Sou grato a Ronald L. Calabrese, Jaeger Dieter (Emory University) e Yuhas Ward (Axon Instruments) para discussões técnicas úteis.

<ol><li> Fatias de cérebro do hipotálamo são preparadas, incubadas e transferidos para a câmara de gravação como anteriormente detalhada (9) em animais cujos neurônios GnRH expressam a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor peptídeo GnRH (10). Após a remoção do cérebro do animal, o cérebro é bloqueado usando uma lâmina de barbear para eliminar as regiões que não são de interesse. A fim de determinar as regiões de remover, o cérebro é colocado em sua superfície dorsal, para que o hipotálamo pode ser visualizado. Tanto para as orientações corte coronal e sagital, o cerebelo é removido. Para a preparação de corte coronal, a porção rostral do córtex é removido. Nesta orientação fatia, as regiões laterais do córtex fornecer suporte para cortar o cérebro e proporcionar área suficiente do cérebro para a colocação de fios de prata para proteger o cérebro na câmara de gravação. Para a preparação fatia sagital, as regiões laterais do cérebro são removidas e as porções rostral do córtex fornecer o apoio para o cérebro corte e para a colocação de fios de prata para proteger o cérebro na gravação também. Durante todo o processo de bloqueio, o cérebro está continuamente umedecida com o frio do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) utilizando uma pipeta de vidro. </li><li> Uma pequena quantidade de Superglue é colocado na plataforma de corte. O cérebro é levantado com uma espátula. ACSF excesso é removido por trazer um Kimwipe à superfície da espátula e desenho ACSF excesso longe do cérebro. O cérebro é suavemente deslizou em frente para a cola. É importante não tocar no cérebro ou empurrar para baixo sobre ele, a fim de prendê-lo. O peso do cérebro em si é geralmente suficiente para garantir que é seguro. </li><li> Do cérebro e da plataforma de corte é então presa ao micrótomo vibrando e assim o corte é preenchido com ACSF frio. A solução fria ambas as empresas o cérebro e pode proteger contra danos durante o procedimento de corte. Diferentes regiões do cérebro variam no grau de frieza que otimiza fatias de qualidade. A temperatura do ACSF para a preparação de fatias de hipotálamo é geralmente 0 ° C. </li><li> Fatias devem ser cortadas de forma lenta e cada fatia deve flutuar livremente longe do cérebro. Se começar a enrolar as fatias durante o corte, a velocidade com que a lâmina está avançando deve ser retardado. Pode-se usar um pincel pequeno para fatias uncurl mas este corre o risco de danificar as fatias e, portanto, deve ser evitado. Lentamente, a velocidade de avanço da lâmina é preferido sobre o uso de um pincel. </li><li> Como cada fatia é cortada a partir do cérebro, é retirado da câmara de corte e colocados em uma câmara de incubação fatia em um banho de água morna (aproximadamente 32 ° C). A fatia incubadora é continuamente fornecido com oxigênio usando uma mistura de 95% O 2 e 5% CO 2. Geralmente, os pré-gravação varia fatia de incubação de 30 minutos a 2 horas. </li><li> Pipetas de vidro (3-6 mohms) são fabricados conforme descrito anteriormente (9) com um puxador vertical. A temperatura ea duração de puxar varia de acordo com o tipo de pipeta utiliza um extrator, o tipo de vidro se usa eo tempo de vida do filamento de aquecimento do extrator. A forma da ponta da pipeta também pode variar, dependendo da preferência do usuário. Temos conseguido um bom sucesso com uma ponta uniformemente cônico com uma abertura de 0,1 mm. Aberturas maiores na pipeta tendem a danificar os neurônios enquanto aberturas menores não resultarem em gravações de longa duração. </li><li> Pipetas revestido com Sylgard para reduzir a capacitância. Ponteiras são levemente puxados revestido com Sylgard 184 utilizando uma pipeta segundo. Dicas Sylgarded são, então, calor curado usando uma pistola de calor. Estas pipetas são preenchidos com o perfusato banho. Para aumentar a visualização das ponteiras, uma pequena quantidade de Alexa-568 é adicionado à parte da solução de banho para ser usado como a solução da pipeta antes de preencher as pipetas. Nós não pesar o Alexa-568, mas sim usar o suficiente para transformar o pink solução por olho. As pontas da pipeta pode ser visualizado sob o vermelho Texas filtro. </li><li> Nós desenvolvemos uma abordagem para obter grampo corrente gravações para a detecção de potenciais de ação usando selos de baixa resistência (ver Discussão). As gravações são realizadas em potencial endógeno das células de descanso com Axoclamp 2B não aplicada Instrumento Axon atual usando o. No entanto, devido ao selo de baixa resistência, não se poderia detectar potenciais de ação com apenas o amplificador 2B. Para aumentar o sinal, um amplificador de segunda (AM Sistemas de 3000) é usado em série com a 2B Axoclamp. Esta abordagem tem a facilidade de selos soltos e utilidade de gravações a longo prazo. Tecnicamente, pode-se medir diretamente a potenciais de ação, contornando assim os problemas com a abordagem no modo de gravação de tensão-clamp (ver discussão). </li><li> Um leva duas pipetas para a superfície dos dois neurônios previamente selecionados, ao mesmo tempo, de forma semelhante como a abordagem para a configuração de toda célula de gravação. Aproximando-se tanto neurons ao mesmo tempo, tem sido mais bem sucedido em obter as gravações dupla de tentar cada neurônio do par de forma independente. Durante este tempo, os pulsos de injeção de corrente são passadas do amplificador 2B como é feito durante a aproximação para a célula inteira gravações. </li><li> Pressão positiva deve ser mantida em ambas as pipetas para evitar o entupimento da ponta. Pressão positiva para as gravações é a melhor dupla gerados pela utilização de uma seringa de 3 ml por preencher vazios anexados ao titular da pipeta por um período de pedaço de tubo. Uso de seringas permite manter a pressão sobre ambos os pipetas. Pressão positiva deve ser aplicada assim que a pipeta foi colocada na solução de banho da câmara de gravação. Se aborda os neurônios selecionados com as pipetas seqüencialmente. Depois de posicionar a pipeta primeiro diretamente sobre a maior superfície do neurônio, se mantém positivo, deixando a seringa no local e deixa a pipeta nesta posição. Um retorna ao topo da câmara de gravação e reduz a pipeta segunda gravação para a posição. Neurônios selecionados são, muitas vezes em diferentes níveis da fatia. A pipeta primeiro deve ser posicionado sobre o neurônio que é o mais profundo na fatia e posição da pipeta no segundo neurônio mais superficial. Isso evita que o posicionamento da pipeta segundo de mudar o posicionamento da pipeta segundo como a fatia irá mover-se ligeiramente no plano vertical como pipetas entrar na fatia. </li><li> Selos soltos (18-30 mohms) será usado. A pressão positiva irá induzir uma pequena covinha na superfície de cada célula. Uma tentativa de selar o primeiro neurônio, liberando pressão positiva e aplicação muito ligeira pressão negativa. A pressão positiva é liberado por retirar a seringa. De sucção com a boca é então aplicado à extremidade livre do tubo. Um neurônio membrana saudável irá responder rapidamente à liberação de pressão positiva e aderir à pipeta. Ligeira sucção irá formar uma vedação com resistência adequada em um neurônio saudável. </li> <li> Quando se tenta selar um neurônio e falhar, a pipeta não pode ser reutilizado desde membranas só selo para muito limpa vidro. Em vez disso, uma levanta a pipeta (e objetiva do microscópio) de distância da superfície da fatia para o topo da perfusão bem, remove a pipeta do banho, muda para uma pipeta limpa e depois volta para a fatia para tentar selar outra célula . Por essas razões, é importante para selecionar vários neurônios potencial para as gravações. Para fatias com menos de 4-6 neurônios qualidade de gravação de que para escolher, o sucesso na obtenção de gravações dupla é limitada. </li><li> Depois de estabelecer um selo soltos com base na resistência, os pulsos de injeção de corrente do amplificador 2B são encerrados. O amplifer 2B é colocado em série com o amplificador da série 3000. Nesta configuração, a saída do amplificador 2B serve como entrada para o amplificador da série 3000. O amplifer último fornece sinal para aquisição de dados. </li><li> O selo (passo 4) e reconfiguração do amplificador de (passo 5) é então repetido para o segundo neurônio. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Um período de aumento de disparo em dois neurônios GnRH utilizando a configuração solta selo de gravação anexada em uma preparação fatia sagital. A fatia foi derivado de um macho castrado. Cada deflexão para cima indica um potencial de ação. Note-se que um neurônio GnRH (traços em cima) apresenta disparar quase contínua, enquanto o segundo GnRH neurônio apresenta rajadas intermitentes. Este padrão de atividade de neurônios individuais GnRH é semelhante ao de unidades individuais extraídas da unidade de multi-gravações durante a secreção hormonal in vivo (7). Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1.

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A atividade de interesse em alguns neurônios, incluindo os neurônios GnRH (com base na secreção de hormônios) ocorre em escalas de tempo de horas (5-7). Portanto, a configuração da célula de todo não é a melhor escolha para algumas metas experimental devido à diálise de mensageiros intracelulares no modo de toda célula de gravação. Secundariamente, de célula inteira gravações são geralmente limitada a animais com menos de cerca de 120 dias de idade. Com a idade, membranas neuronais parecem endurecer, tornando vedações de alta resistência difícil de alcançar. Além disso, se obtém-se um selo de alta resistência, rompendo o patch rompe o selo, deixando um buraco entre a pipeta ea membrana. Isto leva a uma gravação inutilizável e um neurônio que rapidamente morrem devido a desequilíbrios iônicos. Ciclos ovariano regular, e, assim, a atividade estável do gerador de pulsos de GnRH não ocorre até mais tarde na vida (7-10 meses de idade em C57BL6 fêmeas, 11, 12), para além da idade quando se pode razoavelmente prever a obtenção de célula inteira gravações de forma confiável. Finalmente, de célula inteira gravações destruir as relações endógenas das concentrações dos íons internos e externos. Com gravações de células inteiras, a concentração interna de qualquer íon é igual à concentração do íon na solução da pipeta. Isso ocorre porque a solução de pipeta de volume relativamente grande rapidamente atinge o equilíbrio com / substitui o volume relativamente pequeno endógena da célula. A abordagem de células soltas anexado contorna muitas das limitações de toda célula gravações. Primeiro, um selo de baixa resistência (15-30 mohms) pode ser usado. Estas são relativamente fáceis de forma ainda nos neurônios de animais mais velhos. Em segundo lugar, não é o patch ruptura da membrana selada. Portanto, as gravações de células soltas anexados são tecnicamente muito mais fácil do que de célula inteira gravações. Além disso, uma vez que a membrana celular está intacta, a diálise de componentes intracelulares não ocorre e endógenos relações iônicas são preservadas. Não se pode usar a abordagem de células soltas em anexo para estudar as correntes sinápticas mas é ideal para gravações a longo prazo dos neurônios de uma forma relativamente não-invasivo. As gravações de células-anexado também podem ser realizadas usando qualquer solução padrão intracelular na pipeta. Isto oferece a vantagem adicional de ruptura do remendo de membrana quando a gravação de longa duração está concluído e rotulagem do neurônio com um marcador intracelular. A abordagem de células soltas anexado tem sido usada no modo de gravação de tensão-clamp. No entanto, a tensão de clamp de gravação na configuração da célula solta anexado tem vários problemas metodológicos. Primeiro, o sinal gravado é uma medida indireta de atividade. O sinal que é medido (como a ação chamada atual) é a corrente capacitiva que as taxas de membrana (13). Esta é uma questão extremamente importante metodológicas. A capacitância ea resistência de uma pipeta de gravação pode filtrar o sinal gravado. É muito provável que as correntes pequena ação são perdidos no carregamento da capacitância da pipeta que, não pode ser devidamente compensados ​​com a maioria dos amplificadores, devido à alta resistência do headstage. Quando estes sinais passam despercebidos, o padrão de ativação aparente do neurônio não reflete o padrão de disparo verdade. Do mesmo modo, pipetar descompensada e resistências selo causar erros significativos nas medidas durante as mudanças de correntes como quando a ação se expressam (13). Alguns amplificadores fornecem capacitância e &quot;compensação&quot; de resistência para a pipeta e vedação, o que limita a perda de sinal, mas estágios de alta resistência cabeça da maioria dos amplificadores impedem a compensação ideal. Em segundo lugar, uma situação artificial é imposta sobre a célula. Na tensão de clamp-mode, a área ao redor da membrana celular é mantido a um potencial fixo, nesses estudos, 0 mV. Isso não significa que não há corrente aplicada à membrana celular. O sinal medido em tensão de grampo é realmente a quantidade de corrente aplicada à membrana para manter o potencial fixo. Portanto, esta corrente aplicada pode alterar a atividade celular. Gravações duplo no sistema de GnRH são particularmente difícil devido ao número limitado de neurônios GnRH e sua distribuição difusa. Para gravações de dupla para ser bem sucedido, o manipulador deve ser extremamente estável. Mesmo ligeiro movimento do eletrodo pode causar a pipeta para escorregar o neurônio e terminar a gravação. Além disso, o movimento da pipeta sobre a célula (por exemplo, re-posicionamento para compensar o movimento) pode alterar padrões de disparo. Alguns canais de íon, tais canais de cálcio tipo-N são mecanicamente sensíveis: trecho da membrana faz com que atividade repetitiva em configurações de gravação tanto de célula inteira e celular ligado (14). Finalmente, o sistema manipulador deve ser capaz de movimento extremamente fina e lisa. Como observado acima, com gravações dupla, um leva duas pipetas para a superfície dos dois neurônios previamente selecionados, ao mesmo tempo e as tentativas de fecharum neurônio. Se for bem sucedido, então as tentativas de fechar a segunda célula. Geralmente, não se pode esperar para selar e ter uma gravação de alta qualidade a cada tentativa. Isso, no entanto, cria um problema particular com gravações dual. Se um for bem sucedido com o primeiro neurônio, mas não com o segundo, é preciso mudar a pipeta e tentar uma célula diferente. Portanto, deve ser capaz de se mover tanto o objectivo de imersão do microscópio e da pipeta para o topo da perfusão bem (para alterar a pipeta) sem interromper o neurônio com sucesso selado. Nosso desenvolvimento e uso da abordagem de células-anexado solta para gravações dupla é um grande avanço técnico em estudar neurônios GnRH. É provável produzir resultados úteis que irão ajudar a mover o campo para a frente, no contexto da questão crítica do que os mecanismos subjacentes à atividade coordenada que resulta em pulsátil secreção hormonal.

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

Hormônio Liberador de Gonadotropina (GnRH) é um neuropeptídeo de pequeno porte que regula a liberação hipofisária do hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH). Estes gonadotrofinas são essenciais para a regulação da função reprodutiva. Os neurônios GnRH contendo estão distribuídos difusamente pelo hipotálamo e projeto para a eminência mediana onde liberam GnRH a partir de seus terminais de axônios no sistema portal hypophysiotropic (1). Nos capilares portal, GnRH viaja para a glândula hipófise para estimular a liberação de gonadotrofinas na circulação sistêmica. Liberação de GnRH não é contínua, mas ocorre em pulsos episódica. Está bem estabelecido que a maneira intermitente de liberação de GnRH é essencial para a reprodução (2, 3). Coordenação da atividade dos neurônios GnRH, provavelmente, vários pulsos de GnRH está subjacente. Peptídeo conteúdo total em neurônios GnRH é de aproximadamente 1,0 pg / célula (4), dos quais 30% de probabilidade compreende o conjunto liberável. Níveis de GnRH durante um pulso (5, 6), sugerem múltiplos neurônios GnRH provavelmente estão envolvidos na Neurossecreção. Da mesma forma, a atividade única unidade extraído hipotálamo multi-unit gravações durante a libertação de LH indica mudanças na atividade dos neurônios múltiplos (7). Os eletrodos com atividade registrada durante pulsos de LH estão associados com qualquer somata GnRH ou fibras (8). Portanto, pelo menos algumas dessas atividades decorre de neurônios GnRH. Os mecanismos que resultam em demissão sincronizado nos neurônios GnRH hipotalâmico são desconhecidos. Elucidar os mecanismos que coordenam a disparar em neurônios GnRH é um problema complexo. Primeiro, os neurônios GnRH são relativamente poucos em número. Em roedores, há 800-2500 neurônios GnRH. Não é claro que todos os neurônios GnRH estão envolvidos na liberação de GnRH episódica. Além disso, os neurônios GnRH são difusamente distribuídos (1). Isso tem complicado a nossa compreensão da coordenação de queima e tem feito muitas abordagens técnicas intratável. Nós otimizamos solta células anexado gravações em pinça de corrente para o modo de detecção direta de potenciais de ação e desenvolveu uma abordagem de gravação que permite gravações simultâneas de pares de neurônios GnRH.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Atividade neuronal em sistemas muitas vezes exige descargas ação síncrona potencial de neurônios dentro de uma população específica. Por exemplo, pulsos de hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) provavelmente exigirá atividade coordenada entre os neurônios GnRH. Apresentamos nossa abordagem metodológica para a obtenção simultânea confiável gravações eletrofisiológicas dos neurônios GnRH difusamente distribuídas.

Dupla Recordings somática de Hormônio Liberador de Gonadotropina (GnRH) Neurônios Identificados por proteína verde fluorescente (GFP) em fatias Hypothalamic

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K visualizações.  University of Texas San Antonio - UTSA. Atividade neuronal em sistemas muitas vezes exige descargas ação síncrona potencial de neurônios dentro de uma população específica. Por exemplo, pulsos de hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) provavelmente exigirá atividade coordenada entre os neurônios GnRH. Apresentamos nossa abordagem metodológica para a obtenção simultânea confiável gravações eletrofisiológicas dos neurônios GnRH difusamente distribuídas.

Vídeo: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...