C에서 적어도 20분 동안 둔다.
10. 4°C에서 10분 동안 11,200 x g에서 원심분리한다. 정제된 RNA 펠렛을 5 μL의 RNase-free 물에 용해시킨다. RNA 무결성 번호(RIN)를 검사합니다.
    참고: RIN ≥ 7이 있는 샘플이 선호되지만 RIN ≥ 6은 허용됩니다. RNA 용해를 위한 조직 절편 수 및 용액의 부피는 정확한 RIN 평가를 허용하기 위해 최종 RNA 농도가 RIN 기능 범위 내에 있도록 하기 위해 사용되는 시스템에 따라 최적화를 필요로 할 수 있다.
11. 상업적으로 입수가능한 조직 최적화 또는 유전자 발현 슬라이드를 진행하기 전에 일반 유리 슬라이드를 사용하여 신탁 프레임 내에 절편을 적절하게 절단하고 배치하는 연습을 한다. 이것은 일반 유리 슬라이드에 6.5mm x 6.5mm 사각형을 그리고, 냉동 장치에서 -20 °C로 냉각하고,이 캡처 영역에 섹션을 배치하여 달성 할 수 있습니다.
12. 안티 롤 플레이트로 10 μm 섹션을 자르고 뒤집어 주위의 OCT를 통해 섹션을 부드럽게 만져서 조심스럽게 평평하게하십시오.
13. RNase-free cryostat 브러시를 사용하여 조직 섹션을 사각형 내에 배치하고 주변 OCT만 사용합니다. 즉시 캡처 영역의 뒷면에 손가락 한 개(장갑 안)를 놓아 섹션을 슬라이드에 녹입니다.
14. 섹션이 부착되면 슬라이드를 냉동 막대에 올려 놓으면 섹션이 고정되도록 합니다. 조직 폴딩과 조직이 신탁 프레임의 경계 가장자리를 덮지 않도록주의해야합니다. 필요한 경우 블레이드를 사용하여 조직을 루멘을 따라 반쪽 또는 분기로 절단하여 용기 섹션이 6.5mm x 6.5mm 프레임 내에 맞는지 확인하십시오.
15. 3.12-3.14에 따라 조직의 10 μm 절편을 조직 최적화 또는 유전자 발현 슬라이드 상으로 절단한다. 슬라이드를 드라이 아이스 위에 놓인 슬라이드 메일러로 옮깁니다. 공개된 공간 프로토콜(^33,34)을 진행하기 전에 슬라이드를 -80°C에서 최대 4주 동안 보관^한다.

4. 시퀀싱 데이터 분석 (예상 시간 : 소프트웨어에 대한 친숙도에 따라 최대 1 주)

참고: 공간 전사체 분석의 경우에만 4.8단계로 건너뜁니다. scRNA-seq 데이터는 인간 hg38 참조 전사체에 정렬된 표준화된 파이프라인을 사용하여 처리된다. R 패키지 Seurat (v3.2.2)는 공개된 가이드라인⁴⁰에 따라 scRNA-seq 데이터를 분석하는데 사용된다.

1. 잘 정립 된 품질 관리 메트릭을 사용하여 필터 : 유전자 수가 매우 많은 희귀 세포 (잠재적으로 멀티플렉트)와 미토콘드리아 비율이 높은 세포 (품질이 낮거나 죽어가는 세포는 종종 미토콘드리아 오염을 나타냄)를 제거합니다.
2. 로그 정규화에 비해 샘플 통합을 개선하는 방법인 "sctransform"을 사용하여 데이터를 정규화합니다. 이러한 정규화된 데이터는 차원성 감소 및 클러스터링에 사용되는 반면, 로그-정규화된 발현 수준은 세포 유형 분류⁴¹과 같은 유전자 발현 수준에 기초한 분석에 사용된다.
3. 세포 유형별 선택 마커 유전자, 예를 들어, 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (PECAM1) 및 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 대 ECs, 루미칸 (LUM) 및 섬유아세포에 대한 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 인핸서 (PCOLCE), 대식세포에 대한 B 세포 전좌 유전자 1 (BTG1) 및 CD52, 단핵구에 대한 C1QA 및 C1QB, 및 미오신 중쇄 11 (MYH11) 및 혈관 평활근 세포를 위한 트랜스겔린(TAGLN)³⁶.
4. 각 세포 유형⁴²와 연관된 평균 발현 수준을 갖는 단일 마커를 갖기 위해 각 마커 쌍 사이의 단일 세포에 걸친 평균 발현 수준을 계산한다.
5. 세포를 두 세트, 즉 마커를 고도로 발현하고 마커를 낮게 발현하는 두 세트로 분리하기 위해 단일 세포에 걸친 각 마커의 발현 데이터에 두 가지 성분을 가진 가우시안 혼합물 모델 (GMM)을 적용하십시오. 이러한 방식으로, 각각의 마커에 대해, 각각의 단일 세포는 두 컴포넌트(⁴²) 중 하나에 할당된다.
6. 피셔의 정확한 검사인 마커 유전자 세트에 대한 통계적 농축을 사용하여 각 클러스터에 세포 유형을 할당합니다. 이렇게 하면 클러스터당 p-값 집합이 얻어지며, 각 값은 셀 유형에 해당합니다. p-값이 가장 낮은 셀 유형이 해당 클러스터에 할당됩니다.
7. 공간 전사체 데이터를 Space Ranger 파이프라인을 사용하여 처리하여 공간 디바코딩을 초래하고 hg38 인간 전사체에 대한 총 정렬된 판독값, 고유 분자 식별자(UMI) 또는 스폿당 유전자의 중앙값 수(³⁵)을 포함하는 품질 관리(QC) 메트릭의 생성을 초래합니다.
   참고: R 패키지 Seurat(v3.2.2)는 게시된 지침⁴⁰에 따라 Space Ranger로 처리된 데이터를 분석하는 데 사용됩니다.
8. "sctransform"을 사용하여 데이터를 정규화하는 방법은 조직의 이질성과 스팟에 걸친 카운트의 매우 높은 분산을 감안할 때 로그 정규화와 비교하여 다운스트림 분석을 향상시키는 것으로 입증되는 방법입니다.

결과

다양한 하류 분석에 사용하기 위한 기계적 및 효소적 해리 또는 동결보존의 조합을 사용하는 장간막 동맥으로부터의 ECs의 분석이 여기에 묘사되어 있다(그림 1). ECs는 다음 단계를 이용하여 장간막 동맥에서 프로파일링될 수 있다: A) 콜라게나제 소화와 결합된 내막으로부터의 기계적 해리 배양 세포; B) scRNA-seq에 대한 단일 세포 현탁액의 생성; 또는 C) 동맥의 단면은 공간 전...

토론

제시된 워크플로우에서는 단일 세포 및 공간 분해능을 사용하여 단일 인간 동맥에서 EC를 프로파일링하는 일련의 기술에 대해 자세히 설명합니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계와 제한 요소가 있습니다. 전사체 프로파일링의 한 가지 핵심은 조직의 신선도와 RNA 무결성입니다. RNA 분해를 최소화하기 위해 처리하기 전에 가능한 한 많은 얼음 위에 조직을 유지하는 것이 중요합니다. 전형적으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
23G needles	BD	305145
2-methylbutane	Thermo Fisher	AC327270010
40 µm strainer	Fisher	14100150
4200 TapeStation System	Agilent Technologies	G2991BA
5 mL tube	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
Attachment factor	Cell Applications	123-500	Attachment reagent in the protocol
Black wax			Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Chloroform	Fisher	C607
Collagenase D	Roche	11088866001
Cryostat	Leica
Cryostat brushes
D-Glucose	Fisher	D16-1
Dimethyl sulfoxide	Fisher	MT25950CQC
Dispase II	Roche	4942078001	Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
D-PBS	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Hemocytometer	Fisher	267110
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer	Agilent Technologies	5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape	Agilent Technologies	5067-5584
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol	Fisher	BP26324
KCl	Fisher	P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Metal cannister
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium	Cell Applications	111-500
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound	Fisher	4585
Plastic cryomolds	Fisher	22363553
RNA screen tape	Agilent Technologies	5067-5576
RNA screen Tape sample buffer	Agilent Technologies	5067-5577
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B	RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides	Fisher	1518848
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red	Thermo Fisher	12605010	Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns	10X Genomics	PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns	10X Genomics	PN-1000184