Biodistribuição de Nano-fármacos Transportadores: Aplicações de MEV

Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Connecticut, Storrs, Connecticut

As nanopartículas têm sido cada vez mais utilizadas para a entrega de drogas direcionadas e a liberação controlada de drogas. Embora a maioria dessas partículas tenham sido desenvolvidas como partículas poliméricas ou liposômicas por causa de sua biocompatibilidade, há uma tendência na pesquisa atual para o uso de nanopartículas metálicas e magnéticas. Estas nanopartículas metálicas foram originalmente usadas como um agente de contraste na imagem, mas os recentes avanços mostraram o quão importantes elas poderiam ser na entrega de medicamentos e genes e na terapêutica. Nanopartículas de ouro, prata e paramagnéticas têm a maior participação na pesquisa que está sendo feita. Mostraram-se ter boa biocompatibilidade e certas variedades de nanopartículas magnéticas já foram desenvolvidas e distribuídas como drogas-alvo terapêuticas.

Esses elementos pesados são tipicamente imagens para pesquisas usando fluorescência para avaliar a entrega e distribuição, mas seus pesos atômicos são boas qualificações para o aumento do contraste na análise de elétrons backscatter usando um microscópio eletrônico de varredura (SEM). Espectroscopia de raios-X dispersivos de energia, que utiliza raios-X característicos emitidos na interação do feixe de elétrons com a amostra para identificar a composição química, também pode ser usada com o SEM. Esses métodos têm os benefícios do aumento da resolução e do aumento da confiança na detecção, pois o EDS pode garantir que o sujeito de uma imagem seja da composição correta, enquanto os métodos atuais de fluorescência podem se desprender das nanopartículas e podem desaparecer rapidamente durante a imagem.

Esta demonstração examinará a distribuição de nanopartículas metálicas dependentes do tamanho em órgãos do corpo ao longo do tempo. Os órgãos excisados serão examinados com SEM para vários tamanhos de partículas em uma variedade de pontos de tempo após a entrega de partículas ao corpo.

É difícil superestimar a importância das nanopartículas (NPs) para aplicações médicas. Eles são usados como drogas, portadores de drogas, agentes de contraste, etc. No entanto, para usar um certo tipo de nanopartícula é necessário saber como e onde ele será distribuído em cada órgão após a aplicação e quanto tempo levará antes de deixar o órgão e, posteriormente, o corpo. Isso é chamado de biodistribução.

O processo de entrega de drogas nanopartículas pode variar amplamente em sua complexidade, desde drogas passivas que não visam o tecido, mas são liberadas em todo o corpo, até o direcionamento mais ativamente manipulado de drogas para um órgão ou localização muito preciso. A maioria dos medicamentos e terapias usará direcionamento passivo, o que ainda mostra grande sucesso devido à maior permeabilidade e retenção (efeito EPR) em tumores com grandes quantidades de fluxo sanguíneo e altas quantidades de vazamento vascular. Além do direcionamento passivo, o direcionamento ativo pode ser feito no processamento das nanopartículas através da fixação de ligantes específicos do local do tumor, ou pode ser feito após a injeção por meio da adição de uma força magnética às nanopartículas magnéticas. Este campo magnético retira as nanopartículas da corrente sanguínea em direção à área aflita, diminuindo assim o tempo de gasto do medicamento na corrente sanguínea e aumentando a dose para a área afetada. Esses diferentes métodos de entrega devem afetar muito a distribuição das nanopartículas após o tratamento, e este experimento visa investigar tanto sua distribuição inicial, quanto sua distribuição ao longo do tempo.

Os métodos atuais de medição da distribuição de nanopartículas geralmente envolvem a fixação de partículas de fluorescência nas nanopartículas. Dependendo da concentração das nanopartículas, do tamanho da área alvo e da intensidade da fluorescência, os camundongos translúcidos podem ser analisados usando imagens ópticas enquanto ainda estão vivos para determinar se as partículas estão na área correta. Fluorescência pós-morte também pode ser usada para determinar níveis de nanopartículas em diferentes órgãos de camundongos. No entanto, esses métodos carecem da resolução de nanopartículas e afirmação de que a fluorescência não se desvinculou das nanopartículas.

A demonstração atual explora a microscopia eletrônica rescattered (BEM) e a análise baseada em espectroscopia dispersiva de energia (EDS) para entender a biodistribuição de nanopartículas magnetoelétricas (MENs) dependendo de seu tamanho e do tempo gasto no corpo. As MENs na amostra são nanopartículas magnetoelétricas de bário e titânio que foram introduzidas em órgãos de camundongos através da injeção e, em seguida, passivamente direcionadas aos órgãos. Os camundongos ficaram inconscientes e seus órgãos removidos e preservados em 1 semana, 4 semanas e 8 semanas após a injeção. Os órgãos: fígado, baço, pulmões, rins e cérebro, foram então seccionados usando uma máquina de microtome e preparados usando métodos de preparação amostral descritos no vídeo educativo "SEM Imaging of Biological Samples".  Como modo de digitalização da microscopia eletrônica (SEM), o BEM juntamente com a análise eds fornece uma análise composicional de alta resolução que permite detectar nanopartículas individuais de até 10 nm de diâmetro. Enquanto isso, esta demonstração pode ilustrar como diferentes detectores podem ser usados para detectar, confirmar e mapear diferentes elementos e partículas em um cenário de pesquisa e também como diferentes parâmetros podem afetar a imagem resultante.

1. Injeção de nanopartículas e colheita de órgãos

1. Injete nanopartículas em um rato anestesiado por via intravenosa para permitir o direcionamento passivo.
2. Nos pontos de tempo desejados, ou seja, 1, 4 e 8 semanas, pós-injeção, eutanásia humana dos camundongos de acordo com as Diretrizes da American Veterinary Medical Association (AVMA).
3. Abra a cavidade corporal e remova cirurgicamente os órgãos de interesse. Coloque os órgãos em formalina tamponada de fosfato de 10% em um recipiente de polipropileno até a preparação da amostra.

2. Preparação da amostra de tecido

1. Use fórceps para transferir o tecido do rato do fixador para salina tamponada de fosfato (PBS). Balance a amostra por 30 minutos, substituindo o PBS a cada 10 minutos.
2. Retire o tecido e seque com um kimwipe. Em seguida, coloque-o em um molde plástico contendo o composto de temperatura de corte ideal (OUT). Armazene a -80 °C durante a noite.
3. No dia seguinte, transfira a amostra para o criostat e adefina a temperatura para -23 °C.
4. Rotular slides com o tipo de órgão e tamanho de nanopartículas, e colocá-los em uma prateleira no criostat.
5. Cubra o mandril criostat com OCT e coloque a amostra em cima. Abaixe o êmbolo extrator sobre a amostra e deixe-o equilibrar por 3-5 min.
6. Monte o mandril no suporte do espécime e oriente-o para que a lâmina possa cortar em linha reta através da amostra congelada. Leve a amostra para perto da lâmina para enfrentar o áspero. Coloque a espessura em 30 μm e corte várias seções até que uma fatia cortada uniformemente seja produzida.
7. Mude para uma frente fina, diminuindo a espessura da seção para 7-8 μm. Colete uma seção fatiada pressionando um deslizamento de vidro rotulado na fatia. Coloque dois slides em cada slide e armazene em um rack de slides. Deixe secar à temperatura ambiente.
8. Uma vez seco, desidrate as amostras mergulhando o rack de slides em 50% de etanol por 3 minutos para remover oct. Em seguida, transfira o rack para 80% de etanol por 3 min antes de colocar o rack em uma proporção de 1:1 de metanol frio para acetona por 10 min a -20 °C.
9. Remova o rack de slides e escorra o excesso de solvente em uma toalha de papel. Depois de 20-30 min, coloque os slides em uma caixa de slides e guarde em um congelador a -20 °C até a imagem.

3. Imagem de alta resolução usando SEM e EDS

1. Prepare a amostra conforme descrito em "SEM Imaging of Biological Samples". Em seguida, carregue a amostra no SEM.
2. Ligue o SEM e ajuste a distância de trabalho para cerca de 5 mm e a tensão acelerada e a corrente de feixe para 25 keV, que normalmente seria muito alta para uma amostra biológica. No entanto, a amostra é revestida para condutividade e proteção.
3. Inicie a imagem e amplie em torno de 1.000-2.000X de ampliação para ver as estruturas que conteriam as nanopartículas. Observe que, sem a detecção de dispersão traseira (BSD), não se pode distingui-los abaixo de uma determinada profundidade.
4. Insira o BSD sob os mesmos parâmetros e mova o estágio na direção z para a mesma distância de trabalho de antes.
5. Comece a fotografar em torno da mesma ampliação e verifique se você é capaz de ver alto contraste na presença de nanopartículas. Guarde as imagens.
6. Use diferentes configurações de BSD (onde as cargas no detector se alinham) para escolher a que mostra o maior contraste para as nanopartículas.
7. Zoom-in em uma área de alto contraste mostrando uma nanopartícula ou aglomerado de nanopartículas.
8. Abra a^2ª câmera da câmara e observe enquanto você insere o EDS no sistema pressionando o botão para baixo no acessório SEM. Uma vez que o EDS esteja perto, mas não tocando no BSD ou na arma, solte o botão.
9. Abra o programa asteca no computador EDS (ainda na estação de trabalho) e adquira uma imagem do SEM. Use o método "ponto e tiro" para clicar em uma área muito densa em contraste e nanopartículas.
10. O EDS mostrará o espectro de raios-X característicos a partir desse ponto. Procure por picos de bário e titânio para serem identificados no gráfico. Isso confirma que o que você está olhando são de fato as nanopartículas e não qualquer tipo de contaminação.
11. Retorne à amostra e use o software Atlas para mapear as bordas do órgão no slide. Selecione o protocolo "Órgão" para criar uma imagem de mosaico da área e deixe-o funcionar (isso pode levar algumas horas no máximo).
12. Uma vez que a imagem composta é criada e costurada pelo software, exporte-a como um arquivo Tif.
13. Abra o arquivo Tif no ImageJ, um software de código aberto, e ajuste os valores de limiar de contraste para destacar as áreas de contraste muito alto (ou seja, as nanopartículas). Use funções incorporadas para quantificar o volume de nanopartículas usando o tamanho do pixel definido no protocolo do Órgão (deve ser em torno de 100 nm).
14. Embora este procedimento se refira apenas à amostra de 1 semana do pulmão do camundongo, este procedimento é repetido com as amostras de outras semanas e outros órgãos para compilar um gráfico mostrando a distribuição.
15. Após o cálculo da bioco distribuição de cada órgão para cada semana, os gráficos de biodistribução mostrarão as mudanças na biodistribução e concentração de nanopartículas ao longo das 8 semanas. Estes mostram o pico de concentração e também fornecem informações sobre quanto tempo leva para as nanopartículas se dissiparem do órgão.

As imagens a seguir ilustram como os dados de biodistribução podem ser extraídos das imagens. O contraste das nanopartículas é detectado utilizando-se o detector BSE, conforme mostrado na Figura 1. Os dados do EDS, apresentados na Figura 2, mostram onde os aglomerados de titânio e bário correspondem a áreas de alto contraste nas imagens coletadas utilizando o detector BSE.

Figura 1: Imagem eletrônica secundária do pulmão (esquerda) e imagem eletrônica de backscatter da mesma área (direita).

Figura 2: Dados EDS, mostrando clusters de titânio e bário no meio inferior e na parte superior da imagem, correspondendo a áreas de alto contraste vistas usando o detector BSE.

Em uma imagem composta, como mostrado na Figura 3, os círculos vermelhos indicam áreas de alto contraste e sugerem os locais contendo nanopartículas. O volume das áreas de nanopartículas brancas pode então ser calculado e mediado acima do tamanho do próprio órgão. Isso fornece um cálculo da área ocupada pelas nanopartículas. Em seguida, dados de vários órgãos ao longo de várias semanas podem ser agregados para mostrar a distribuição média de partículas em um mícculo quadrado da imagem. Esses dados são apresentados na Figura 4, que mostra uma diminuição global das nanopartículas de tamanho de 30 nm ao longo das 8 semanas, uma indicação de liberação. Outra coisa a notar é o aumento da concentração de nanopartículas no fígado após 4 semanas. Isso fornece informações sobre como o corpo processa as nanopartículas, e a grande migração de partículas para o fígado mostram que o corpo pode estar processando as nanopartículas como toxinas. Essa é uma informação importante para saber no desenvolvimento e teste de nanopartículas in vivo.

Da mesma forma, os dados sobre a distribuição de órgãos de partículas de tamanhos variados são apresentados na Figura 5. Este gráfico demonstra como a mudança de tamanho das nanopartículas pode aumentar a absorção global em células das nanopartículas ou aumentar a taxa de desembaraço.

Figura 3: Seções da imagem composta criada usando o software Atlas.

Figura 4: Biodistribução de nanopartículas de 30 nm no pulmão, fígado, baço e rim após injeção em um rato.

Figura 5: Biodistribução de nanopartículas de tamanho variado ao longo do tempo.

As nanopartículas são amplamente utilizadas em pesquisas de engenharia biomédica e possuem aplicações como agentes de imagem, diagnóstico e terapêutica. Por exemplo, nanopartículas estão sendo desenvolvidas para uso na entrega de vacinas. Ao encapsular a vacina em nanopartículas, os componentes da vacina são protegidos contra a degradação e estimulam a resposta imune máxima.

Em aplicações de ressonância magnética, nanopartículas metálicas são frequentemente usadas como agentes de contraste para visualizar a estrutura e a função tecidual. São sondas de diagnóstico úteis na detecção de placas arteroscleróticas.

Nanopartículas que integram habilidades diagnósticas e terapêuticas são chamadas de teranostia. Há nanopartículas simultaneamente detectam tumores em estágio inicial e fornecem agentes quimioterápicos.

Este experimento demonstrou como o SEM pode ser usado para calcular a biodistribução de nanopartículas injetadas no corpo ao longo do tempo. Este experimento pode ser replicado em outras amostras de nanopartículas ou culturas celulares que têm nanopartículas como forma de analisar concentrações, penetração celular ou liberação de nanopartículas.

Esta demonstração se concentrou em estudar e medir a biodistribução de nanopartículas utilizando SEM. Os resultados dessas medições podem ser importantes em muitos campos. Empresas farmacêuticas e instalações de pesquisa podem usar esses estudos para o desenvolvimento de medicamentos e pesquisas de agentes de contraste.

Lista de Materiais

1. Hadjikhani, Ali. "Nanofabrication and Spectroscopy of Magnetic Nanostructures Using a Focused Ion Beam." (2016).