1. Configuração experimental

1. Conecte uma fonte de luz de fibra óptica ao sistema de imagem de fluorescência usando um guia de luz de fibra óptica.
2. Selecione o filtro de excitação apropriado para o experimento. O filtro de excitação determina o comprimento de onda da luz a ser entregue à amostra e deve ser escolhido para corresponder ao espectro de excitação do fluoróforo introduzido na amostra.
3. Selecione o filtro de emissão apropriado. O filtro de emissão bloqueia componentes espectrais indesejados, que podem ser atribuídos à autofluorescência, e devem ser escolhidos para corresponder ao espectro de emissões do fluoróforo.

2. Preparação da amostra

1. In vivo
   1. Anestesiar o animal em uma câmara de indução usando isoflurano a uma concentração de 3-4% no mostrador do esvoaçante.
   2. Transfira o animal para um cone de nariz fixado no estágio de imagem, e mantenha o isoflurane em uma concentração de 1-2%. Uma fonte de calor não é necessária porque os animais são tipicamente apenas imagens por um curto período de tempo (> 5 min), e sua temperatura corporal não diminui substancialmente.
   3. Proteja as patas do animal para minimizar os artefatos de movimento. Remova o cabelo da região de interesse aplicando um creme depilatório.
   4. Aplique creme depilatório na menor área necessária. Depois dos 30, limpe-o com uma gaze. Limpe a área uma segunda vez com uma almofada de gaze umedeçada com álcool etílico para remover completamente o creme depilatório.
   5. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar a secagem das córneas.
   6. Injete a sonda molecular fluorescente ativada no animal. Para esta aplicação específica, as sondas ativaveis MMP2 foram injetadas por via intravenosa na veia traseira. Neste ponto, o mouse pode ser imageado. Proceda ao "Acquistion de Imagem" deste protocolo para continuar. Monitore o animal para respirar regularmente durante todo o breve procedimento.
2. Ex Vivo
   1. Após a injeção da sonda fluorescente, eutanásia o animal de forma humana de acordo com as Diretrizes avma 2013 para a eutanásia dos animais. A overdose de dióxido de carbono (CO₂₎é uma prática padrão para eutanásia de pequenos animais.
   2. Extrair cirurgicamente o tecido ou órgão de interesse e remover cuidadosamente o excesso de tecido adiposo com fórceps.
   3. Enxágüe o tecido em soro fisiológico tamponado para remover o sangue residual e coloque a amostra diretamente no estágio de imagem.

3. Aquisição de Imagens

1. Abra o software de imagem molecular e ligue tanto a fonte de luz de fibra óptica quanto o sistema de imagem de fluorescência.
2. Abra a janela de aquisição e especifique o tipo de exposição apropriada para o estudo. As exposições disponíveis incluem: Exposição padrão para capturar uma única imagem, Exposição de Lapso de Tempo para capturar uma série de imagens durante um intervalo de tempo fixo e Exposição Progressiva para capturar uma sequência contínua de exposições em diferentes momentos de exposição.
3. Selecione UV-Transillumination como a fonte de iluminação.
4. Usando a imagem visualizada como referência, ajuste o foco da lente, o campo de visão e a abertura f-stop/aperture na câmara do sistema de captura para otimizar a qualidade da imagem amostrada. Ajuste o tempo de exposição e a posição da amostra.
5. Feche a janela de visualização e certifique-se de que todos os parâmetros na janela de aquisição correspondam às configurações da câmera e do filtro.
6. Clique em 'Expor' para adquirir e salvar a imagem.
7. O software de imagem molecular padrão normalmente fornece uma variedade de ferramentas analíticas, de medição e de correção de imagem para quantificar sinais de fluorescência para análise de imagens.
8. No final da sessão de imagem, remova a amostra/animal, desligue o sistema e limpe o estágio de imagem para minimizar os danos ao sistema.