Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Regentes do Estado de Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) e da Hipertensão Tulane e Centro Renal de Excelência financiado pelo NIH concessão P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

1. Set-Up Procedimento Cirúrgico Notes <ol><li> Antes da cirurgia esterilizar material cirúrgico e instrumentos. Materiais utilizados para o procedimento cirúrgico estéril para cada rato incluem uma cortina de ser Definiu como uma superfície estéril para a colocação dos instrumentos, uma cortina com um orifício pré-cortado em cerca de 0,5 x 1,5 em no centro para ser colocada sobre o rato , gaze e. O orifício pré-cortado na cortina irá alinhar com a incisão feita no rato. Instrumentos necessários para a cirurgia incluem um par de tesouras padrão a ser utilizado para cortar material de sutura, duas pinças e um suporte de agulha fina para a manipulação e agarrando da sutura, e um bisturi, com uma lâmina. Listamos as ferramentas mais comuns utilizadas por nosso laboratório na Tabela de específicos materiais cirúrgicos e ferramentas. No entanto, a seleção ferramenta final depende das preferências experimentador. </li><li> Preparar o espaço cirurgia. Coloque um 100 mL de 0,9% saco de soro fisiológico estéril sob uma almofada de aquecimento para assegurar que a solução salina que entra em contacto wtecido om o mesentério é pré-aquecido a aproximadamente 37 ° C. Como uma alternativa para a solução salina, é possível utilizar a solução de Ringer ou outro tampão fisiológico. Dispor de instrumentos cirúrgicos esterilizados e suprimentos em uma cortina estéril para fácil acesso durante o processo de exteriorização. Além disso, você vai precisar de aplicadores de algodão estéreis ponta e as apropriadas 3 tipos de suturas (4-0, 5-0 e 7-0). Faz pacotes certeza que são pré-aberta de modo que os materiais podem ser acessados ​​com a manipulação estéril. Finalmente, desinfectar, a fase de pré-modificado de plástico por imersão em etanol a 100% durante pelo menos 5 minutos. A fase é de 100 mm placa de Petri com um furo elíptico cortado no centro (Figura 1). Uma ferramenta Dremel pode ser usado para fazer inicialmente e, se necessário, amplia o furo. Após o buraco é feito, as arestas de corte do plástico são feitas usando um papel liso areia de grãos diferentes. A fase é então lavado e, finalmente, quer argila inerte (adquirido a partir de um armazenamento de artesanato local) ou silicem cola é adicionado à borda do furo, a fim de proporcionar uma elevada superfície lisa. Antes do contacto com o tecido, a fase terá de ser adequadamente lavados com solução salina estéril. </li><li> Para este modelo de angiogênese, que normalmente usam ratos Wistar machos (350 ± 25 g). Outras linhagens de ratos e idades podem ser usados. No nosso laboratório, os ratos são anestesiados por injecção intramuscular com cetamina (80 mg / kg de peso corporal), xilazina (8 mg / kg de peso corporal), e atropina (0,08 mg / kg de peso corporal). Depois de aproximadamente 5 minutos, o efeito da anestesia é confirmada e pele abdominal do rato é raspada. </li></ol> 2. Rat Modelo exteriorização Mesentério <ol><li> Posicionar o rato anestesiado na sua parte traseira de uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo. Técnicas assépticas são utilizados durante o procedimento cirúrgico. Usar luvas estéreis e não permitir que os instrumentos e fontes de entrar em contato com não-estéreis outras superfícies que os tecidos de ratos. </li><li> Limpe a área abdominal com a alternância de toalhetes using a gaze estéril embebido em isopropílico a 70% e iodo. </li><li> Com a lâmina de bisturi, fazer uma incisão (aproximadamente 0,75 polegadas) pequena longitudinal ao longo da pele e, em seguida, a linha alba aproximadamente 1 polegada abaixo do esterno. </li><li> Coloque a cortina de pré-corte sobre a secção abdominal de modo que a abertura se alinha com a incisão. </li><li> Suavemente aplicar pressão em torno da incisão. Isto normalmente irá resultar na exposição do intestino delgado suficiente para que possa ser facilmente identificados. </li><li> Usando os aplicadores de ponta de algodão, puxe cuidadosamente uma secção do intestino delgado e localizar o íleo. À medida que o mesentério é puxado para fora, deve-se suavemente Definiu na fase de plástico (Figura 2). </li><li> Identificar 6-8 janelas mesentéricos vascularizados. Uma janela mesentérica é definida como a membrana fina e translúcida entre os pares de artéria / veia de alimentação do intestino delgado (Figura 2). </li><li> Anote o tempo inicial de exteriorização. Deixe o mesentery seção exteriorizado por 20 minutos. Durante o período de exteriorização, utilizar uma seringa estéril (5 mL) para intermitentemente reabastecer a solução salina na placa de Petri para garantir que o tecido permanece imerso e não secar. </li><li> Durante o tempo de exposição de 20 minutos, marcar os 2 janelas mesentéricos localizados centralmente com sutura 7-0 estéril. As marcas devem ser feitos na área de gordura perto do intestino. </li><li> Retornar a região exteriorizada do mesentério para a cavidade abdominal. </li><li> Feche o músculo abdominal com sutura de monofilamento 5-0 em padrão interrompido. </li><li> Feche a pele com sutura monofilamentar 4-0 em padrão interrompido. </li><li> Limpe a área suturada com a alternância de panos usando a gaze estéril embebida em isopropoyl 70% e iodo. </li><li> Espalhe gel lubrificante olho em ambos os olhos do rato. O objectivo da lubrificação do olho é para evitar a dessecação da córnea durante o procedimento cirúrgico e recuperação. A aplicação de lubrificante olho deve ser aplicadaantes do início da intervenção cirúrgica. Se necessário, a re-aplicar lubrificante olho antes de retornar o rato para a sua gaiola para a recuperação. </li></ol> 3. Coleta de Tecidos e Fixação <ol><li> No dia da estimulação pós interesse, anestesiar e euthanize no rato. No nosso laboratório, os ratos são anestesiados por injecção intramuscular com cetamina (80 mg / kg de peso corporal), xilazina (8 mg / kg de peso corporal), e atropina (0,8 mg / kg de peso corporal) e, em seguida sacrificados por injecção intracardíaca de beuthanasia. Beuthanasia é uma solução de sódio / fenitoína pentobarbital que pode ser usado para a eutanásia rápida e indolor. Por rato nosso laboratório normalmente injeta 0,1-0,2 ml. </li><li> Volte a abrir a cavidade abdominal e remova cuidadosamente o intestino delgado e localizar as janelas de dois marcados. </li><li> Corte cada uma das janelas mesentéricos exteriorizado usando uma pinça e micro-tesouras. Incluindo uma borda da janela por gordura é vantajoso para o tecido mais tarde se espalhando em lâminas de microscópio. Imediatamente, Mergulhe cada janela em PBS. Ao cortar, tentar evitar o corte através da artéria / veia pares dentro da fronteira de gordura do sangue janelas para minimizar o potencial de enchimento do windows. Além disso, minimizar o corte através do intestino, que resulta em conteúdo intestinal contactando as janelas. </li><li> Use fórceps para espalhar tecidos em lâminas de microscópio carregados positivamente. Dois tecidos pode ser montado por lâmina. </li><li> Permitir que os tecidos para secar parcialmente e usando uma lâmina de bisturi remover o excesso de gordura. </li><li> Os tecidos são agora pronto para ser corrigido. Métodos de fixação típicos podem ser usados. No nosso laboratório, que vulgarmente fixar as lâminas em metanol (-20 ° C) durante 30 min. Rotulagem bem sucedido foi também realizada com tecidos não fixadas. Métodos de fixação pode depender de seu anticorpo preferido. </li></ol> 4. Imunomarcação tecido <ol><li> Os tecidos podem geralmente ser agora identificadas de acordo com instruções por anticorpo para imuno-histoquímica. Dado o nosso interesse em identificar os papéisde pericitos vasculares durante a angiogênese, o nosso laboratório comumente rotula de células endoteliais e perivasculares 10, 12, 13. Etiquetas útil para identificar células endoteliais ao longo da hierarquia das redes microvasculares são um anticorpo anti-PECAM ou BSI lectina. Marcadores de células perivasculares utilizados neste tecido incluem NG2, desmina, SM-α actina, PDFGRβ, e classe III β-tubulina. Abaixo, na seção 3.3, há uma lista de protocolos para os protocolos imunomarcação colorimétricos e fluorescentes PECAM. </li><li> Antes da incubação com anticorpo primário inicial, as lâminas são secos sob vácuo para remover excesso de solução tampão. Além disso, os tecidos são inicialmente descrito com uma caneta de cera para evitar o fluxo de descontrolada de soluções de anticorpos de distância a partir do tecido. Finalmente, todos os passos de etiquetagem são seguidos por passos de lavagem. Para lavar os passos, as lâminas são colocadas dentro de tinas de coloração. A solução tampão é trocado 3 vezes durante a duração de lavagem. </li><li> Células endoteliais de anticorpos procedimentos de rotulagem: &lt;classe p = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM colorimétrico Lableing <ol><li> Incubação do anticorpo primário: gotejamento aproximadamente 100-200 mL de solução de anticorpo primário (1:200 monoclonal de ratinho CD31 anticorpo biotinilado diluído em tampão de anticorpo (0,1% de saponina em PBS + BSA a 2%)) no topo de cada tecido; certificar-se de todo o tecido é coberta com uma solução de anticorpo. Incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Incubação do anticorpo secundário: gotejamento solução de anticorpo secundário (Vectastain Elite ABC solução de Vector Laboratories; uma peroxidase estreptavidina solução de anticorpo secundário) na parte superior dos tecidos. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Incubar os tecidos com Vector Nova Red durante 15 minutos. Em seguida, subir tecidos com água. </li><li> Lâminas de montagem: Dip lâminas em etanol 95% 10 vezes. Imergir desliza em etanol a 100% durante 2 minutos. Imergir as lâminas em outro etanol 100% paralução durante 2 minutos. Em seguida, Imergir as lâminas em consecutivos soluções xileno 100% durante 2 minutos cada. Deixa-se secar e cobrir tecidos com uma fina camada de VectaMount e uma lamela. </li></ol> PECAM marcação fluorescente <ol><li> Incubação do anticorpo primário: gotejamento aproximadamente 100-200 mL de solução de anticorpo primário (1:200 monoclonal de ratinho CD31 anticorpo biotinilado diluído em tampão de anticorpo (0,1% de saponina em PBS + BSA a 2%)) no topo de cada tecido; certificar-se de todo o tecido é coberta com uma solução de anticorpo. Incubação durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Incubação do anticorpo secundário:. Gotejamento solução de anticorpo secundário ((1:100 Estreptavidina-Cy3 diluído em tampão de anticorpo (0,1% de saponina em PBS + BSA a 2%)) no topo de tecidos Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Lavar os tecidos com PBS saponina 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Lâminas de montagem: gotejamento 50:50 PBS com glicerol em cima dos tecidos. Cobrircom lamínula. Em seguida, use unhas polonês para selar o intervalo entre lamínula e slide. </li></ol></li></ol> 5. Os resultados representativos Imagens representativas de tecidos de rato mesentério imuno etiquetadas para PECAM são apresentados na Figura 3. PECAM rotulagem identifica todos os tipos de navios ao longo da hierarquia de remodelação redes microvasculares e pode ser usado para quantificar as métricas angiogénicas em específica estimulação pós pontos de tempo. PECAM rotulagem também permite a determinação de arteríolas, versus vénulas. Arteríolas alimentação exibem tipicamente diâmetros menores e morfologia de célula endotelial alongada em comparação com vénulas emparelhados (Figura 4). Capilares e rebentos capilares podem ser identificados com base na sua diâmetro do vaso e posição relativa dentro de uma rede. As características típicas de redes de remodelação incluem o aumento da densidade de vasos capilares brotando, área vascularizada e tortuos venularesdade. Quantificação de várias métricas angiogénicos identifica o tempo de curso do crescimento da rede (Figura 5). Capilar germinação a partir de vasos pré-existentes, picos entre o dia 3 eo dia 5 e retorna para o nível não estimulada por dia 10. Este aumento transitório na germinação é seguido por um aumento na densidade vascular e área vascularizada. Como evidência para a remodelação dos vasos maiores neste modelo, o número de segmentos das arteríolas e vénula também aumenta ao longo do tempo. No nosso laboratório, este modelo tem sido utilizado para identificar alterações celulares fenotípicas no ponto de tempo específico durante este processo de remodelação 10, 11. Por exemplo, a classe III β-tubulina identifica pericitos ao longo dos vasos angiogénicas (Figura 6). Em tecidos não estimuladas, classe III expressão β-tubulina é específico do nervo. Em contraste, durante o pico de germinação capilar, classe III β-tubulina é expressa pelas células perivasculares. Este tipode resultado destaca a utilização deste modelo simples e robusta angiogénico para identificar novos tipos de células envolvidas no processo angiogénico. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Figura 1. Imagens da fase de plástico pré e pós-modificação. A fase de pré-modificado é de 100 mm placa de Petri. As modificações incluem um corte furo elíptico no centro ea subsequente adição de argila ou uma cola de silicone para a borda do orifício para a criação de uma elevada superfície lisa. Esta superfície fornece um limite interno que facilita superfusão das janelas mesentéricos exteriorizado. Barra de escala é de 1 cm. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem da região mesentérica exteriorizado. Janelas mesentéricos são definidos como as membranas finas translúcidas entre os pares de artéria / veia de alimentação do intestino delgado. Durante a exteriorizaçãoduração, a região mesentérica é colocado para fora e imerso em solução salina no interior de uma placa de Petri modificado. Plasticina amarelo inerte proporciona uma superfície lisa para o mesentério a ser puxado através do orifício pré-cortado. Barra de escala é de 1 cm. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens representativas dos mesentéricos redes microvasculares de tecidos e tecidos não estimuladas a 3 e 10 dias após a exteriorização do mesentério. PECAM rotulagem identificou a hierarquia de redes microvasculares, incluindo, arteríolas (A), vénulas (V) e capilares (C). Estimulação Post, redes microvasculares apresentado um aumento na germinação capilar (cabeças de seta) e densidade de vasos. Barra de escala é 100 mm. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Figura 4. Imagens representativas da arteríola / vênula pares dentro adulto rede microvascular mesentérico de ratos. Em ambas as imagens, arteríolas (A) pode ser diferenciada de vénulas (V) com base em um diâmetro menor relativa e morfologia das células alongada endotelial. Barras de escala são 20 microns. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Figura 5. Quantificação representativas de métricas angiogénicos ao longo do decurso de tempo de microvascular exteriorização mesentério crescimento pós. A) área por área de tecido vascular. B) O número de brotos capilares por área vascular. C) Comprimento total vascular por área vascular. * Representa diferença significativa quando comparado ao grupo não estimulado. As comparações estatísticas foram feitas usando uma ANOVA One-Way seguida pelo teste de Dunn. (P &lt;0,05). ONU representa desestimulados. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Figura 6. Representativos imagens fluorescentes de mesentéricos redes microvasculares a partir de tecidos não estimuladas e tecidos em 3 e 10dias após o exteriorização do mesentério. Imunofluorescência PECAM rotulagem (vermelho) identifica as células endoteliais, e classe III rotulagem β-tubulina (verde) identifica os nervos (cabeças de seta) e células perivasculares (setas). Células perivasculares transitoriamente upregulate classe III β-tubulina durante capilar brotação. Em não estimuladas redes microvasculares, classe III β-tubulina é nervo específico e não identifica as células perivasculares. 3 dias após a estimulação, classe III β-tubulina positivamente rotula células perivasculares juntamente microvasos. Por dia 10, classe III padrão de expressão β-tubulina começa a voltar para o cenário não estimulada. Barra de escala é de 50 mM. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Figura 7. Imagens de apoio a viabilidade de rastreio pré-células marcadas aplicados localmente durante o crescimento da rede microvascular estimulada pela exteriorização mesentério. As células foram superfused sobre mesenterIC janelas durante o período de exteriorização de 20 minutos. 1 dia após a cirurgia, as células marcadas DII (vermelho), foram observados no plano focal Dame com PECAM positivo microvasos (verde). A, B) Exemplos de células de medula óssea que exibem DII rotulados arredondado e alongado morfologias. Em alguns casos (setas) ao longo de células foram alongadas microvasos. C) Exemplo de um aglomerado de DiI rotulado células estaminais mesenquimais perto da ponta de um capilar broto (seta). Barras de escala são 50 mM (A), e 20 uM (B, C).

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Não temos nada a divulgar.

O modelo de exteriorização foi relatado em 2006 e é adaptado de lesões mecânicas anteriores modelos de ratos mesentério de angiogênese 4-7 e produz resultados semelhantes aos bem estabelecidos modelos de injeção IP que se aproveitam do rato mesentério 9. O tempo de exteriorização 20 minutos foi determinado experimentalmente para produzir uma resposta robusta angiogênico. Embora este período de tempo pode ser variada, ele permite que a aplicação local de inibidores angiogénicos 4 para estudos mecanísticos e aplicação directa de células exógenas para estudos linhagem celular. Viabilidade da incorporação da célula em remodelação do tecido mesentérica é apoiada por estudos preliminares em nosso laboratório usando células ósseas pré-rotulados de medula e células-tronco mesenquimais (Figura 7), e pelo sucesso de investigar o destino do ser humano ip injeção derivadas de tecido adiposo células do estroma 14 . Em nosso laboratório, utilizamos este modelo para identificar phen pericytealterações otypic ao longo do tempo da resposta angiogénica 10 e para avaliar o potencial angiogénico durante condições patológicas, tais como hipertensão 12. A resposta angiogénica e alterações celulares fenótipo associado com este modelo pode também ser observada em modelos de ratos outros mesentéricos angiogénicos, incluindo a exposição a hipóxia crónica 10, 11. Uma limitação do modelo exteriorização é que os mecanismos exactos desencadeadores de angiogénese são desconhecidos. Exteriorização do mesentério tem sido associada a degranulação dos mastócitos e aumento dos níveis de histamina 6, ainda mais investigação é necessária para ter mais conhecimento. O estímulo angiogênico é, sem dúvida, multi-fatorial, produzindo uma resposta de remodelação robusta em toda a hierarquia de uma rede microvascular. Enquanto os mecanismos desconhecidos continuam a ser uma grande crítica deste modelo, a sua reprodutibilidade e simplicidade o tornam atraente para identificar a dinâmica celular envolvived no processo inerentemente complexo capilar brotação. A reprodutibilidade do modelo é suportado por comparáveis ​​métricas angiogénicos ao longo do tempo de curso do crescimento da rede microvascular através estirpes de ratos múltiplas (Wistar macho e fêmea Sprague-Dawley) em estudos anteriormente publicados do nosso laboratório 10, 12. Uma vez que, na maioria dos tecidos mesentéricos adultos ratos são vascularizados, o modelo também permite a múltiplos tecidos a serem examinadas por animal. Infelizmente, este modelo não é obviamente aplicável aos modelos de mouse genéticos como janelas mesentéricos rato tem menos vascularização nativa e, em nossa experiência, geralmente carecem de observáveis ​​redes de ramificação. Aplicativos futuros incluem a investigação de funcionalidade navio durante a angiogênese usando microscopia intra-vital em momentos específicos e relacionados com a investigação da dinâmica celulares envolvidos na linfangiogênese e neurogênese. Embora a extensão da vascularização nativo por janela mesentérica parece ser roughly proporcional com a idade, observou-se ramificando redes microvasculares em ratos Wistar machos jovens como 4-5 semanas de idade. Estas observações sugerem que o modelo exteriorização pode também ser aplicado para comparar as diferenças angiogénicas em toda idades.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários adicionais </td></tr><tr><td> Drape </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Esterilização Bio-Shield regular Wraps </td></tr><tr><td> Noyes Scissor Micro </td><td> Roboz Instrumento cirúrgico </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Dissecando Tesoura de mola; Retas, Sharp-Blunt pontos; vanguarda 13 milímetros, largura Dica 0.25mm, 4 1/2 &quot;Comprimento total </td></tr><tr><td> Pinça Graefe </td><td> Roboz Instrumento cirúrgico </td><td> RS-5135 </td><td> Micro Pinças de dissecação; serrilhada; ligeira curva; Largura Dica 0,8 milímetros; 4 Comprimento &quot; </td></tr><tr><td> Pinça Graefe </td><td> Roboz Instrumento cirúrgico </td><td> RS-5130 </td><td> Micro Pinças de dissecação; serrilhadas, reto, largura 0,8 milímetros; Dica 4 de comprimento &quot; </td></tr&gt; <tr><td> Sutura 4-0 </td><td> ETHICON </td><td> 699G </td><td> (1,5 métrico) ETHILON sutura de monofilamento nylon preto </td></tr><tr><td> 5-0 sutura </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1,0 métrico) PROLENE Polyprolene sutura monofilamento azul </td></tr><tr><td> 7-0 sutura </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0,5 métrico) ETHILON sutura de monofilamento nylon preto </td></tr><tr><td> Porta Agulha Castroviejo Micro </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 12060-02 </td><td> Largura Dica: 0,6 milímetros Fixação Comprimento: 5mm Comprimento: 9cm Ponta reta </td></tr><tr><td> Porta Agulha Castroviejo </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 12565-14 </td><td> Tip Shape: Straight Dica Largura: 1,5 mm Comprimento de fixação: 10mm Tesoura: Não Bloqueio: Sim Comprimento: 14cm Serrilhada: Sim </td></tr><tr><td> Handle bisturi </td><td> Roboz Instrumento cirúrgico </td><td> RS-9843 </td><td> Bisturi Handle, # 3; Sólidos; 4 Comprimento &quot; </td></tr><tr><td> Lâmina cirúrgica estéril </td><td> Cincinnati Cirúrgica </td><td> 0110 </td><td> Aço inoxidável, Tamanho 10 </td></tr><tr><td> Placa de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Cume chanfrado, Slippable </td></tr></tbody></table> Tabela de específicos materiais cirúrgicos e ferramentas. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários adicionais </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp União (ordenada da MWI Abastecimento Veterinária) </td><td> MWI #: 011168 </td><td> Ingrediente ativo: por 100mL, 390 mg de sódio pentobarbital de sódio 50mg fenitoína </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Fort Dodge Saúde Animal (ordenada da MWI Abastecimento Veterinária) </td><td> MWI #: 000680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> LLOYD. Inc. (Ordenados do MWI Abastecimento Veterinária) </td><td> MWI #: 009307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Salina </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Nova Vermelha </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela de reagentes específicos

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

O crescimento da rede Microvacular e remodelação são aspectos críticos da cicatrização de feridas, inflamação, retinopatia diabética, crescimento tumoral e outras condições de doença 1, 2. Crescimento da rede é comumente atribuída a angiogênese, definido como o crescimento de novos vasos a partir de vasos pré-existentes. O processo angiogénico está também directamente ligado ao arteriogênese, definida como a aquisição capilar de um revestimento de célula perivascular e alargamento do vaso. Escusado será dizer que, a angiogênese é complexo e envolve vários jogadores a nível celular e molecular 3. Entender como uma rede microvascular cresce exige a identificação da dinâmica espacial e temporal ao longo da hierarquia de uma rede ao longo do tempo de angiogênese. Esta informação é crítica para o desenvolvimento de terapias destinadas a manipular o crescimento dos vasos. O modelo de exteriorização descrito neste artigo representa um modelo simples e reprodutível para estimularcirculantes angiogênese no mesentério de ratos. Foi adaptado a partir de cicatrização de feridas modelos no rato mesentério 4-7, e é uma alternativa para estimular a angiogénese no mesentério através de injecções ip de pró-angiogénicos agentes 8, 9. O modelo de exteriorização é atraente porque requer a intervenção cirúrgica mínima e produz aumentos dramáticos, reprodutíveis em brotos capilares, área vascular e da densidade vascular ao longo de um curso de tempo relativamente curto em um tecido que permite a visualização bidimensional de redes microvasculares inteiras para baixo para único nível celular. O crescimento estimulado reflecte naturais respostas angiogénicas em um ambiente fisiológico, sem interferência de estrangeiros moléculas angiogénicas. Usando métodos de marcação imuno-histoquímica, este modelo já demonstrou ser extremamente útil na identificação de novos eventos celulares envolvidos na angiogênese. Os investigadores podem prontamente correlacionar as métricas angiogénicos durante o curso de tempo de remodelação com o tempo spdinâmica ecific, tais como celulares alterações fenotípicas ou interações celulares 4, 5, 7, 10, 11.

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Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Este artigo descreve um modelo simples para estimular a angiogênese no mesentério de ratos. O modelo produz aumentos dramáticos na capilar germinação área, vascular e da densidade vascular ao longo de um curso de tempo relativamente curto em um tecido que permite a visualização en face de todo redes microvasculares para baixo para o nível da célula individual.

Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K visualizações.  Tulane University. Este artigo descreve um modelo simples para estimular a angiogênese no mesentério de ratos. O modelo produz aumentos dramáticos na capilar germinação área, vascular e da densidade vascular ao longo de um curso de tempo relativamente curto em um tecido que permite a visualização en face de todo redes microvasculares para baixo para o nível da célula individual.

Vídeo: Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Biologia

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

A Assembleia e Aplicação de &#39;tesoura Anéis&#39;: A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...