A modificação pós-translacional de proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos na célula. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina de proteínas. Usamos técnicas de enriquecimento e espectrometria de massa para descobrir a ubiquitinoma profunda.
Fizemos várias melhorias na análise de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas. Estes incluem fracionamento de peptídeos brutos antes do enriquecimento, e a aplicação de configurações de fragmentação de peptídeos mais avançados no Orbitrap. Ao todo, isso resulta em uma cobertura maior do ubiquitinome.
Vários aspectos do protocolo são difíceis de descrever em palavras. A visualização de alguns dos principais passos é essencial para poder repetir essas análises por diferentes operadores em um laboratório diferente. O procedimento será demonstrado por Karel Bezstarosti, que é técnico sênior do meu laboratório.
Comece preparando células cultivadas ou tecido cerebral do rato para o experimento. Se trabalhar com células, lise a pelota celular de uma placa de cultura quadrada de 150 centímetros em dois mililitros de gelo frio, 50 mililitros Tris HCL com desoxicolato de sódio de 0,5%. Ferva o lise a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, sonicate-lo a quatro graus Celsius por 10 minutos. Se usar tecido cerebral de camundongo in vivo, lise-o em um tampão gelado frio contendo 100 mililitros Tris HCL, 12 milimilas de desoxicosolato de sódio e 12 milimilas de sódio N-lauroylsarcosinate. Sonicar o lysate por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, ferva por cinco minutos a 95 graus Celsius. Em seguida, quantita a quantidade total de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA de absorção calorimétrica, que deve ser pelo menos vários miligramas para imunoprecipitação de peptídeo diGly bem sucedida. Para experimentos SILAC, misture as proteínas leves e pesadas rotuladas em uma razão de um para um com base na quantidade total de proteínas.
Reduza todas as proteínas com 5 mililitros DTT por 30 minutos a 50 graus Celsius. E, posteriormente, alquilá-los com iodoacetamida milimolalar por 15 minutos no escuro. Em seguida, realize a digestão proteica com Lys-C por quatro horas.
E digestão de trippsina durante a noite a 30 graus Celsius, ou à temperatura ambiente. No dia seguinte, divida a amostra em dois tubos Eppendorf mililitros e adicione TFA à amostra digerida a uma concentração final de 0,5% Centrifuge-a a 10.000 vezes G por 10 minutos para precipitar e remover todo o detergente. Colete o peptídeo contendo supernascida para fracionamento subsequente.
Use cromatografia c18 de alta fase reversa de pH para fracionar os peptídeos fáticos. Prepare um cartucho vazio de seis mililitros cheio de 0,5 gramas de material de fase estacionária para cerca de 10 miligramas de digestão proteica. Coloque os peptídeos na coluna preparada e lave-o com aproximadamente 10 volumes de 0,1% TFA, seguido por 10 volumes de água.
Elute os peptídeos em três frações usando 10 volumes de coluna de formato de amônio mililamlar com sete, 13,5 e 50% de acetonitrilo, respectivamente. Então, litolyse todas as frações. Um lote de anticorpos remanescentes de ubiquitina conjugados à proteína A agarose bead slurry é dividido em seis frações iguais.
Dissolva as três frações de peptídeos de acordo com as instruções do manuscrito e gire os detritos. Adicione os supernaciantes das três frações ao chorume de contas, mantendo as outras três frações no gelo. E incuba-los por duas horas a quatro graus Celsius em uma unidade rotadora.
Então, gire as contas. Transfira o supernatante para um lote fresco de contas. E repita a incubação com as três frações restantes de chorume.
Armazene os supernacantes para análises proteome globais subsequentes. E transfira as contas para 200 dicas de pipeta microliter equipadas com um plugue de filtro GFF. Coloque as pontas em tubos de 1,5 mililitro equipados com um adaptador de ponta centrífuga e lave as contas três vezes com 200 microliters de tampão IAP gelado, seguido por três lavagens com água gelada purificada.
Gire as colunas a 200 vezes G por dois minutos entre as lavagens, certificando-se de não deixar a coluna secar. Após a lavagem final, elute os peptídeos com dois ciclos a 50 microliters de 0,15%TFA. Desalque os peptídeos com uma ponta de estágio C18 e seque-os com centrifugação de vácuo.
Realize experimentos LC-MS/MS em um espectrômetro de massa sensível acoplado a um sistema LC de nanofluxo. A coluna é montada de acordo com as instruções do manuscrito e mantida a 50 graus Celsius. Opere o espectrômetro de massa no modo de aquisição dependente de dados.
Colete o espectro de massa MS1 em alta resolução com um ajuste de alvo controlado de ganho automatizado de 4E5 e um tempo máximo de injeção de 50 milissegundos. Realize a análise de espectrometria de massa no primeiro modo mais intenso, usando o método de velocidade máxima com um tempo total de ciclo de três segundos. Em seguida, realize uma segunda rodada de análise DDA MS no primeiro modo menos intenso, o que garantirá a detecção ideal de peptídeos de baixa abundância.
Filtre os íons precursores de acordo com seus estados de carga e atribuição de pico monoisotópico. E exclua precursores previamente interrogados dinamicamente por 60 segundos. Isole precursores de peptídeos com um filtro de massa quadrupole definido para uma largura de 1,6 Thomson.
Em seguida, colete espectros MS2 na armadilha de íons em um controle de ganho automatizado de 7E3 com um tempo máximo de injeção de 50 milissegundos e energia de colisão HCD de 30% Analise os arquivos brutos de espectrometria de massa usando um mecanismo de busca apropriado, como o pacote de software MaxQuant disponível livremente baseado no mecanismo de busca de Andrômeda. Abra o MaxQuant e selecione os arquivos de dados brutos apropriados. Defina o número de processadores e clique na guia parâmetros específicos do grupo.
Selecione a digestão e deixe três decotes perdidos. Em seguida, selecione modificações e adicione diGly às modificações variáveis. Selecione a guia de parâmetros globais e adicione o banco de dados de sequência de proteínas correto.
Deixe as outras configurações como padrão e pressione comece a realizar a pesquisa do banco de dados. Para análise quantitativa dos arquivos de experimento silac, defina a multiplicidade para dois e selecione os rótulos pesados de aminoácidos. Quando a pesquisa estiver concluída, importe os arquivos de texto para Perseus.
Este protocolo foi utilizado para identificar sítios de ubiquização em proteínas de células cultivadas e material in vivo, detectando peptídeos diGly com nanofluto LC-MS/MS. Várias melhorias foram feitas no protocolo existente, o que resultou em maior número de peptídeos diGly detectados. Foi realizado um fracionamento bruto em três frações antes da imunoprecipitação.
Uma das frações contém o próprio peptídeo de diGly típtico modificado K48 da ubiquitina, que é caracterizado por um grande pico no cromatograma LC. Além disso, o regime de fragmentação de peptídeos foi ajustado para combinar as corridas de LC-MS com os mais altos primeiros e menores regimes de fragmentação do primeiro e menor regime de fragmentação no procedimento de análise de dados, que produziu mais de 4.000 peptídeos únicos adicionais. Mais de 23.000 peptídeos diGly podem ser rotineiramente identificados a partir de uma única amostra de células HeLa tratadas com um inibidor proteasome.
De todos os peptídeos diGly identificados ao longo de três telas de replicação biológica, mais de 9.000 estavam presentes em todos os três, enquanto mais de 17.000 estavam presentes em pelo menos duas das três réplicas. O número de identificações de peptídeos é altamente contingente na quantidade de material de entrada. Um número aproximado de peptídeos diGly identificados pode ser esperado dependendo do material inicial, mas esses números são apenas estimativas e também dependerão do tipo de espectrômetro de massa utilizado.
Ao realizar este protocolo, a experiência prévia com métodos de proteômica baseada em espectrometria de massa e manuseio e análise de quantidades de amostras minuciosas certamente seria vantajosa. O software MaxQuant pode ser substituído por qualquer outro algoritmo de pesquisa de banco de dados. Também pode ser usado um tipo diferente de espectrômetro de massa.
Os resultados em termos de identificação de peptídeos podem ser ligeiramente diferentes, mas isso é típico para qualquer ensaio de proteômica baseada em espectrometria de massa. A ubiquitina é importante no progresso da degradação da proteína mediada, mas também desempenha um papel em muitos outros processos na célula. O conhecimento mais profundo da ubiquitina como modificação pós-translacional é crucial para entender melhor sua função.
