Doy las gracias a Ronald L. Calabrese, Dieter Jaeger (Emory University) y Ward Yuhas (Axon Instruments) para útiles discusiones técnicas.

<ol><li> Rebanadas hipotálamo del cerebro se preparan, se incuban y se transfiere a la cámara de grabación como se ha detallado anteriormente (9) en los animales, cuyas neuronas GnRH expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor del péptido GnRH (10). Después de la extracción del cerebro del animal, el cerebro se bloquea con una cuchilla de afeitar para eliminar las zonas que no son de su interés. Con el fin de determinar las regiones a eliminar, el cerebro se coloca en la superficie dorsal de manera que el hipotálamo puede ser visualizada. Por tanto las orientaciones corte coronal y sagital, el cerebelo se ha eliminado. Para la preparación corte coronal, la porción rostral de la corteza se extrae. En esta orientación rebanada, la región lateral de la corteza proporcionan apoyo para cortar el cerebro y proporcionar suficiente área del cerebro para la colocación de alambres de plata para asegurar que el cerebro en la cámara de grabación. Para la preparación corte sagital, las regiones laterales del cerebro se eliminan y la parte rostral de la corteza proporcionan el apoyo para el cerebro de corte y la colocación de alambres de plata para asegurar que el cerebro en la grabación también. A lo largo del procedimiento de bloqueo, el cerebro está continuamente humedecido con el líquido frío artificial cefalorraquídeo (ACSF) utilizando una pipeta de vidrio. </li><li> Una pequeña cantidad de pegamento se coloca en la plataforma de corte. El cerebro se levanta con una espátula. El exceso de ACSF se elimina por traer un Kimwipe a la superficie de la espátula y el dibujo ACSF sobrante del cerebro. El cerebro es suavemente se deslizó hacia delante en la cola. Es importante no tocar el cerebro o el empuje hacia abajo en él con el fin de asegurarla. El peso del cerebro en sí es suficiente para garantizar su seguridad. </li><li> El cerebro y la plataforma de corte entonces se asegura que el microtomo vibración y el corte y se llena de frío ACSF. La solución fría de ambas empresas en el cerebro y puede proteger de posibles daños durante el procedimiento de corte. Diferentes regiones del cerebro varían en el grado de frialdad que optimiza la calidad de las rebanadas. La temperatura de la ACSF para la preparación de cortes hipotálamo es generalmente de 0 ° C. </li><li> Lonchas deben ser cortadas y poco a poco cada corte debe flotar libremente fuera del cerebro. Si los segmentos empiezan a curvarse durante el corte, la velocidad a la que la hoja se debe avanzar más lento. Se puede utilizar un pincel pequeño para desenroscar rodajas, pero esto es el riesgo de dañar los cortes y por lo tanto, debe ser evitado. Poco a poco la velocidad de avance de la hoja es preferible utilizar un pincel. </li><li> Como cada rodaja se corta en el cerebro, se retira de la cámara de corte y se coloca en una cámara de incubación de división en un baño de agua caliente (a unos 32 ° C). La porción de la incubadora es un suministro continuo de oxígeno, usando una mezcla de 95% O 2 y el 5% de CO 2. En general, el registro de pre-incubación oscila corte de 30 minutos a 2 horas. </li><li> Pipetas de vidrio (3.6 MW) se fabrican como se describió previamente (9) con un extractor vertical. La temperatura y la duración de tirar varía en función del tipo de pipeta extractor se utiliza, el tipo de vidrio se utiliza y la vida útil del filamento de calentamiento del tirador. La forma de la punta de la pipeta también puede variar dependiendo de la preferencia del usuario. Hemos logrado buenos resultados con una punta afilada de manera uniforme con una abertura de 0,1 mm. Aberturas más grandes en la pipeta tienden a dañar las neuronas mientras que las pequeñas aberturas no culminan en grabaciones de larga duración. </li><li> Pipetas recubiertos con Sylgard para reducir la capacidad. Sacó punta de la pipeta se ha cubierto ligeramente con Sylgard 184 con una pipeta segundos. Consejos Sylgarded son entonces curado con calor con una pistola de calor. Estas pipetas se llenan con la perfusión de baño. Para aumentar la visualización de la punta de la pipeta, una pequeña cantidad de Alexa-568 se añade a la parte de la solución del baño para ser usado como la solución de la pipeta antes de llenar las pipetas. No pesan los Alexa-568, sino más bien el uso suficiente para cambiar el color de rosa solución a simple vista. La punta de la pipeta puede ser visualizado en el filtro de Texas rojo. </li><li> Hemos desarrollado un método para obtener corriente-clamp grabaciones para la detección de potenciales de acción con los sellos de baja resistencia (ver Discusión). Las grabaciones se realizaron en el potencial endógeno de reposo de la célula con Axoclamp 2B no aplica actual Instrumento con Axon. Sin embargo, debido al sello de baja resistencia, no se podía detectar los potenciales de acción con un solo amplificador 2B. Para aumentar la señal, un amplificador de segunda (AM Sistemas de 3000) se utiliza en la serie con el 2B Axoclamp. Este enfoque tiene la facilidad de sellos sueltos y la utilidad de registros a largo plazo. Técnicamente, se puede medir directamente los potenciales de acción, que permite eludir los problemas con el enfoque en el modo de grabación de voltaje-clamp (ver Discusión). </li><li> Se toma dos pipetas de la superficie de las dos neuronas previamente seleccionados, al mismo tiempo, de una manera similar como el enfoque para la configuración de la celda grabación completa. Acercarse a los neurons al mismo tiempo, ha tenido más éxito en la obtención de las grabaciones de dos de tratar cada neurona de la pareja de forma independiente. Durante este tiempo, pulsos de corriente de inyección se pasan desde el amplificador 2B como se hace durante la aproximación para el conjunto de células grabaciones. </li><li> La presión positiva se debe mantener en los dos pipetas para evitar la obstrucción de la punta. Presión positiva para las grabaciones de dos es el mejor generada mediante el uso de una jeringa de 3 ml sin llenar vacíos adjunta al titular de la pipeta por una longitud de la pieza de la tubería. Con jeringas permite mantener la presión en ambos pipetas. La presión positiva se debe aplicar tan pronto como la pipeta se ha colocado en la solución del baño de la cámara de grabación. Uno se acerca a las neuronas seleccionadas con las pipetas de forma secuencial. Después de colocar la primera pipeta directamente sobre la mayor superficie de la neurona, uno mantiene positiva, dejando la jeringa en su lugar y sale de la pipeta en esta posición. Uno vuelve a la parte superior de la cámara de registro y disminuye la pipeta segunda grabación en su posición. Neuronas seleccionadas están a menudo en los diferentes niveles de la división. La primera pipeta debe ser colocado sobre la neurona que es la más profunda en el corte y la posición de la pipeta segundo en la neurona más superficial. Esto evita que el posicionamiento de la pipeta segundo de cambiar el posicionamiento de la pipeta segundo que la división se moverá ligeramente en el plano vertical como pipetas entrar en el sector. </li><li> Sellos sueltos (18-30 MW) se utilizará. La presión positiva se induce un pequeño hoyuelo en la superficie de cada célula. Uno los intentos de cerrar la primera neurona por la liberación de presión positiva y la aplicación de presión negativa muy leve. La presión positiva se libera mediante la eliminación de la jeringa. De succión con la boca se aplica al extremo libre de la tubería. La membrana de una neurona sana responderá rápidamente a la liberación de presión positiva y se adhieran a la pipeta. Ligera succión se forma un sello con la resistencia adecuada en una neurona sana. </li> <li> Cuando uno intenta sellar una neurona y no, la pipeta no se puede volver a utilizar ya que las membranas sólo sello muy limpio de vidrio. En cambio, eleva la pipeta (y objetivo de microscopio) de distancia de la superficie de la porción de la parte superior de la perfusión, así, elimina la pipeta del baño, los cambios en una pipeta limpia y luego regresa a la corte para tratar de sellar otra célula . Por estas razones, es importante seleccionar múltiples neuronas potencial para las grabaciones. Para cortes con menos de 4.6 neuronas calidad de grabación entre los que elegir, el éxito en la obtención de grabaciones de doble es limitado. </li><li> Después de establecer un sello suelto sobre la base de la resistencia, los pulsos de inyección de corriente del amplificador 2B se terminan. El amplificador 2B se coloca en serie con el amplificador de la serie 3000. En esta configuración, la salida del amplificador 2B sirve como entrada para el amplificador de la serie 3000. El amplificador proporciona una señal de éste para la adquisición de datos. </li><li> El sello (paso 4) y la reconfiguración de amplifers (paso 5) se repite para la segunda neurona. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Un período de aumento de disparar en dos neuronas GnRH con la configuración de grabación del sello suelta adjunta en una preparación de corte sagital. El corte se obtuvo de un macho castrado. Cada flecha hacia arriba indica un potencial de acción. Tenga en cuenta que una neurona GnRH (huellas parte superior) muestra disparando casi continua, mientras que la segunda neurona GnRH presenta ráfagas intermitentes. Este patrón de actividad de las neuronas GnRH solo es similar a la de las unidades individuales extraídos de grabaciones de varias unidades en la secreción de hormonas en vivo (7). Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">haga clic aquí</a> para ver una versión ampliada de la figura 1.

<ol>
	<li>Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neuronal+systems:+immunocytochemistry.">The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+control+of+the+ovarian+cycle+of+the+rat.+In:+The+physiology+of+reproduction.">The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypophysial+responses+to+continuous+and+intermittent+delivery+of+hypopthalamic+gonadotropin-releasing+hormone.">Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone.</a> Science. 202, 631-633 (1978).</li><li>Maurer, J. A., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone-releasing+hormone+quantified+in+tissues+and+slice+explant+cultures+of+postnatal+rat+hypothalami.">Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami.</a> Endocrinology. 140, 791-799 (1999).</li><li>Harris, G. C., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+acceleration+of+pulsatile+gonadotropin-releasing+hormone+release+in+male+rats+as+revealed+by+microdialysis.">Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis.</a> Endocrinology. 14, 163-171 (2003).</li><li>Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gonadotropin-releasing+hormone+secretion+in+female+rats+during+peripubertal+development+and+on+proestrus.">In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus.</a> Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).</li><li>Cardenas, H., Ordog, T., O'Byrne, K. T., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+unit+components+of+the+hypothalamic+multiunit+electrical+activity+associated+with+the+central+signal+generator+that+directs+the+pulsatile+secretion+of+gonadotropic+hormones.">Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).</li><li>Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+localization+of+multiunit+electrical+activity+associated+with+pulsatile+LH+release+in+the+rhesus+monkey.">Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey.</a> Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).</li><li>Roberts, C. B., O'Boyle, M. P., Suter, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+determine+the+contribution+of+after+depolarization+potentials+(ADPs)+to+generation+of+repetitive+action+potentials+in+hypothalamic+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neurons.">Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons.</a> J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).</li><li>Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-+and+glutamate-activated+channels+in+green+fluorescent+protein-tagged+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+transgenic+mice.">GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice.</a> J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).</li><li>Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+the+regulation+of+luteinizing+hormone+in+C57BL/6J+mice:+impaired+elevations+after+ovariectomy+and+spontaneous+elevations+at+advanced+ages.">Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages.</a> Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).</li><li>Anson, B. D., Roberts, W. M., Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch+voltage-clamp+technique.">Loose-patch voltage-clamp technique.</a> Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. 35, 265-286 (2002).</li><li>Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+N-type+calcium+channel+currents.">Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents.</a> Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+single+neurons+by+irradiation+of+intracellularly+injected+dye.">Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye.</a> Science. 206, 702-704 (1979).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J Physiol. 550, 159-167 (2003).</li></ol>

La actividad de interés en algunas neuronas incluidas las neuronas GnRH (basado en la secreción de hormonas) se produce en escalas de tiempo de hora (5-7). Por lo tanto, la configuración de célula entera no es la mejor opción para algunos de los objetivos experimentales, debido a la diálisis de mensajeros intracelulares en el modo de grabación de toda la célula. En segundo lugar, de células enteras grabaciones se limitan generalmente a animales de menos de 120 días de edad. Con la edad, las membranas neuronales parecen rígidos, por lo que los sellos de alta resistencia difícil de lograr. Además, si se obtiene un sello de alta resistencia, rompiendo el parche rompe el sello, dejando un espacio entre la pipeta y la membrana. Esto conduce a una grabación quede inutilizable y una neurona que morirá rápidamente debido a los desequilibrios iónicos. Ciclos regulares de ovario, y por lo tanto, la actividad estable del generador de pulsos de GnRH no se produce hasta más tarde en la vida (7-10 meses de edad en las mujeres C57BL6, 11, 12), más allá de la edad en que uno puede razonablemente anticipar la obtención de células enteras grabaciones de forma fiable. Finalmente, de células enteras grabaciones destruir las relaciones endógenas de las concentraciones de iones internos y externos. Con las grabaciones de células enteras, la concentración interna de cualquier ion es igual a la concentración de los iones en la solución de la pipeta. Esto es así porque el volumen de la solución de la pipeta es relativamente grande alcanza rápidamente el equilibrio con / reemplaza el volumen endógeno relativamente pequeño de la célula. El enfoque de células vinculada suelta evita muchas de las limitaciones de células enteras grabaciones. En primer lugar, un sello de baja resistencia (15-30 MW) se puede utilizar. Estos son relativamente fáciles de formar, incluso en las neuronas de los animales más viejos. En segundo lugar, uno no se rompe el parche de membrana sellada. Por lo tanto, las grabaciones sueltas de células vinculada son técnicamente mucho más fácil que su conjunto de células grabaciones. Además, desde la membrana celular está intacta, la diálisis de los componentes intracelulares no ocurre y endógenos relaciones iónicas se conservan. No se puede utilizar el enfoque de células vinculada sueltas para el estudio de las corrientes sinápticas, pero es ideal para los registros a largo plazo de las neuronas de una manera relativamente no invasiva. Las grabaciones de las células adjunto también se puede realizar utilizando cualquier solución intracelular estándar en la pipeta. Esto ofrece la ventaja adicional de la ruptura de la membrana de parche cuando la grabación se completa a largo plazo y el etiquetado de la neurona con un marcador intracelular. El enfoque de células vinculada sueltas se ha utilizado en el modo de grabación de voltaje-clamp. Sin embargo, el voltaje-clamp grabación en la configuración de la celda adjunta suelta tiene varios problemas metodológicos. En primer lugar, la señal grabada es una medida indirecta de la actividad. La señal que se mide (como la acción de llamada actual) es la corriente capacitiva que los cargos de la membrana (13). Se trata de una cuestión metodológica muy importante. La capacidad y la resistencia de una pipeta de grabación se puede filtrar la señal grabada. Es muy probable que las corrientes de acción pequeños se pierden en la carga de la capacidad de la pipeta, que no pueden ser compensados ​​con la mayoría de los amplificadores, debido a la alta resistencia de la headstage. Cuando estas señales no se detectan, el patrón de activación aparente de la neurona no se corresponde con el patrón de activación real. Del mismo modo, la pipeta no compensada y resistencias sello causar errores significativos en las mediciones durante los cambios, como cuando las corrientes de acción se expresan (13). Algunos amplificadores proporcionan la capacidad y resistencia a la &quot;compensación&quot; por la pipeta y el sello, lo que limita la pérdida de señal, pero de alta resistencia a la cabeza de las etapas de la mayoría de los amplificadores de obstaculizar la compensación óptima. En segundo lugar, una situación artificial, se impone a la célula. En el modo de voltaje-clamp, el área alrededor de la membrana celular se mantiene a un potencial fijo, en estos estudios, 0 mV. Esto no significa que no hay corriente aplicada a la membrana celular. La señal de voltaje-clamp es en realidad la cantidad de corriente aplicada a la membrana para mantener el potencial fijo. Por lo tanto, esta corriente aplicada puede alterar la actividad de las células. Grabaciones de doble en el sistema de GnRH son particularmente difíciles debido al número limitado de neuronas GnRH y su distribución difusa. Para las grabaciones de doble para tener éxito, el manipulador debe ser muy estable. Incluso un ligero movimiento del electrodo puede causar la pipeta para deslizarse fuera de la neurona y finalizar la grabación. Por otra parte, el movimiento de la pipeta de la célula (por ejemplo, el cambio de posición para compensar el movimiento) puede alterar los patrones de activación. Algunos canales iónicos como el tipo N-canales de calcio son mecánicamente sensibles: estirar la membrana hace que la actividad repetitiva en las configuraciones de grabación tanto de células enteras y de células vinculada (14). Por último, el sistema de manipulación debe ser capaz de movimiento excesivamente fina y suave. Como se señaló anteriormente, con las grabaciones de dos, se toma dos pipetas de la superficie de las dos neuronas previamente seleccionados, al mismo tiempo y los intentos de cerraruna neurona. Si tiene éxito, entonces los intentos de cerrar la segunda celda. Por lo general, no se puede esperar para sellar y tienen una alta calidad de grabación con cada intento. Sin embargo, esto crea un problema particular con las grabaciones de doble. Si uno tiene éxito con la primera neurona, pero no con el segundo, se debe cambiar la pipeta y tratar de una celda diferente. Por lo tanto, uno debe ser capaz de mover tanto el objetivo de inmersión del microscopio y de la pipeta a la parte superior de la perfusión y (para cambiar la pipeta) sin interrumpir la neurona con éxito sellado. Nuestro desarrollo y uso de la suelta de células adjunta enfoque dual de las grabaciones es un gran avance técnico en el estudio de las neuronas GnRH. Es probable que produzca resultados útiles que le ayudarán a avanzar este campo en el contexto de la cuestión crítica de qué mecanismos subyacen a la actividad coordinada que se traduce en la secreción hormonal pulsátil.

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

Hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) es un neuropéptido que regula la pequeña liberación pituitaria de la hormona luteinizante (LH) y hormona folículo-estimulante (FSH). Estas gonadotropinas son esenciales para la regulación de la función reproductiva. Las neuronas GnRH que contienen se distribuyen de forma difusa en todo el hipotálamo y el proyecto a la eminencia media, donde la liberación de GnRH desde sus terminales de los axones en el sistema portal hypophysiotropic (1). En los capilares portal, GnRH viaja a la glándula pituitaria anterior para estimular la liberación de las gonadotropinas en la circulación sistémica. La liberación de GnRH no es continua sino que ocurre en pulsos episódicos. Está bien establecido que la forma intermitente de la liberación de GnRH es esencial para la reproducción (2, 3). Coordinación de la actividad de las neuronas GnRH probablemente múltiples pulsos de GnRH subyace. Contenido total de péptidos en las neuronas GnRH es de aproximadamente 1,0 pg / célula (4), de los cuales el 30% de probabilidades comprende la piscina liberable. Los niveles de GnRH durante un pulso (5, 6), sugieren múltiples neuronas de GnRH están probablemente involucradas en neurosecreción. Del mismo modo, la actividad de una sola unidad extraída de la unidad hipotálamo múltiples grabaciones durante la liberación de LH indica cambios en la actividad de múltiples neuronas (7). Los electrodos con la actividad registrada durante los pulsos de LH están asociados con somata GnRH o fibras (8). Por lo tanto, al menos parte de esta actividad surge de las neuronas GnRH. Los mecanismos que resultan en el despido sincronizada de las neuronas GnRH del hipotálamo son desconocidos. Elucidar los mecanismos que coordinan el fuego en las neuronas GnRH es un problema complejo. En primer lugar, las neuronas GnRH son relativamente pocos en número. En los roedores, hay neuronas GnRH 800-2500. No está claro que todas las neuronas GnRH están involucrados en la liberación de GnRH episódica. Por otra parte, las neuronas GnRH se distribuye de manera difusa (1). Esto ha complicado nuestra comprensión de la coordinación de los disparos y ha hecho que muchos enfoques técnicos insuperables. Hemos optimizado suelta celular conectado a las grabaciones en el modo actual de mordaza para la detección directa de potenciales de acción y ha desarrollado un enfoque de grabación que permite la grabación simultánea de pares de neuronas GnRH.

Watch this Scientific Journal Video about Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices at JoVE.com

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

La actividad en los sistemas neuronales a menudo requiere descarga sincrónica del potencial de acción de las neuronas dentro de una población específica. Por ejemplo, los pulsos de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) es probable que requieran actividad coordinada entre las neuronas GnRH. Presentamos nuestro enfoque metodológico para la obtención simultánea de forma fiable los registros electrofisiológicos de las neuronas GnRH distribuye de manera difusa.

Las grabaciones de doble somáticas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) identificados por la proteína verde fluorescente (GFP) en cortes de hipotálamo

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K vistas.  University of Texas San Antonio - UTSA. La actividad en los sistemas neuronales a menudo requiere descarga sincrónica del potencial de acción de las neuronas dentro de una población específica. Por ejemplo, los pulsos de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) es probable que requieran actividad coordinada entre las neuronas GnRH. Presentamos nuestro enfoque metodológico para la obtención simultánea de forma fiable los registros electrofisiológicos de las neuronas GnRH distribuye de manera difusa.

Video: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...