Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Resumo

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Resumo

Mielóide células dendríticas (DCs) são frequentemente usados ​​para estudar as interações entre inata e adaptativa mecanismos imunológicos e da resposta inicial à infecção. Porque estes são os antígenos mais potentes células apresentadoras, as DCs são cada vez mais usado como um vetor de vacina para estudar a indução do antígeno específico respostas imunes. Neste vídeo, demonstramos o procedimento para a colheita tíbias e fêmures de um camundongo doador, o processamento da medula óssea e diferenciando DCs in vitro. As propriedades de mudança DCs após a estimulação: células dendríticas imaturas são fagócitos potente, enquanto DCs maduras são capazes de apresentação de antígenos e interação com CD4 + e CD8 + T. Essa mudança na atividade funcional corresponde à regulação alta de marcadores de superfície celular e produção de citocinas. Muitos agentes podem ser usados ​​para DCs maduras, incluindo citocinas e ligantes toll-like receptor. Neste vídeo, demonstramos comparações de citometria de fluxo da expressão de duas moléculas co-estimulatórias, CD86 e CD40, e citocinas, IL-12, após a estimulação durante a noite com o tratamento CpG ou mock. Depois de diferenciação, DCs pode ser ainda mais manipulado para uso como um vetor de vacina ou para gerar antígeno-específicos respostas imunológicas in vitro por pulsos utilizando peptídeos ou proteínas, ou transduzidas utilizando vetores virais recombinantes.

Protocolo

Este protocolo foi adaptado de Lutz et al ^1.

Colheita e processamento de medula óssea

1. Isolamento da tíbia e fêmur: Euthanize o mouse doador e pulverizar as pernas com etanol 70%. Segure o tornozelo primeiro firmemente com uma pinça sem corte e começar a cortar a pele e musculatura subjacente para expor a tíbia. Para evitar danos ao osso, cortados de forma lenta e paralelamente à tíbia, deixando intacta a articulação do joelho.
   
   Para limpar o fêmur, imobilizar a articulação do joelho, segurando com uma pinça sem corte. Limpe a musculatura com um par de tesouras e pinças curvas. Continue para cima até que a articulação do quadril é exposto e tesoura pode ser colocado entre a cabeça do fêmur e do quadril. Retire os ossos, cortando entre o fêmur ea articulação do quadril e coloque em tampão fosfato salino (PBS) no gelo.
2. Remoção de medula óssea: Limpe musculatura restantes dos ossos usando tesouras e pinças curvas. Cortar as epífises de cada osso e localizar a cavidade central. Usando uma seringa de 10 ml carregado com PBS e uma 25G0.5 agulha ", lave a medula óssea em uma placa de Petri não-tecido revestido.
3. Processamento de medula óssea: Use a ponta de borracha do êmbolo de uma seringa de 1ml para dissociar a medula óssea em uma suspensão de uma única célula (use um para cima e para baixo, não raspagem de movimento). Colete de medula óssea em um tubo falcon cônica, e enxágüe da medula óssea residual com PBS.

Cultura de células dendríticas

1. Ressuspender as células em DC mídia e precursores contar DC em um hemocitômetro (Figura 1). Você vai ver as células de tamanhos variados; os precursores DC são as maiores e mais brilhantes. Diferencialmente contar apenas essas células. A partir de dois fêmures e duas tíbias de um tipo selvagem C57BL / 6 mouse (6-8 semanas de idade), você deve esperar entre 25-40 x 10 ⁶ precursores DC total.
   
   
   
   Figura 1
   
   
2. Células de cultura a uma densidade de 2 x 10 ⁵ precursores DC / DC mL em meio suplementado com 40 ng / mL recombinante murino GM-CSF. Células em placa não-tecido revestido placas de Petri de poliestireno.

Adicionar mídia (dia 3)

Para atualizar os meios de comunicação, adicione metade do volume total de mídia fresco suplementado com 40 ng / mL GM-CSF.

Substituir um terço dos meios de comunicação (dia 6) e maturação

Para atualizar os meios de comunicação, remova cuidadosamente um terço do volume total dos meios de comunicação e substituir esse volume com a mídia fresco DC suplementado com 40 ng / mL GM-CSF no dia 6 de cultura.

Se desejar, células dendríticas podem ser estimuladas para a maturação usando citocinas ou ligantes toll-like receptor. No vídeo, DCs foram maturados por estimulação durante a noite com 5 ng / mL CpG.

Colheita de células dendríticas

Cultura DC está completo (Figura 2). Células serão tanto em suspensão e frouxamente aderido à placa. Células aderidas pode ser removido raspando o prato com um raspador de cultura de tecidos e lavagem com PBS. O número total de células aumenta 5-8 vezes durante a semana de cultura e período de diferenciação, portanto, esperar para colher 1-1,6 x 10 ⁶ células / mL.

Figura 2

Reagentes

1. DC media
   1. RPMI-1640 mídia, suplementado com:
   2. 10% de soro fetal bovino
   3. 100 UI / mL de penicilina
   4. Estreptomicina 100 mg / mL
   5. 1% L-glutamina
   6. 0,1% 2-mercaptoetanol
   7. 1X não-aminoácidos essenciais
   8. 1X piruvato de sódio
      
2. Recombinante murino GM-CSF
   1. rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, nenhum catálogo. 315-03)

Discussão

DCs são úteis para estudos de interações inata e adaptativa imune, e pode ser utilizado como um vetor de vacina. Neste vídeo, demonstramos os passos para isolar medula óssea e mielóide diferenciar células dendríticas in vitro. Após o período de cultura, essas células podem ser visualizados ao microscópio ambas as células como aderentes, que muitas vezes possuem dendrites, e células não-aderentes rodada. Os DCs pode ser ainda mais manipulados para apresentação de antígenos por pulsando com antígeno ou estimulados para a p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
recombinant murine GM-CSF	Reagent	Peptrotech	315-03