Este trabalho foi financiado por um National Science Foundation Graduate Fellowship Research para SK e National Institutes of Heath conceder R01EB008722.

A. Preparação de Material e Esterilização <ol><li> Antes de materiais de encapsulamento preparar, preparar uma solução 0,5% em peso do fotoiniciador IRGACURE 2959 (I2959) em tampão fosfato salino (PBS), através da mistura e incubando por vários dias a 37 ° C. A solução pode então ser filtrado seringa para esterilização e armazenados em temperatura ambiente por uso a longo prazo. </li><li> Com base na composição desejada de gel para ser sintetizada, calcular (usando um programa de planilha como o Microsoft Excel) o peso de polímero e reticulador necessário. Porque um determinado peso de polímero deve ser dissolvido em um volume definido total para obter uma concentração desejada no hidrogéis, o reticulador e porções solução de polímero do volume total de gel também deve ser determinado usando a planilha. Cálculos similares devem ser feitos se houver pendant metades (por exemplo, um adesivo ou RGD YGSR contendo oligopeptídeos), devem ser incorporados antes da reticulação. </li><li> Pesar a quantidade necessária de polímero e reticulador e colocar em tubos Eppendorf. Ajustar a planilha de cálculo em conformidade, para o peso real do polímero obtido. (Nota: os volumes podem ser alterados para compensar a massa real de polímero e reticulador obtidos). </li><li> Prepare moldes gel usando uma lâmina de barbear para cortar os topos fora embalada individualmente estéril seringas de 1 mL descartáveis. Certifique-se cortar um apartamento é feita em moldes a ser utilizado para géis photopatterned. </li><li> Coloque os moldes seringa, tubos Eppendorf (com tampa aberta) e quaisquer outros materiais necessários sob uma fonte de luz germicida (normalmente construídos em cabines de segurança biológica) e esterilizar por 30 minutos. </li></ol> B. Preparação celular <ol><li> Após a esterilização, adicione o volume tampão estéril apropriada (por cálculos de planilhas, enquanto a escolha de buffer pode variar, PBS e um buffer de base fraca, como trietanolamina são tipicamente usados ​​para reticulação radical e michael-tipo livre, respectivamente) para o polímero e Eppendorf (opcionalmente) moiety pendente para ser incluído (por exemplo, peptídeo adesivo) e vortex para dissolver (se vórtex fora do envoltório estéril capa da Eppendorf com parafilme). </li><li> Adicionar o volume apropriado da solução porção pendente para a solução de polímero e enrole o selo com parafilme. Brevemente vortex e incubar a 37 ° C para reagir (se possível, em cima de uma placa de agitação rotativo) durante a preparação da célula. Isso envolve a reação de um tiol em um peptídeo (via grupo cisteína) para um acrilato ou metacrilato para que o peptídeo é incluído como um grupo pendente no hidrogel final. </li><li> Trypsinize e contagem de células e separadas em porções contendo o número apropriado para cada conjunto de géis. Por exemplo, para um conjunto de três géis 50 mL com uma densidade de 10 milhões de células / mL, separe 1,5 milhões de células em um tubo cônico individuais. Recomenda-se que não mais de 4 géis ser preparado em um conjunto de individuais devido ao tempo de gelificação (nota: se sintetizar vários conjuntos de géis, um único Eppendorf contendo um volume adequado de solução de polímero para todos os conjuntos podem ser preparados). </li><li> Centrifugar as células. </li><li> Enquanto as células estão girando para baixo <ol class="lalpha"><li> Luz iniciou crosslinking radicais livres: adicionar 0,5% em peso I2959 solução para a solução de polímero igual a 10% do volume total gel set (para uma concentração final de iniciador de 0,05% em peso). </li><li> Michael tipo de reticulação (adição): adicionar buffer para o reticulador para alcançar a solução de concentração adequada. </li><li> Para crosslinking seqüencial: esses géis incorporar ambos os tipos de crosslinking e exigem tanto das etapas anteriores. </li></ol></li></ol> C. Formação Hydrogel <ol><li> Aspirar o sobrenadante da porção de células centrifugadas. Aguarde líquido para resolver após a aspiração inicial e re-aspiração para remover a mídia, tanto quanto possível, sem perturbar o pellet celular. </li><li> Ressuspender o pellet celular com a solução de polímero até que as células estão uniformemente distribuídas. Minimizar a formação de bolhas por pipetagem lentamente a solução cima e para baixo (cerca de 10 ciclos deve ser suficiente para distribuir células). </li><li> Hidrogéis de reticulação <ol><li> Luz iniciou crosslinking radicais livres: Alíquota o volume adequado em moldes da seringa. Expor as seringas à luz UV para crosslinking radical (por exemplo, uma exposição de 10 minutos a 365 nm, 4 luz UV mW/cm2 é comum para os polímeros funcionalizados acrilato). Esta etapa deve ser realizada rapidamente para minimizar a sedimentação de células antes da exposição à luz UV. </li><li> Michael tipo de reticulação (adição): Usando uma gama de orifício ponta da pipeta, adicionar o volume adequado de solução reticulador para a solução de polímero / célula, defina a pipeta no volume desejado gel individual, pipeta a solução cima e para baixohomogeneizar, e alíquota nos moldes da seringa. Esta etapa deve ser realizada rapidamente para garantir uma distribuição uniforme de células. Permitir 10-30 minutos (dependendo do sistema individual) de incubação na capa de cultura para crosslinking. </li><li> Crosslinking seqüencial: Trata-se da reação de adição do tipo Michael em primeiro lugar e, em seguida, a exposição à luz para o crosslinking segundo. Apenas uma fração de ligações cruzadas teóricas devem ser reagido durante o crosslinking primeiro e depois uma máscara estéreis deve ser aplicado diretamente sobre a superfície do gel antes da exposição à luz, usando uma pinça esterilizada. Um corante funcionalizados (rodamina, por exemplo, methacrylated (MeRho) numa concentração final no gel de 20 nM) também pode ser adicionado à solução inicial para visualizar a padronização, uma vez que irá incorporar preferencialmente em regiões radicalmente reticulado do gel (Figura 2 ). </li></ol></li></ol> D. Cultura de Células e Análise <ol><li> Crosslinking seguinte, géis mergulhar em poços de uma placa de cultura de tecido contendo mídia para incubação e análise (ver passos seguintes). </li><li> As células podem ser visualizadas para a morfologia em microscopia de luz (Figura 3, normalmente, sintetizados hidrogéis são transparentes) e viabilidade usando um kit de coloração fluorescente vivo / morto (Figuras 3 e 4). Coloração para celular actina (por exemplo, rodamina ou fluoresceína rotulados phalloidin) e núcleos (por exemplo, 4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) pode ser realizada utilizando fixação padrão e procedimentos de permeabilização (Figura 4) com o seguinte procedimento. <ol class="laplha"><li> Enxágüe constrói 3X por 5 minutos com PBS. </li><li> Fix géis de incubação em 1 mL de formaldeído 4% por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe constrói 3X com solução bloqueadora contendo 3% (w / v) e 0,5% BSA (w / v) em PBS Tween. </li><li> Permeabilizar membrana com 0,25% (w / v) de Triton X em solução de bloqueio por 20 min. </li><li> Enxágüe constrói 3X com solução de bloqueio. </li><li> Mancha para a F-actina com 0,66 mcg / mL FITC ou rodamina phalloidin em solução de bloqueio de duas horas à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe 3x com solução de bloqueio. </li><li> Mancha núcleos celulares usando 0,4 mL / mL DAPI em PBS por 20 min. </li><li> Enxágüe 3X com PBS. </li><li> Visualize células usando microscopia de epifluorescência ou confocal. </li></ol></li><li> Proliferação de células dentro de gel é comumente avaliada utilizando ensaios comercialmente disponíveis (DNA, por exemplo, o conteúdo total ou bioquímicas). PicoGreen é comumente usado e sensível ácido nucléico mancha fluorescente para quantificar double-stranded DNA (Singer et al.). As células também podem ser contados e normalizado para um número de controle inicial usando os métodos de visualização descrito na Etapa 2. </li><li> Corte histológico e coloração também pode ser usado para visualizar as células e formado matriz. O seguinte protocolo para a desidratação e secção de hidrogéis 3D pode ser usado para obter fatias transversais em lâminas de vidro: <ol class="lalpha"><li> Fixação e desidratação <ol class="lroman"><li> Enxágüe espécime 3X no PBS. </li><li> Correção para 5-30 minutos em paraformaldeído a 4%. </li><li> Enxágüe espécime 3X no PBS. </li><li> Incubar amostra em EtOH a 25 ° C por 1 hora em cada um dos seguintes EtOH (v / v) as concentrações na água (em ordem): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (Neste ponto, as amostras pode ser armazenado durante a noite a 25 ° C). </li></ol></li><li> Compensação e de Infiltração <ol class="lroman"><li> Transferência de 100% Citrisolv para 1 hora a 25 ° C, seguido por uma hora a 65 ° C. </li><li> Cortadas amostras ao meio com uma lâmina de barbear numa placa de Petri de tal forma que a seção transversal da amostra está exposta. </li><li> Transferência para 1:1 mistura de Citrisolv / Micro-cut de parafina para 1 hora a 65 ° C. </li><li> Transferência de 100% parafina Micro-corte para 1 hora a 65 ° C. </li><li> Transferência de 100% parafina Micro-cut durante a noite a 65 ° C. </li><li> Transferência de 100% parafina Micro-cut por 1-2 horas a 65 ° C. </li></ol></li><li> Incorporação <ol class="lroman"><li> Espécime posição no molde peel-away com parafina de 100%. </li><li> Coloque uma pequena quantidade de cera na cama molde, e insira as duas metades da amostra com a seção transversal voltada para baixo. </li><li> Aplicar parte superior do filtro <ol><li> Adicionar cera adicionais para submergir a parte superior e deixe endurecer por ~ 10 minutos. </li></ol></li><li> Transferência insere a 4 ° C para permitir a geladeira para endurecer espécime durante a noite. </li><li> Amostra pode ser seçãoed no dia seguinte, normalmente a espessura de 50-10 mM por fatia usando micrótomos disponíveis comercialmente. Normalmente o molde peel-away é montado verticalmente contra o estágio micrótomo, e controles manuais são usados ​​para definir a seção de espessura slicer e alinhamento da amostra com a lâmina. </li></ol></li><li> Extração de RNA Expressão do gene também pode ser avaliada quantitativamente (por exemplo, via em tempo real, reação em cadeia da polimerase (PCR)). O protocolo para extração de RNA a partir de hidrogéis 3D, um exemplo de que é dado a seguir, é bastante diferente do caso mais simples em 2D. <ol class="lroman"><li> Rotular um certificado RNAse tubo Eppendorf para cada hidrogel 3D e adicionar 500 mL Trizol ® reagente em cada tubo. </li><li> Use um pilão (moedor de tecido) para moer os hidrogéis manualmente até que uma solução clara é obtido. Moedores de garantir diferentes são usados ​​para cada condição. </li><li> Vortex cada Eppendorf por 20 segundos para homogeneizar as amostras. </li><li> Incubar as amostras à temperatura ambiente por cinco minutos para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas. </li><li> Amostras fresco no gelo por 20 min </li><li> Adicionar 200 mL (por mL Trizol) clorofórmio para cada amostra e vortex. </li><li> Incubar as amostras à temperatura ambiente por cinco min. </li><li> Centrifugar as amostras a 12.000 xg, a 4 ° C por 15 min. </li><li> Transferir a fase aquosa (camada superior transparente) para novos tubos Eppendorf (evitando região interfacial e inferior vermelha, fase de fenol-clorofórmio). RNA permanece na fase aquosa. </li><li> Técnicas comuns para o isolamento do RNA e armazenamento pode ser usado agora. </li><li> Extração de RNA seguinte, kits comercialmente disponíveis para transcriptase reversa e PCR em tempo real são muitas vezes utilizados com algumas modificações (Elisseff et al. Strehin et al.). </li></ol></li></ol></li></ol> Resultados representativos: Veja as Figuras 2-4 (como referenciado nos protocolos acima) para obter resultados representativos da visualização de hidrogéis photopatterned e encapsulamento de células dentro de géis. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visão geral do processo de encapsulamento 3D. Passos diagrama correspondem a títulos de seção na protocolos stepwise. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Hidrogel Photopatterned usando polimerização adição sequencial do tipo Michael então radical. (A) Esquema de photopatterning de um hidrogel reticulado parcialmente com a incorporação de um corante reativo foto. (B) ou círculo (C) tarja máscara de filme de transparência padronizada hidrogéis de ácido hialurônico. Rodamina Methacrylated (MeRho) é incorporado apenas nas regiões do gel que foram expostos à luz. Barra de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Visualização de células em hidrogéis 3D. Células-tronco visualizado através de (a) microscopia de luz ou (b) ao vivo (verde, calceína AM) e mortos (vermelho, homodímero de etídio-1) coloração de 24 horas após o encapsulamento de 1 milhão de células / mL em um hidrogel de ácido hialurônico reticulado através de uma luz iniciado mecanismo de radical livre. Barra de escala = 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Visualização de células em hidrogéis 3D. hMSCs coradas para (a) células vivas (calceína AM) ou (b) celulares actina (rodamina phalloidin) e núcleos (DAPI) cinco dias após o encapsulamento de 1 milhão de células / mL em um hidrogel de ácido hialurônico reticulado através de um mecanismo do tipo Michael ( usando peptídeos pendant adesivo e reticuladores peptídeo bifuncional proteoliticamente degradável). Barra de escala = 100 mm.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

Os protocolos descritos representam um método simples e poderoso para encapsular células dentro de andaimes hidrogel de forma cytocompatible. Tais técnicas são especialmente importante, uma vez terminalmente diferenciadas e células-tronco podem exibir um comportamento marcadamente diferente em microambientes 2D versus 3D. Mesmo para abordagens terapêuticas que envolvem a implantação de materiais (por exemplo, em polimerização in situ radical), encapsulamento de células e análise de viabilidade e diferenciação pode ajudar no processo de desenvolvimento material. O processo descrito seqüencial pode ser usada para manipular o ambiente espacial de hidrogel, e, consequentemente, o comportamento celular (ver Khetan et al.). No geral, o elemento mais crítico dos protocolos descritos é a homogeneidade de todas as soluções utilizadas. Em particular, cuidados especiais devem ser tomados para garantir as células estão uniformemente distribuídas na solução de pré-polímero, e que a solução está bem misturado, ressuspensão pipeta após adição da solução de agente reticulante. Não garantir isso pode levar a aglomeração de células ou variações locais na estrutura de gel e inchaço. Enquanto os protocolos apresentados aqui se concentram principalmente sobre o procedimento para as células encapsulamento, é importante notar também que o encapsulamento podem necessitar de algum ajuste de protocolos de análise que normalmente são escritos para semeadura 2D. Vários exemplos foram ilustrados para visualizar e avaliar as células em hidrogéis.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

O encapsulamento 3D de células dentro de hidrogéis representa uma técnica cada vez mais importante e popular para a cultura de células e para o desenvolvimento de construções para engenharia de tecidos. Este ambiente melhor imita o que observar células in vivo, em comparação à cultura de tecidos padrão, devido às propriedades do tecido-como e ambiente 3D. Sintéticos hidrogéis poliméricos são água-inchados redes que podem ser projetados para serem estáveis ​​ou de degradar por hidrólise ou proteólise como o tecido novo é depositado por células encapsuladas. Uma grande variedade de polímeros têm sido exploradas para estas aplicações, tais como poli (etileno glicol) e ácido hialurônico. Mais comumente, o polímero é funcionalizado com grupos reativos, como metacrilatos ou acrilatos capaz de sofrer reticulação através de vários mecanismos. Na última década, muitos progressos foram feitos na engenharia destes microambientes - por exemplo, via a incorporação física ou pingente covalentes de pistas bioquímicos - para melhorar a viabilidade e direta fenótipo celular, incluindo a diferenciação de células-tronco encapsulado (Burdick et al.). Os métodos a seguir para o encapsulamento de células em 3D foram otimizadas em nosso e outros laboratórios para maximizar cytocompatibility e minimizar o número de etapas de processamento hidrogel. Nos protocolos a seguir (ver Figura 1 para uma ilustração do processo), presume-se que os polímeros funcionalizados capaz de sofrer reticulação estão já em curso; excelentes críticas de química de polímeros, aplicada ao campo da engenharia de tecidos pode ser encontrada em outro lugar (Burdick et al.) e esses métodos são compatíveis com uma gama de tipos de polímeros. Além disso, a adição do tipo Michael (ver Lutolf et al.) E leve-iniciada de radicais livres (veja Elisseeff et al.) Mecanismos enfocado aqui constituem apenas uma pequena parte das técnicas de reticulação relatados. Crosslinking modo misto, em que uma parte de grupos reativa é consumida inicialmente pelos crosslinking adição e seguido por um mecanismo de radical, é um outro paradigma comumente utilizado e poderoso para dirigir o fenótipo de células encapsuladas (Khetan et al., Salinas et al.).

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

O encapsulamento celular em Hidrogéis 3D para Engenharia de Tecidos

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.7K visualizações.  University of Pennsylvania. Nós apresentamos os protocolos para o 3-dimensional encapsulamento (3D) de células dentro de hidrogéis sintéticos. O procedimento de encapsulamento é descrito por dois métodos comumente utilizados de reticulação (michael tipo adição e light-iniciado livre mecanismos radical), bem como uma série de técnicas para avaliar o comportamento das células encapsuladas.

Vídeo: Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Abordagens experimentais de Engenharia de Tecidos

Biologia

Title Cell Encapsulation by Droplets

Encapsulation título celular por Droplets

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Eletrofiação Andaimes Polymer fibrosos para Engenharia de Tecidos e Cultura de Células

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

Encapsulation PuraMatrix de células de câncer

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Preparação de ADN de poliacrilamida reticulada-hidrogéis

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...