Organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a cultura dos organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável de câmara dupla. São descritos os suportes permeáveis, a manutenção da monocamada e os experimentos subsequentes de permeabilidade de drogas.

Resumo

O sistema de suporte permeável é tipicamente usado em conjunto com as tradicionais linhas celulares bidimensionais (2D) como uma ferramenta in vitro para avaliar a permeabilidade oral de novos candidatos a medicamentos terapêuticos. No entanto, o uso dessas linhas celulares convencionais tem limitações, como expressão alterada de junções apertadas, diferenciação celular parcial e ausência de receptores nucleares chave. Apesar dessas deficiências, os modelos Caco-2 e MDCK são amplamente aceitos e validados para a previsão da permeabilidade oral in vivo humana.

Os cães são um modelo translacional relevante para pesquisas biomédicas devido às suas semelhanças na anatomia gastrointestinal e na microflora intestinal com humanos. Assim, e em apoio ao desenvolvimento paralelo de medicamentos, a elaboração de uma ferramenta in vitro eficiente e precisa para prever características in vivo de permeabilidade de medicamentos tanto em cães quanto em humanos é altamente desejável. Tal ferramenta poderia ser o sistema organoide intestinal canino, caracterizado por estruturas epiteliais tridimensionais (3D), auto-montadas derivadas de células-tronco adultas.

O (1) Protocolo de Sementemento de Suporte Permeável descreve os métodos experimentais para dissociar e semear organoides caninos nas pastilhas. O isolamento, a cultura e a colheita organoides caninas foram previamente descritos em um conjunto separado de protocolos nesta edição especial. Os métodos de manutenção geral da monocamada organoide intestinal canina são discutidos minuciosamente no (2) Protocolo de Manutenção de Monocamadas. Além disso, este protocolo descreve métodos para avaliar a integridade estrutural da monocamadas através de medições de resistência elétrica transepitelial (TEER) e microscopia leve. Finalmente, o (3) Protocolo Experimental de Permeabilidade descreve as tarefas diretamente anteriores a um experimento, incluindo validação in vitro de resultados experimentais.

No geral, o modelo organoide canino, combinado com uma tecnologia de cultura celular de câmara dupla, supera limitações associadas a modelos experimentais 2D, melhorando assim a confiabilidade das previsões da aparente permeabilidade oral dos candidatos a medicamentos terapêuticos tanto no paciente canino quanto no humano.

Introdução

Sistemas de suporte permeáveis são tipicamente usados para determinar a aparente permeabilidade dos candidatos a medicamentos terapêuticos através da barreira epitelial intestinal ^1,2. Eles também podem ser empregados para avaliar a secreção celular³, migração celular⁴ e toxicidade de drogas⁵. Ensaios de permeabilidade de medicamentos orais in vitro são um passo fundamental no processo de descoberta e desenvolvimento de drogas², com candidatos individuais a medicamentos sendo testados na fase inicial do ciclo de vida da droga P&D⁶. O sistema de suporte permeável é um aparelho de cultura celular de câmara dupla que consiste em uma inserção com uma membrana semiporosa colocada em uma placa multiwell. Este sistema permite acesso direto aos lados apical e basolateral de uma monocamada celular cultivada na pastilha⁷. A monocamada usada nesses sistemas é tipicamente derivada de células epiteliais gastrointestinais (por exemplo, linha celular colorretal humana Caco-2)⁸. Culturas celulares crescem em um estado polarizado imitando a microarquitetura natural das células epiteliais intestinais, permitindo maior diferenciação celular, microanato semelhante e função⁷. Os detalhes da inserção de suporte permeável podem ser encontrados na Figura 1. A semeadura das pastilhas com culturas celulares 2D, tradicionalmente utilizadas para avaliar a permeabilidade de medicamentos intestinais, é relativamente acessível e fácil de cultivar⁹. Esses sistemas apresentam várias limitações importantes, incluindo sua capacidade limitada de prever o metabolismo intestinal dos candidatos a medicamentos terapêuticos^10,11. Isso é verdade para todos os mecanismos de absorção de drogas, seja absorção passiva através das junções apertadas entre as células epiteliais, absorção transepitel ativa através de efflux, ou transportadores de captação (por exemplo, P-glicoproteína, transporte monocarboxilato 1), e drogas metabolizadas por enterócitos.

Os cães compartilham um ambiente comum e dieta com humanos¹². Anatomia intestinal canina e a composição do microbioma se assemelham muito à dos humanos¹³, que tem sido atribuída à domesticação e dietas compartilhadas nos últimos 36.000 anos¹⁴. Infelizmente, essas semelhanças também podem ser causas/gatilhos comuns para o desenvolvimento de doenças. Os cães desenvolvem morbidades crônicas semelhantes aos seres humanos, como obesidade¹⁵, doença inflamatória intestinal¹⁶, adenocarcinoma colorretal¹⁷, tumor estromal gastrointestinal (GIST)¹⁸, e várias outras patologias associadas à sua relativa longevidade¹⁹. Assim, os organoides caninos podem ser utilizados com sucesso para pesquisas translacionais reversas dessas doenças multifatoriais crônicas no espírito da One Health Initiative²⁰.

As células caco-2 são as linhas celulares mais usadas para ensaios de absorção oral^{de drogas 21}. Essas células são atualmente consideradas o modelo "padrão-ouro" para ensaios in vitro de permeabilidade intestinal ^2,22,23. A linha celular Caco-2 expressa transportadores efflux e de absorção encontrados no trato intestinal humano, embora em diferentes níveis de expressão 24,25,26. As células caco-2 também são amplamente utilizadas como modelos para determinar se uma droga é um substrato ou inibidor de transportadores efflux intestinais^22,27. Embora as células Caco-2 sejam de origem colonica, elas imitam uma célula enterócito. Infelizmente, as células caco-2 representam apenas um tipo de célula da camada epitelial do intestino delgado⁹, que não consegue recapitular a complexa composição do tipo de célula epitelial intestinal com precisão. Por exemplo, células de cálice dedicadas à produção de muco estão ausentes das culturas Caco-2, de tal forma que as interações muco-droga não podem ser avaliadas sem cocultura com outras linhas^{celulares 28}. Além disso, as culturas caco-2 não expressam vários dos importantes receptores nucleares tipicamente presentes no intestino, como o receptor pregnane X (PXR), o receptor de esteroides X (SXR) e o receptor androstane constitutivo (CAR)²⁹. Consequentemente, as culturas caco-2 não conseguem modelar a indução de transportadores de drogas e enzimas por certas drogas que são indutores desses receptores (por exemplo, rifampin)³⁰.

A tecnologia organoide intestinal 3D aborda algumas dessas limitações¹⁹. Organoides são construções auto-montadas derivadas de células-tronco adultas que podem ser estabelecidas a partir de amostras de tecido colhidas usando técnicas microinvasivas²⁰. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem estão sendo empregadas para modelos de permeabilidade intestinal^31,32. Os organoides caninos fornecem uma alternativa relevante aos organoides humanos porque a pesquisa de células-tronco humanas é restrita por questões éticas³³. Além disso, os organoides caninos fornecem um sistema in vitro para explorar a permeabilidade de drogas caninas, metabolismo, transporte ativo e interações medicamentosas. Para suprir essa lacuna tecnológica, foi descrito³⁴ o crescimento consistente e confiável dos organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável. Um ensaio de permeabilidade com organoides intestinais caninos pode potencialmente prever a permeabilidade intestinal canina e o metabolismo de pequenas moléculas de drogas em comparação com ensaios atualmente usados (Caco-2). A confirmação dessas características fundamentais dá este novo sistema in vitro para trabalhos futuros explorando o impacto potencial dos indutores no metabolismo intracelular e no transporte ativo.

Os organoides caninos são compostos de todos os tipos de células tipicamente presentes na camada epitelial do intestino. A partir de uma visão funcional e microanatópica, eles replicam de forma confiável o ambiente da camada epitelial do intestino canino ^19,35. Além disso, a presença de muco, transportadores e enzimas de drogas específicas da canina e a diferenciação celular geral em organoides intestinais caninos é comparável ao que é visto in vivo em cães³⁴. Assim, os organoides podem ser isolados de pacientes veterinários doentes e utilizados para modelar o efeito de vários processos da doença (por exemplo, inflamação intestinal crônica) na permeabilidade da droga oral canina^19,36. O sistema organoide intestinal canino também pode ser usado em outras configurações do que experimentos de permeabilidade de drogas. Essas estruturas 3D também podem ser isoladas de pacientes doentes como descrito anteriormente por Chandra et al. para doença inflamatória intestinal, adenocarcinoma colorretal e tumor estromal gastrointestinal¹⁹.

O Protocolo de Sementes de Suporte Permeável descreve métodos para estabelecer culturas organoides intestinais caninas nas pastilhas. Este primeiro protocolo descreve métodos para dissociar culturas organoides caninas estabelecidas banhadas na matriz de membrana extracelular. Além disso, o pré-revestimento das pastilhas com colágeno I e a matriz de membrana extracelular é discutido neste protocolo. A incorporação de organoides caninos nas pastilhas de suporte permeáveis também é descrita em detalhes.

O segundo protocolo é o Protocolo de Manutenção de Monocamadas, que inclui a manutenção geral de organoides 3D caninos emplacados em uma inserção. A frequência e os volumes da mídia organoide utilizada para refrescar a cultura, e formas de prevenir danos à cultura celular, são apresentados neste segundo protocolo, juntamente com métodos experimentais para avaliar a confluência da monocamada epitelial.

Finalmente, o Protocolo Experimental de Permeabilidade se concentra em maneiras de determinar se os organoides 3D intestinais caninos em um ensaio de permeabilidade estão prontos para uso experimental e as etapas de verificação necessárias antes de realizar qualquer experimento. Esta seção também descreve a configuração e a execução bem sucedida de um experimento de permeabilidade, juntamente com a incubação e amostragem de candidatos a medicamentos terapêuticos nas câmaras da cultura monocamada. Também é discutido o uso do isothiocyanato de fluoresceína de baixa permeabilidade (FITC-dextran) para monitorar a integridade da monocamada. Finalmente, um método de avaliação in vitro para validação dos resultados após a conclusão de um experimento é descrito. Os experimentos de permeabilidade são um tema extremamente vasto e são muito bem resumidos por Hubatsch et ^al.37. O fluxo de trabalho dos protocolos é resumido na Figura 2.

Figura 1: Organoides intestinais caninos em um sistema de suporte permeável. A inserção de suporte permeável está posicionada em um poço de uma placa de 24 poços. A membrana microporosa permite a semeadura de organoides intestinais caninos dissociados, e essas células eventualmente formarão uma monocamada organoide 2D. Esta tecnologia permite o acesso tanto aos lados AP quanto BL da monocamheira. O meio organoide é introduzido nas câmaras AP e BL do suporte permeável. A absorção (AP→BL) e a secreção (BL→AP) do candidato à droga são ilustradas, bem como dois modos possíveis de transporte de drogas. Abreviaturas: AP = apical; BL = basolateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho de protocolos de suporte permeáveis organoide canino. A inserção de suporte permeável é pré-revestida com uma mistura da matriz de membrana extracelular e colágeno I e incubada por 1h. Durante o processo de incubação, a cultura organoide é dissociada. As células organoides individuais são semeadas na inserção, o meio na câmara basolateral é adicionado imediatamente após a semeadura, enquanto o médio à câmara apical é adicionado 24h após o processo de semeadura concluído. A manutenção e o monitoramento dos organoides incluem alterações médias regulares, medidas de valor TEER e microscopia leve para avaliar a integridade da monocamada. Antes do experimento, os organoides devem ser diferenciados removendo o inibidor rock e gskiβ da mídia. Os valores do TEER são medidos no dia do experimento, e a monocamada organoide é inspecionada através de microscopia leve para danos às células. O medium é então trocado por um buffer apropriado e incubado antes do experimento. O ensaio FITC-dextran é usado durante experimentos de permeabilidade intestinal³⁹ como um marcador de integridade de monocamadas. As medições de TEER são tomadas após o experimento, e a microscopia leve validará os resultados após 24 horas. Abreviaturas: TEER = resistência elétrica transepitelial; ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; F = fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

A pesquisa foi aprovada e realizada em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Iowa (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). A seção a seguir (etapas 1.1-1.3) descreve o Protocolo de Sementemento de Suporte Permeável, e os procedimentos são resumidos na Figura 3.

Figura 3: Fluxo de trabalho do protocolo de semeadura de suporte permeável. As pastilhas de suporte permeáveis são pré-revestidas com uma combinação de CMGF+ R/G, colágeno I e a matriz de membrana extracelular e posteriormente incubadas. A mídia da cultura organoide canina é aspirada e substituída por uma Solução de Recuperação celular, seguida por uma incubação de 30 minutos a 4 °C. A cultura é posteriormente transferida para um tubo, e a dissociação organoide é realizada usando protease semelhante à trippsina. Organoides não dissociados são removidos por passagem através de um coador para obter uma suspensão de célula única, e a concentração celular é determinada usando um hemócito ou um contador celular automatizado. As células são semeadas em uma inserção de suporte permeável, e CMGF+ R/G é adicionado à câmara basolateral. A cultura é então incubada por 24 h, e o líquido restante é removido da câmara apical e substituído por abreviaturas CMGF+ R/G. Abreviaturas: ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Protocolo de semeadura de suporte permeável

1. Pré-revestimento das pastilhas de suporte permeáveis
   1. Prepare o meio completo com fatores de crescimento aprimorados com o inibidor de proteínas associadas a Rho (ROCK) e o inibidor glycogen synthase kinase-beta (GSKiβ) (CMGF + R/G) de acordo com as informações da Tabela 1.
   2. Prepare um balde de gelo e comece a descongelar a matriz de membrana extracelular no gelo. Coloque uma placa de 24 poços contendo o número necessário de pastilhas na incubadora para pré-aquecimento. Colete colágeno traseiro de rato I (3 mg/mL) e coloque-o no gelo enquanto protege contra a luz. Colete CMGF + R/G e coloque-o no gelo.
   3. Calcule o número total de pastilhas e espaços em branco necessários para o experimento, mantendo de lado 100 μL da solução de revestimento para cada inserção.
      NOTA: Prepare mais solução de revestimento do que o necessário; preparar pelo menos 15% a mais do que o necessário é recomendado.
   4. Em um tubo de 15 mL, misture CMGF+ R/G com a matriz de membrana extracelular (1%) e colágeno I (1%) e mistura de tubulação suave.
   5. Cubra cada inserção de poliéster com 100 μL da solução de revestimento e coloque as pastilhas na incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de CO₂ ) por 1h.
   6. Após a incubação, aspire cuidadosamente a solução de revestimento de cada inserção usando um aspirador de vácuo ou uma pipeta P1000, tomando cuidado para não perturbar o filtro de inserção. Coloque uma placa pré-revestida na incubadora para se manter aquecido.
2. Dissociação organoide canina
   NOTA: Use organoides caninos que foram cultivados por pelo menos quatro dias. Antes de iniciar a dissociação, consulte Gabriel et ^al.38 para determinar quando uma amostra é saudável, densa e suficiente para experimentação. Recomenda-se dissociar um poço extra de organoides para cada procedimento de revestimento de poços. Além disso, recomenda-se aumentar o número desejado de inserções em ~20% para explicar o crescimento organoide desigual ou danos causados pela manipulação inadequada. Se estiver planejando usar fitc-dextran, prepare poços extras.
   1. Prepare um balde de gelo e um frasco de estoque DMEM/F12 avançado de 1x no armário de biossegurança.
   2. Coloque a matriz de membrana extracelular no gelo para começar a descongelar, submergindo-a no gelo para proteger contra o degelo rápido e evitar a solidificação. Coloque uma caixa de pontas de pipeta (P200) no congelador para o revestimento da matriz de membrana extracelular.
   3. Prechill uma centrífuga refrigerada a 4 °C.
   4. Mova CMGF+ R/G do congelador/geladeira para um banho de água de 37 °C. Evite exposição direta à luz quando possível.
   5. Remova todo o meio da placa de 24 poços com cultura organoide para um número adequado de poços (1 poço de uma placa de 24 poços por 2-4 inserções) enquanto toma cuidado para não perturbar a matriz de membrana extracelular.
      NOTA: O volume pode variar dependendo do sistema de contagem de células utilizado.
   6. Adicione 0,5 mL de solução de recuperação celular pré-afinada por poço para dissolver as cúpulas da matriz de membrana extracelular.
   7. Incubar a placa na geladeira (4 °C) por 30 min.
   8. Pipete a suspensão, colete todos os organoides e dissolvido matriz de membrana extracelular, e transfira-os para um tubo de 15 mL.
   9. Centrífuga (700 × g por 5 min a 4 °C) e remova o supernasce até que o nível atinja a marca de 0,5 mL, certificando-se de não perturbar a pelota.
   10. Adicione 1 mL da protease semelhante à trippsina e incubar no banho de água de 37 °C por 8 min. Flick o tubo várias vezes durante o período de incubação para misturar as células.
   11. Transfira o tubo com a amostra de volta para um gabinete de biossegurança e adicione lentamente 7 mL de DMEM/F12 avançado prechilled para inativar a protease semelhante à trippsina e parar a dissociação celular.
   12. Prewet um coador de células de 40 μm com 1 mL de DMEM/F12 avançado. Em pipeta suavemente a mistura e filtre a suspensão; pipeta adicional DMEM/F12 avançado para enxaguar o coador.
   13. Centrifugar o tubo (700 × g por 5 min a 4 °C) e remover o sobrenatante. Não perturbe a pelota.
   14. Resuspend a pelota celular em ~50-100 μL de meio de cultura (CMGF+ R/G) para cada poço de organoides que foi dissociado.
   15. Conte uma subsamplena da suspensão (~10 μL) usando um hemócito ou máquina apropriada e determine o número total da célula na suspensão.
3. Semeadura organoide canina
   1. Diluir ou concentrar a suspensão celular para obter uma concentração celular de ~75.000 células por mL.
   2. Semente 100 μL da suspensão em cada inserção usando pontas pré-revestidas de BSA (1%) para evitar a adesão celular durante a transferência. Adicione uma inserção revestida como um branco livre de células sem que nenhum organoides cresça enquanto ainda recebe alterações regulares na mídia.
   3. Gire suavemente a placa em um movimento circular para ~30 s para dispersar as células semeadas através da pastilha. Confirme através de microscopia leve a distribuição uniforme das células.
   4. Adicione 700 μL de CMGF + R/G à câmara basolateral e coloque a placa na incubadora (37 °C; 5% de co₂ atmosfera) por 24 h.
   5. Após 24 horas, remova suavemente a suspensão celular da câmara apical e substitua-a por 200 μL de CMGF + R/G. Devolva a placa à incubadora.

2. Protocolo de manutenção de monocamadas de células organoides

NOTA: A seção a seguir (etapas 2.1-2.2) descreve o protocolo de manutenção da monocamada de células organoides. O fluxo de trabalho dos procedimentos apresentados neste protocolo está resumido na Figura 4. Uma tabela para anotações que podem ajudar na padronização das medidas de valor do TEER é apresentada na Tabela Suplementar 1.

Figura 4: Fluxo de trabalho da manutenção da cultura de suporte permeável. Os valores TEER são medidos usando eletrodos (sondas) e um medidor volt/ohm. As sondas devem ser esterilizadas quimicamente com 70% de álcool antes de serem inseridas nos poços. As pastilhas de células em branco e organoide são medidas, e os valores teer são calculados. O meio é posteriormente atualizado em câmaras apical e basolateral, e a cultura organoide canina na pastilha é visualizada usando microscopia leve. Lágrimas na cultura organoide ou membrana microporosa são notadas e tratadas de acordo com o protocolo. Abreviação: TEER = resistência elétrica transepitelial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Medição de valor TEER
   NOTA: As medidas de valor TEER são realizadas utilizando um Medidor de Volt/Ohm Epitelial com fixação de pauzinho. Consulte as instruções de uso do fabricante. Os valores teer fornecem informações sobre a integridade da monocamide organoide canina.
   1. Faça medições de valor teer em todos os dias alternativos durante o crescimento da cultura celular.
   2. Mova o Medidor Epitelial Volt/Ohm e seus eletrodos para o armário de biossegurança. Esterilize quimicamente os eletrodos em 70% de álcool antes do uso. Defina a função para Ohms. Espere pelo menos um minuto até os eletrodos secarem.
   3. Antes de fazer a primeira medição, insira o eletrodo do fio na porta e ligue a energia. Certifique-se de que o medidor exibe 1.000 Ω com a inserção de eletrodo de fio em vez de medir pauzinhos. Se este não for o caso, ajuste o dispositivo.
   4. Insira os eletrodos na câmara apical e basolateral da inserção livre de células (em branco), de modo que a câmara apical contém o eletrodo mais curto, e a câmara basolateral contém o eletrodo mais longo (como visto na Figura 4). Não toque na membrana, mas, ao mesmo tempo, certifique-se de que os eletrodos estão submersos no meio.
   5. Aguarde alguns segundos até que o valor se estabilize e anote o valor em um livro de laboratório. Meça as demais monocamadas organoides caninas, certificando-se de esterilizar os eletrodos com 70% de álcool ao medir diferentes amostras. Tome cuidado para não tocar na monocamada organoide com o eletrodo.
   6. Após as medições, esterilize os eletrodos com 70% de álcool pela última vez. Certifique-se de protegê-los de danos causados por manipulação inadequada e armazená-los de acordo com as instruções do fabricante.
   7. Calcule os valores teer para cada poço usando Eq (1), onde_{a amostra} R e R_{em branco} são os valores ohm (Ω) dos poços monocamadas e em branco, respectivamente, e a área (cm²) é a da inserção.
      (1)
2. Manutenção de monocamadas
   NOTA: Revise o plano de alteração média recomendado na Tabela 2.
   1. Usando tubos pasteur descartáveis estéreis de 9" e um aspirador de vácuo, aspire suavemente o meio a partir do apical e, em seguida, as câmaras basolaterais. Incline a placa para ver claramente a superfície média. Evite aspirar muito perto da membrana microporosa na câmara apical para evitar danos à monocamada celular.
      NOTA: Use uma nova tubulação Pasteur quando se mover entre as amostras. Pipetas também são uma possível substituição para este procedimento.
   2. Adicione lentamente CMGF+ R/G usando pipetas P1000 visando uma parede da câmara apical ou basolateral. Realize a mudança média na câmara apical com muito cuidado para evitar danificar a monocamadas.
   3. Verifique os poços a cada dois dias sob um microscópio leve, avaliando a saúde da cultura e monitorando as lágrimas na monocamada organoide ou na membrana microporosa. Use microscopia de contraste de fase para destacar detalhes da cultura.
      NOTA: No caso de lágrimas monocamadas organoides caninas, a monocamadas tem tempo para se recuperar e voltar a crescer. No caso de lágrimas de membrana microporosa, o poço deve ser excluído do experimento.

Tabela 2: Recomendação de mudança de mídia para culturas organoides. CMGF+ R/G é alterado na câmara apical e basolateral dos poços a cada dois dias em todos os dias alternativos. O período de cultura mais longo durante o fim de semana exige um aumento do volume de médias tanto em câmaras basolaterais quanto apical, que é aplicada em uma tarde de sexta-feira e alterada na segunda-feira. Abreviaturas: ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ. Clique aqui para baixar esta Tabela.

3. Protocolo experimental de permeabilidade

NOTA: A seguinte seção (etapas 3.1-3.5) descreve o Protocolo Experimental de Permeabilidade. O fluxo de trabalho do protocolo experimental para medir a permeabilidade in vitro de uma droga é resumido na Figura 5.

Figura 5: Fluxo de trabalho do protocolo experimental. O meio organoide deve ser alterado de CMGF+ R/G para CMGF+ entre oito e doze dias após a semeadura das pastilhas, permitindo a diferenciação celular. Depois de mudar o meio (apical e basolateral) para CMGF+, os valores teer ainda devem estar aumentando, com a monocameira organoide canina quase atingindo a confluência. Pelo menos quatro dias após a alteração do meio para CMGF+, a prontidão das monocamadas é avaliada. Quando a monocamada é completamente formada, e os valores TEER atingem uma fase de platô (tipicamente entre 1.500 e 2.500 Ω.cm²), o meio é trocado pelo tampão de transporte por 30 minutos para permitir que a monocamada se ajuste ao novo ambiente. No momento 0 min do experimento, é realizado o ensaio FITC-dextran, e a amostra basolateral de 20 min é coletada. Os resultados são posteriormente analisados em um leitor de placas. Após o experimento, os conteúdos da câmara apical e basolateral são novamente alterados para CMGF+, e as leituras de valor do TEER são tomadas. As monocamadas são incubadas por 24 h, e a integridade da monocamada é avaliada através de repetidas medições de TEER. Abreviaturas: TEER = resistência elétrica transepitelial; ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ; CMGF+ = Meio completo com fatores de crescimento, mas sem inibidor de ROCHA ou GSKiβ; FITC = isocitonato de fluoresceína; F = fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Avaliação da prontidão organoide monocameira
   NOTA: Esta etapa ocorre de 8 a 14 dias após a semeadura.
   1. Verifique a monocameira pelo menos a cada dois dias sob o microscópio de luz (use o contraste de fase para visualizar a integridade da monocamadas). Continue até o próximo passo quando a monocamada celular estiver totalmente formada sem lacunas ou sinais aparentes de lágrimas.
   2. Altere o meio organoide de CMGF+ R/G para CMGF+ (excluindo inibidor de ROCHA e GSKiβ da composição média). Recomenda-se trocar o meio pelo menos quatro dias antes do experimento.
      NOTA: Esta etapa permitirá a adequada diferenciação da monocamide organoide.
   3. Continue medindo os valores do TEER aproximadamente a cada dois dias. Quando os valores do TEER começarem a subir em aproximadamente 1.500 a 2.000 Ω × cm² (Figura 6), meça os valores do TEER todos os dias.
      NOTA: Este estado estável pode ser mantido por aproximadamente 2-3 dias, que é a janela ideal de tempo para realizar testes de permeabilidade (geralmente nos dias 11 a 13). Os valores do TEER do planalto podem oscilar ligeiramente com base na localização intestinal dos organoides, temperatura de medição, raça, idade e estado da doença do cão.
   4. Agende o ensaio de permeabilidade da droga imediatamente para evitar uma rápida diminuição nos valores de TEER ou crescimento excessivo da monocamada organoide para múltiplas camadas celulares.
2. Preparando-se para o experimento
   NOTA: Os agitadores da incubadora podem ser usados durante o experimento para evitar os efeitos da camada de água não colocada. Meça os valores do TEER a temperaturas consistentes.
   1. No dia do experimento, meça os valores do TEER e confirme que os valores atingiram um estado estável e não estão diminuindo rapidamente.
   2. Escolha as melhores monocamadas (via microscopia leve e valores TEER) a partir do excesso de 20% de pastilhas para realizar o experimento.
   3. Observe as monocamadas sob um microscópio leve e exclua monocamadas organoides incompletas, rasgadas ou supercultivadas.
   4. Prepare o buffer de transporte e ajuste seu pH aos valores desejados.
      NOTA: A composição do buffer experimental difere com base na configuração experimental. Um buffer frequentemente utilizado é composto por Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), glicose (12,5 mM) e 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, 25 mM). Esta composição garante a viabilidade da cultura organoide durante um experimento.
   5. Aspire cuidadosamente o meio das câmaras apical e basolateral dos poços selecionados.
   6. Adicione 200 μL de tampão de transporte à câmara apical e 800 μL à câmara basolateral.
      NOTA: O tampão de transporte deve ser primeiro adicionado à câmara apical e, em seguida, à câmara basolateral para evitar o descolamento da monocamado da membrana microporosa.
   7. Coloque a placa na incubadora (37 °C; 5% co₂ atmosfera) por 30 minutos para equilibrar.
      NOTA: As monocamadas organoides caninas estão agora prontas para o experimento de permeabilidade da droga.
3. Solução de concentração típica de layout experimental IgY
   NOTA: O design experimental e o layout podem mudar dependendo da questão da pesquisa. A permeabilidade da imunoglobulina Y (IgY) através de uma monocamada organoide é usada no protocolo como exemplo e pode ser modificada. O termo câmara de doadores refere-se à câmara onde a droga é inicialmente aplicada, enquanto a câmara receptora refere-se à câmara que aceita a droga da câmara de doadores. Um experimento típico coleta amostras nas câmaras receptoras acima de 2 h (por exemplo, 15, 30, 60, 90, 120 min).
   1. Prepare a solução IgY (droga ou soluto de escolha) dissolvendo-a no tampão de transporte para a concentração final desejada. Prepare mais solução de drogas do que o necessário.
      NOTA: Medicamentos com baixa solubilidade aquosa podem ser primeiro dissolvidos em um solvente orgânico (por exemplo, etanol, DMSO) antes de adicionar ao buffer. A concentração final do solvente deve ser inferior a 1% para não danificar a monocamada celular.
   2. Remova o tampão da câmara do doador (câmara apical ou basolateral) de cada poço.
   3. Adicione a solução IgY (solução de medicamentos) a todas as câmaras de doadores. Use a solução restante como a solução de doador time 0 para a medição da concentração inicial de medicamentos.
   4. Nos pontos de tempo necessários, remova 50 μL da câmara receptora e coloque-a em um tubo rotulado. No último ponto, remova uma amostra da câmara do doador. No final do experimento, transfira as alíquotas do doador e do receptor para um congelador de -20 °C.
      NOTA: Se forem necessários muitos pontos de tempo, a substituição do buffer na câmara receptora pode ser feita, mas deve ser contabilizada no cálculo da permeabilidade aparente. A concentração na câmara receptora não deve atingir mais de 10% da câmara de doadores no final do experimento para manter as condições de pia⁴⁴.
4. Controle de qualidade da monocamada celular organoide
   NOTA: A solução FITC-dextran pode ser usada para confirmar a integridade da monocamadas durante o experimento. FITC-dextran é usado como exemplo de um ensaio de integridade de monocamadas. Outros incluem amarelo Lúcifer, PEG-4000, manitol radiolabeled, e inulina⁴⁴.
   1. No momento 0 min, aspire o conteúdo da câmara apical e substitua por 250 μL de solução FITC-dextran (5 mg/mL, 4 kDa) em triplicado para cada grupo experimental.
      NOTA: Não exponha fitc-dextran à luz.
   2. Depois de 20 min, remova o tampão da câmara basolateral.
   3. Meça a intensidade de fluorescência da amostra basolateral usando um leitor de placa de fluorescência (use uma curva de calibração; excitação fixada em 485 nm e valor de emissão em 528 nm).
      NOTA: O_aplicativo P do FITC também pode ser calculado usando o método descrito na discussão.
   4. Após o experimento concluído, aspire cuidadosamente o excesso de tampão das câmaras apical e basolateral.
   5. Adicione 200 μL de CMGF+ na câmara apical e 700 μL à câmara basolateral.
   6. Medir os valores do TEER nos poços individuais.
   7. Coloque a placa na incubadora (37 °C; 5% co₂ atmosfera) por 24 h.
   8. Se aplicável, após 24h, meça os valores do TEER para avaliar possíveis danos à monocamada durante a parte de controle de qualidade do experimento. Use microscopia leve para visualizar a integridade da monocamide organoide canina.
5. Fixação de monocamadas celulares para análise a jusante
   1. Preparar a solução formalina-acetic ácido-álcool (FAA, composição na Tabela 1).
   2. Remova o tampão de transporte ou CMGF+ das câmaras apical e basolateral usando um tubo P1000 ou estéril descartável de 9" canos pasteur e um aspirador de vácuo.
   3. Encha as câmaras apical e basal com a FAA.
   4. Depois das 24h, aspire a FAA e substitua-a por 70% de etanol.
   5. Enrole a placa com filme de laboratório flexível para evitar a evaporação e proceda à preparação do bloco.

Figura 6: Valores teer entre grupos experimentais. Os valores de TEER foram medidos em cinco grupos de monocamadas organoides intestinais caninas. Três grupos eram compostos por enteróides jejunas caninos, e dois grupos consistiam em colonóides. Cada grupo incluiu de 12 a 22 réplicas. Os valores teer para culturas enteróides jejunas são mostrados do dia 4 ao dia 14, e culturas colonóides são mostradas do dia 4 ao dia 12 (as medidas terminaram quando a monocameira organoide atingiu valores de estado estável, indicando que a monocameira estava pronta para uso experimental). As barras de erro expressam SEM das medidas. Abreviação: TEER = resistência elétrica transepitelial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Procedimentos operacionais padrão para a cultura dos organoides caninos foram previamente descritos³³, e o Protocolo Organoide Canino também foi discutido detalhadamente nesta edição especial³⁸. Organoides intestinais caninos cultivados em suportes permeáveis foram fixos e incorporados para parafina para examinar a micronatomia da monocamada e das populações celulares. O processo de incorporação de parafinas foi previamente discutido por Gabriel et ^al.38. A coloração de rotina (hematoxilina e eosina) foi realizada, e a técnica de coloração azul alciana foi usada para detectar células de cálice na monocamada organoide canina (ver Figura 7).

Figura 7: Coloração monocameira organoide intestinal canina. Organoides intestinais caninos de origem colonica no suporte permeável foram incorporados e manchados com H&E e AB. Imagens representativas foram tiradas usando microscopia leve em 40x (A) e 60x (B). A coloração de H&E revela uma monocamada epitelial colunaar, e os microvilli na parte apical das células podem ser observados na ampliação de 60x. A coloração AB revela ainda a presença de células de cálice (azul escuro) na monocamada organoide intestinal canina. Barras de escala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; AB = Azul Alciano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A cultura organoide no suporte permeável deve ser cultivada por 10 a 14 dias para estar pronta para um experimento de permeabilidade. A microscopia leve é usada em conjunto com as medidas de valor teer para confirmar a prontidão da cultura organoide para testes de permeabilidade de candidatos a medicamentos. Imagens microscópicas leves representativas de diferentes monocamadas organoides caninas de animais saudáveis e doentes são apresentadas na Figura 8.

Figura 8: Microscopia monocamide organoide intestinal canina. Imagens de monocamadas em crescimento, como visto sob microscopia leve. As monocamadas organoides derivadas de doadores saudáveis são representadas por culturas enteróide jejunal (10x; 40x) e colonóide (20x; 40x). As monocamadas organoides de doadores doentes são representadas por enteróides duodenais (5x; 10x) e ileais (5x; 10x) derivados de um paciente canino diagnosticado com PLE. Ambas as culturas organoides PLE são exemplos de isolamento celular inadequado durante a semeadura de organoides, e essas culturas não poderiam ser usadas para ensaios de permeabilidade de drogas devido à presença de organoides 3D. Exemplos de desvios da formação adequada de monocamadas, como as lágrimas de monocamadas (5x), são causados pela manipulação descarada das amostras biológicas. A cultura prolongada de organoides (10x; 20x) é causada pela longa manutenção dos organoides na inserção quando os organoides começam a se assemelhar à sua estrutura 3D original. Para comparação, são apresentadas imagens de linhas celulares 2D tradicionais nos suportes permeáveis utilizados comumente para estudos de permeabilidade de medicamentos (MDCK-10x; 40x e Caco-2-10x; 20x). Abreviaturas: PLE = enteropatia que perde proteínas; MDCK = Rim canino Madin-Darby. Barras de escala = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As monocamadas organoides também foram fixadas em 3% de paraformaldeído-3% glutaraldeído em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi utilizada para caracterizar a ultraestrutura da cultura organoide nos suportes permeáveis. Estruturas microanatomômicas de microvilli e junções apertadas podem ser vistas na Figura 9.

Figura 9: Imagens TEM de monocamadas organoides intestinais caninas saudáveis. FOI utilizado para revelar a microarquitetura celular de monocamadas organoides jejunal (A), ileal (B) e coloniais (C). A membrana microporosa da inserção de suporte permeável é marcada com uma seta amarela. A presença de microvilli (seta azul) e junções apertadas (seta vermelha) é delineada nas imagens. Abreviação: TEM = Microscopia eletrônica de transmissão. Barras de escala = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ambas as medições teer e microscopia leve devem ser realizadas para garantir que o sistema esteja pronto para testes de permeabilidade. O ensaio está pronto para uso quando o TEER atingir um estado estável, enquanto a microscopia leve ajudará a excluir danos ou crescimento excessivo dos organoides. Um resumo das medições típicas de TEER de cinco grupos constituídos por enteróides jejunas caninos e colonóides é apresentado na Figura 6.

Tabela 1: Composição de mídia organoide e FAA. A composição completa de CMGF+, CMGF+ R/G e FAA estão resumidas nesta tabela. Abreviaturas: ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ; CMGF+ = Meio completo com fatores de crescimento, mas sem inibidor de ROCHA ou GSKiβ; FAA = ácido-álcool formalítico-acético; EGF =fator de crescimento epidérmico. Esta tabela é adaptada a partir de ³⁸. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela suplementar 1: Tabela para a anotação do organoide canino o sistema de suporte permeável. Abreviaturas: TEER = resistência elétrica transepitelial; ROCK = quinase associada a rho; GSKiβ = glicogênio synthase quinase beta; CMGF + R/G = Meio completo com fatores de crescimento aprimorados com inibidor de ROCHA e GSKiβ; CMGF+ = Meio completo com fatores de crescimento, mas sem inibidor de ROCHA ou GSKiβ. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Culturas organoides intestinais caninas no aparelho de suporte permeável são um conceito único que conecta os ensaios tradicionais de permeabilidade de drogas⁴⁰ com um novo modelo canino in vitro ⁴¹. Diferentes tipos de organoides intestinais caninos podem ser usados e avaliados com base no objetivo do experimento com ajustes mínimos. Recomenda-se testar múltiplas concentrações da droga de interesse em 3-4 poços por grupo. As concentrações podem ser baseadas na concentração intestinal esperada da droga. Além disso, o uso de pesquisas anteriores pode ajudar a determinar os pontos de tempo apropriados para o desenho do estudo. A documentação adequada do projeto do estudo deve ser feita para aumentar a replicabilidade e auxiliar na solução de problemas.

Essa tecnologia tem várias limitações devido à novidade do método⁴², principalmente pela falta de padronização no design experimental e execução do protocolo entre laboratórios. Essa falta de padronização tem sido reconhecida por outros grupos⁴³, e os Protocolos Monocamadas Organoides 3D caninos levarão à reprodutibilidade interlaboratória e introduzirão a padronização desse sistema. Abordagens padronizadas para análise de dados melhoram a replicabilidade e podem fortalecer os resultados de testes preliminares de drogas usando os organoides caninos no sistema de suportes permeáveis em diferentes laboratórios. O modelo organoide 3D canino também carece de conjuntos de dados comparando valores in vitro de_aplicativos P de drogas modelo com sua conhecida absorção intestinal humana ou canina, assim como células Caco-2 44,45,46. Uma vez gerados esses dados, este modelo organoide canino pode ser utilizado para avaliar a permeabilidade intestinal durante o desenvolvimento de medicamentos.

É crucial que se cuide ao semear os organoides no sistema de suporte permeável para semear uma densidade suficiente de células adequadamente dissociadas. Os valores TEER do sistema são mais confiáveis e reprodutíveis quando cultivados em monocamadas estritas. A cultura prolongada das monocamadas pode levar a um aumento exponencial dos valores do TEER que atingem ainda mais os valores fisiológicos do intestino. Seções de H&E dessas estruturas 3D mostram várias camadas de células acima umas das outras com estruturas alteradas de enterócitos mais próximas da membrana.

Após a expansão bem sucedida da monocamada organoide intestinal canina, os resultados podem ser analisados da mesma forma que os ensaios tradicionais de células 2D calculando a fórmula 44 do coeficiente de permeabilidade aparente de uma droga (_p) fórmula⁴⁴. O valor_{do aplicativo} P (ver Eq (2)) descreve a taxa de transporte através da monocamadas celular⁴⁷.

(2)

A inclinação inicial da concentração versus a curva de tempo (por exemplo, nmol/s). A é a área da inserção (cm²), e C₀ é a concentração inicial da droga ou composto na câmara^{de doadores 37}. O reconhecimento confiável da integridade da monocamada é uma parte crucial do ensaio de permeabilidade que exige padronização. Microscopia leve e medidas de TEER são recomendadas para avaliar organoides caninos em um sistema de suporte permeável e ajudar a determinar o tempo correto do experimento. Além disso, marcadores de permeabilidade molecular zero (por exemplo, FITC-dextran, amarelo Lúcifer, PEG-400) podem ser usados para avaliar funcionalmente a integridade da monocamada organoide. Deve-se prestar atenção se o composto testado for afetado por um transportador. P-glicoproteína (P-gp) é usada como um exemplo comum de bomba efflux. Uma razão efflux deve ser gerada (_{aplicativo P, aplicativo BL-AP}/P_{, AP-BL}) em comparação com um conhecido substrato de teste P-gp.

Microscopia leve (simples ou aprimorada com contraste de fase) é um método inestimável para verificar a integridade da monocamada 2D ou 3D e a inserção do filtro enquanto avalia possível crescimento excessivo celular. A Figura 7 pode servir como um guia para reconhecer culturas saudáveis de células organoides intestinais caninas. Os valores teer são uma medida importante da formação de junções intercelulares e diferenciação das culturas organoides em um epitélio intestinal intacto. Os organoides intestinais caninos se diferenciam em enterócitos e células de cálice (Figura 6). Essas células produtoras de muco permitem o estudo de interações medicamentoso-muco, que tem sido difícil de alcançar usando culturas tradicionais de células 2D⁴⁸. A presença de células enteroendócrinas foi previamente confirmada em organoides intestinais caninos por Chandra et ^al.33.

Outra caracterização das monocamadas organoides caninas derivadas de organoides jejunas, ileais e coloniais utilizando TEM é fornecida. As imagens tem mostram microarquitetura celular, incluindo junções apertadas e formação de microvilli, ilustrando ainda mais a complexidade e a utilidade desses modelos organoides na medicina translacional. Com base nos resultados experimentais, as culturas organoides no suporte permeável estavam prontas para experimentação entre os dias 11 e 13 pós semeadura (Figura 9). Os valores do TEER neste momento variaram entre 1.500 e 2.500 Ω,cm². A fase de platô dos valores teer dura uma janela de tempo muito limitada onde o experimento deve ser iniciado antes que os valores teer comecem a diminuir lentamente. Os valores do TEER também podem ser uma parte crucial da exibição de resultados experimentais importantes, pois algumas drogas ou excipientes de produtos medicamentosos podem interagir com a monocamada (por exemplo, junções apertadas), o que pode afetar muito as leituras de valor do TEER. Isso por si só pode servir de dados para um experimento.

Organoides intestinais caninos em um aparato de cultura celular de câmara dupla podem ser aplicados em campos que não a permeabilidade da droga oral devido à arquitetura única da monocamada celular resultante. Por exemplo, eles podem ser usados em pesquisas de microbiologia (por exemplo, o impacto da alteração da flora microbiana de GI), estudos de absorção viral, interações medicamentosa-medicamentos e mecanismos de transporte de drogas⁴⁹. A câmara de doadores é tipicamente preenchida com a droga de teste ou composto de escolha, e alíquotas da câmara receptora são tomadas em vários pontos de tempo. Essas alíquotas podem ser analisadas usando cromatografia líquida de alto desempenho, espectrometria de massa, ensaio imunossorbente ligado à enzima ou outras técnicas para determinar a quantidade e a velocidade pelas quais o soluto permeia através da monocamada.

Estes estudos requerem uma monocamada intacta para avaliar a permeabilidade da droga com precisão. Isso normalmente requer monocamadas crescentes em excesso às necessárias para contabilizar poços inutilizáveis. Monocamadas de células organoides também podem ser usadas para medir a absorção viral do lado apical ou basal de uma monocamada, com leituras incluindo ensaios de imunofluorescência que utilizam anticorpos para detectar a absorção celular do vírus. Finalmente, vários medicamentos (ou seja, substrato e inibidor) podem ser aplicados na câmara de doadores para identificar interações medicamentosas baseadas em transporte.

Com base nas observações atuais, esses métodos não serão apenas aplicáveis aos organoides caninos nas pastilhas culturais, mas também serão adequados para outras espécies veterinárias e sistemas de órgãos, com pequenas modificações necessárias para melhor se adequar à espécie ou modelo de órgão de escolha. Os protocolos para o crescimento organoide intestinal canino tiveram que ser ajustados com base nas propriedades únicas da cultura. Assim, o protocolo pode ser ajustado para outra espécie, mas exigirá mudanças sutis no protocolo. As modificações podem começar com alterações na densidade de semeadura celular e expandir-se para mudanças na composição da mídia para diferenciar adequadamente os organoides de interesse.

A padronização, a documentação detalhada dos procedimentos experimentais e o monitoramento consistente das monocamadas celulares são práticas cruciais necessárias em todos os ensaios de suporte permeáveis e não se limitam ao sistema canino. Essas possíveis modificações de espécies ou órgãos são fundamentais para documentar e relatar novos avanços no campo. Este modelo tem várias limitações, por exemplo, seus requisitos de custo, variabilidade interlaboratória e dados limitados sobre a capacidade de prever a absorção intestinal in vivo. Os cães, em alguns casos, possuem diferentes transportadores de drogas e enzimas metabolizantes do que os humanos⁵⁰.

Além disso, o sistema organoide canino deve ser testado em uma variedade de outros aparelhos de câmara dupla de outros fabricantes para determinar a adequação de tal modelo (por exemplo, a adequação de diferentes composições de membrana de filtro deve ser determinada). Outra desvantagem é que a parte do experimento de permeabilidade da droga do manuscrito é menos descritiva do que as partes anteriores. Isso é causado por um excesso de informação neste campo. O objetivo desta parte do manuscrito era descrever esses métodos de forma modificável, sem cortar as bordas dos pilares desses experimentos. Informações mais detalhadas sobre experimentos de permeabilidade foram coletadas por Hubatsch et ^al.37. Além disso, as pastilhas permeáveis podem ser usadas em experimentos de cocultura, migração celular e ensaio de invasão⁴.

Em conclusão, os organoides intestinais caninos em aparelhos de cultura de câmara dupla têm o potencial de serem usados em uma ampla gama de aplicações, incluindo campos biomédicos e medicina translacional, para citar alguns. Os protocolos criam várias estratégias para planejar um experimento e promover a confiabilidade de dados interlaboratoriais para modelos organoides em todo o campo da biologia.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Organoid media
ROCK inhibitor (Y-27632)	EMD Millipore Corp.	SCM 075
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma	G9145-.5MG
A-83-01	PeproTech	9094360
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
FBS	Corning	35-010-CV
Glutamax	Gibco	35050-061	glutamine substitute
HEPES	VWR Life Science	J848-500ML
Human R-Spondin-1	PeproTech	120-38-500UG
Murine EGF	PeproTech	315-09-1MG
Murine Noggin	PeproTech	250-38-250UG
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG
N2 supplement	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
SB202190 (P38 inhibitor)	Sigma	S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	Reprocell	04-0004-base
TMS (trimethoprim sulfate)	Sigma	T7883-5G
Reagents
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	A38-500
alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous	Acros Organics	170080010
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL	Gibco	A10483-01
FITC-CM-Dextran	Millipore Sigma	68059-1G
Formaldehyde (37%)	Fisher Chemical	F79P-4
Glutaraldehyde solution	Sigma	G5882
HBSS (1x)	Gibco	14025-076
Matrigel Matrix For Organoid Culture	Corning	356255	Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97%	Alfa Aesar	A11313
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Trypsin-like Protease
Materials and Equipment
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430766
9" Pasteur Pipets	Fisherbrand	13-678-6B
Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile	Corning	3470	Permeable Support
Millicell ERS (Probes)	Millipore Sigma	MERSSTX01
Millicell ERS-2 Voltohmmeter	Millipore Sigma	MERS00002
Panasonic incubator	Panasonic	MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film	Bemis Company Inc	PM996/EMD	Flexible Laboratory Film
Tissue Culture Plate 24 wells	Fisherbrand	FB012929