나는 로날드 L. 카라 브 레즈, 디터 예거 (에모리 대학)과 유용한 기술 토론 구청 Yuhas (액슨 인 스트 루먼트)에 감사드립니다.

<ol><li> Hypothalamic 뇌 슬라이스는 준비 incubated 및 그의 GnRH 뉴런 GnRH 펩티드 발기인 (10)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 동물 이전에 세부로 기록 챔버 (9)으로 전송됩니다. 동물의 두뇌의 제거 후, ​​두뇌는 관심이없는 영역을 제거하기 위해 면도날을 사용하여 차단됩니다. 시상 하부는 시각 수 있도록 제거하는 영역을 결정하기 위해서는 두뇌가 그 등의 표면에 위치합니다. 코로나와 화살 슬라이스 방향 모두에 대해, 소뇌가 제거됩니다. 코로나 슬라이스 준비, 피질의 주동이의 부분이 제거됩니다. 이 슬라이스 방향에서 피질의 측면 지역은 머리를 깔끔히에 대한 지원을 제공하고 녹음 챔버의 뇌를 보호하는 실버 와이어의 위치에 대한 두뇌의 충분한 공간을 제공합니다. 화살 슬라이스 준비, 두뇌의 측면 영역이 제거되고 피질의 주동이의 부분이 깔끔히 뇌를 잘 녹음의 뇌를 보호하는 실버 와이어의 배치에 대한 지원을 제공하고 있습니다. 차단 절차를 통해, 두뇌가 지속적으로 유리 피펫을 사용하여 차가운 인공 뇌척수 (ACSF)와 moistened 있습니다. </li><li> Superglue의 작은 금액은 절삭 플랫폼에 배치됩니다. 두뇌는 주걱과 함께 해제됩니다. 초과 ACSF는 주걱의 표면에 Kimwipe 가지고와 뇌의 가까이 초과 ACSF를 그림으로써 제거됩니다. 머리가 부드럽게 접착제에 앞으로 하락이다. 그것을 확보하기 위해 머리를 만지거나 그것에 아래로 밀어하지 않는 것이 중요합니다. 뇌 자체의 무게는 대개 안전 보장하기 위해 충분합니다. </li><li> 두뇌와 절삭 플랫폼은 다음 진동 마이크로톰을 확보하고 절단 잘 감기 ACSF으로 가득합니다. 추위 솔루션은 두 회사 두뇌와 절단 절차를 수행하는 동안 손상으로부터 보호할 수 있습니다. 다른 뇌 영역은 품질 조각을 최적화 추위의 정도에 따라 다릅니다. hypothalamic 조각의 준비를위한 ACSF의 온도는 일반적으로 0 ° C.입니다 </li><li> 조각은 천천히 절단되어야하며 각각의 슬라이스는 두뇌에서 멀리 자유롭게 부유한다. 슬라이스가 절단하는 동안 침묵 시작하면 날개가 발전하는 속도가 느려해야합니다. 하나는 작은 페인트 조각을 펴다 브러시 그러나 이것은 위험 조각 손상 않으며 따라서 피해야한다을 사용할 수 있습니다. 천천히 블레이드 사전의 속도는 페인트 브러쉬를 사용하여보다 선호됩니다. </li><li> 각 슬라이스는 두뇌에서 해고되면서, 그것은 절단 챔버에서 철회하고 온수 욕조 (약 32 ° C)에서 슬라이스 배양 챔버에 배치됩니다. 슬라이스 인큐베이터는 지속적으로 95% O 2 5% CO 2의 혼합물을 사용하여 산소와 함께 제공됩니다. 30 분 거리에 2 시간 일반적으로, 사전 녹화 슬라이스 배양 범위. </li><li> 앞에서 설명한 것처럼 유리 pipettes (MΩ 3-6)은 세로 풀러를 사용하여 (9) 가공하고 있습니다. 당기의 온도와 기간은 피펫 끌어당기는 한 사용, 유리 하나 사용하고 풀러의 가열 필라멘트의 수명의 종류의 유형에 따라 다릅니다. 피펫 팁의 모양도 사용자의 취향에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 0.1 mm의 개방과 균일하게 테이퍼 팁 잘 성공을 달성했습니다. 피펫에 큰 구멍이 작아 채용 오랜 기간 녹음의 결과에 실패하면서 신경을 손상하는 경향이 있습니다. </li><li> Pipettes은 용량을 줄이기 위해 Sylgard와 코팅. 아이고, 피펫 팁은 가볍게 Sylgard 184 두 번째 피펫을 이용하여 코팅하고 있습니다. Sylgarded 팁 열 총을 사용하여 열 치료 후 수 있습니다. 이러한 pipettes은 다음 목욕탕 perfusate 가득합니다. 피펫 팁의 시각화를 향상시키기 위해 알렉사 - 568의 작은 금액은 pipettes를 작성하기 전에 피펫 솔루션으로 사용할 목욕 솔루션의 부분에 추가됩니다. 우리는 알렉사 - 568의 무게가 아니라 눈으로 솔루션 분홍색을 설정하는 정도로 사용하지 마십시오. 피펫 팁 다음 텍사스 빨간색 필터 시각하실 수 있습니다. </li><li> 우리는 낮은 저항 바다표범을 (토론 참조)를 사용하여 액션 잠재력의 감지 전류 클램프 녹음을 얻는 방법을 개발했습니다. 녹음없이 적용 현재 사용 액슨 악기의 2B Axoclamp와 세포의 내생적인 휴식 가능성에서 수행됩니다. 그러나, 때문에 낮은 저항 도장을 한 단지 2B 앰프와 행동 잠재력을 감지하지 못했습니다. 신호를 높이려면 두 번째 앰프 (AM 시스템 3000) Axoclamp의 2B와 시리즈에서 사용됩니다. 이 방법은 장기 레코딩 느슨한 바다표범과 유틸리티의 용이성이 있습니다. 기술적으로, 하나는 직접함으로써 (토론 참조) 전압 - 클램프 녹음 모드에서 접근의 문제점을 우회, 액션 잠재력을 측정할 수 있습니다. </li><li> 하나는 전체 세포 기록 구성에 대한 접근 방식과 비슷한 방식으로, 동시에 두 사람 이전에 선택한 뉴런의 표면에 두 pipettes 걸립니다. NE 모두 접근동시에 urons 독자 쌍 각 뉴런을 시도보다 듀얼 레코딩을 얻기에 더 많은 성공을 거두었습니다. 전체 셀 레코딩을위한 접근하는 동안 수행으로이 기간 동안, 현재 분사 펄스는 2B 앰프에서 전달됩니다. </li><li> 긍정적인 압력이 팁을 막히는 것을 방지하기 위해 두 pipettes에서 유지 관리해야합니다. 듀얼 레코딩에 대한 긍정적인 압력이 최고의 튜브의 조각의 길이로 피펫 홀더에 부착된 unfilled 3 ML 빈 주사기를 사용하여 생성됩니다. 주사기를 사용하면 한 두 pipettes 압력을 유지할 수 있습니다. 긍정적인 압력이 즉시 피펫이 녹화 챔버의 목욕 솔루션에 배치되었습니다으로 적용되어야합니다. 하나는 순차적으로 pipettes로 선택한 뉴런 접근. 신경 세포의 가장 큰 표면에 직접 첫 번째 피펫을 위치하면, 한 장소에서 주사기를 떠나하여 긍정적인 유지하고이 위치에 피펫을 떠납니다. 하나는 다음 녹화 챔버의 상단에 반환하고 위치로 두 번째 녹화 피펫을 절감. 선택된 뉴런은 조각의 다른 수준에서 종종 있습니다. 첫 번째 피펫은 더 많은 외면적인 신경 세포에서 슬라이스와 위치를 두 번째 피펫에 깊은하는 신경 세포를 통해 위치해야합니다. 이것은 pipettes은 슬라이스를 입력으로 슬라이스가 수직 비행기에서 약간 이동합니다 두번째 피펫의 위치를​​ 이동에서 두 번째 피펫의 위치를​​ 방지할 수 있습니다. </li><li> 루쓰 물개 (MΩ 18-30)이 사용됩니다. 긍정적인 압력은 각 세포의 표면에 작은 보조개를 유도합니다. 하나는 긍정적인 압력을 해제하고 아주 약간의 부정적인 압력을 적용하여 최초의 신경 세포를 밀봉을 시도합니다. 긍정적인 압력은 주사기를 제거하여 발표합니다. 입으로 흡입은 다음 튜브의 끝에 자유에 적용됩니다. 건강한 신경 세포의 막이 신속하게 긍정적인 압력의 출시에 대응하고 피펫을 준수합니다. 약간 흡입은 건강한 신경 세포에 적절한 저항과 인감을 형성합니다. </li> <li> 점막은 매우 유리를 청소하기 위해 인감 이후 하나는 신경 세포와 실패를 봉인하려고 시도하면, 피펫은 다시 사용할 수 없습니다. 대신, 하나, 잘 재관류의 상단에 떨어진 조각의 표면에서 피펫 (그리고 현미경 목표)을 제기 목욕에서 피펫을 제거, 깨끗한 피펫을 변경하고 다른 전지를 밀봉을 시도할 수있는 조각으로 돌아갑니다 . 이러한 이유로, 레코딩에 대해 여러 가능성이 뉴런을 선택하는 것이 중요합니다. 선택할 수있는보다 4-6 녹화 품질 뉴​​런과 슬라이스 들어, 듀얼 레코딩을 얻기에있는 성공은 제한됩니다. </li><li> 저항에 따라 느슨한 도장을 설립 후, 2B 앰프에서 현재 분사 펄스가 종료됩니다. 2B의 amplifer는 3000 시리즈 amplifer와 시리즈에 배치됩니다. 이 구성에서, 2B의 amplifer의 출력은 3000 시리즈 amplifer에 대한 입력으로 제공하고 있습니다. 후자 amplifer는 데이터 수집을위한 신호를 제공합니다. </li><li> 인감 (4 단계)와 amplifers의 재구성 (5 단계)은 다음 두 번째 신경 세포에 대해 반복됩니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1.의 기간은 화살 슬라이스 준비에 느슨한 인감 첨부 녹음 구성을 사용하여 두 GnRH 뉴런에서 발사 증가했습니다. 슬라이스는 거세 남성에서 파생되었다. 각각 상향 편향은 행동 잠재력을 나타냅니다. 두 번째 GnRH 신경 세포는 간헐적인 파열을 전시하면서 한 GnRH 신경 세포 (상단 흔적)이 거의 지속적인 시행을 전시합니다. 단일 GnRH 뉴런의 활동이 패턴은 생체내 (7)의 호르몬 분비 중에 멀티 유닛 녹음에서 추출된 단일 단위의 비슷합니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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	<li>Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neuronal+systems:+immunocytochemistry.">The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+control+of+the+ovarian+cycle+of+the+rat.+In:+The+physiology+of+reproduction.">The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. 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GnRH 뉴런 (호르몬 분비에 따라)를 포함한 일부 뉴런에 대한 관심의 활동은 시간의 시간 단위 (5-7)에 발생합니다. 따라서, 전체 셀 구성은 전체 세포 녹음 모드에서 세포내 메신저의 투석으로 인해 일부 실험 목표를위한 최선의 선택이 아닐 것입니다. Secondarily, 전체 셀 녹음은 일반적으로 나이 약 12​​0 일 이상 적은 동물로 제한됩니다. 나이, 세포막의 연결은 높은 저항 바다표범 달성하기 어려운 만들기, 등귀하다로 나타납니다. 또한, 경우 하나는 패치가 피펫과 막 사이에 구멍을 떠나, 인감 방해 rupturing, 높은 저항 인감을 얻습니다. 이것은 사용할 수 없게 녹화 빠르게 이온 불균형으로 인해 죽게 될 신경 세포로 안내합니다. 한 합리적인 전체 셀 녹음을 얻기 예상할 수있을 때 세 이상; 일반 난소주기, 그리고 따라서 GnRH 펄스 생성기의 안정적인 활동 (11, 12 C57Bl6 여성의 나이 70~10개월) 나중에까지 발생하지 않습니다 안정. 마지막으로, 전체 셀 녹음은 내부 및 외부 이온 농도의 내생적인 비율을 파괴. 전체 세포 기록과 함께, 어떤 이온의 내부 농도는 피펫 솔루션에있는 이온의 농도 같습니다. /이 세포의 비교적 적은 내생 볼륨을 대체와 피펫 솔루션의 비교적 큰 볼륨이 빠르게 평형에 도달하기 때문입니다. 느슨한 세포 부착 방법은 전체 세포 녹음의 한계 많은 circumvents. 첫째, 낮은 저항 인감 (MΩ 15-30)을 사용할 수 있습니다. 이들은 심지어 나이가 동물에서 뉴런의 형태로 상대적으로 쉽습니다. 둘째, 하나는 막 파열의 밀봉 패치를하지 않습니다. 따라서 느슨한 세포 부착 녹음은 전체 세포 녹음보다 기술적으로 훨씬 용이합니다. 또한 세포막은 그대로이기 때문에, 세포 내 구성 요소의 투석가 발생하지 않으며 내생 이온 비율은 보존되어 있습니다. 하나는 시냅스 전류를 공부에 대한 느슨한 세포 부착 방법을 사용할 수 있지만 그것은 상대적으로 비침습적인 방법으로 뉴런에서 장기 녹음에 이상적입니다. 셀 - 첨부된 녹음도 피펫으로 표준 세포 솔루션을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 장기적인 녹음이 완료되면 막 패치를 rupturing하고 세포 마커와 신경 세포를 라벨의 추가 혜택을 제공합니다. 느슨한 세포 부착 방식은 전압 클램프 녹음 모드에서 사용되고 있습니다. 그러나, 느슨하게 연결된 세포 구성에 전압 클램프 녹음이 몇 가지 방법론 문제가있다. 첫째, 녹음 신호가 활동의 간접적인 측정하기위한 한 방법입니다. (소위 동작 전류)를 측정 신호는 멤브레인 (13) 청구 용량성 전류입니다. 이것은 매우 중요한 방법 론적 문제입니다. 기록 피펫의 용량과 저항이 기록된 신호를 필터링할 수 있습니다. 그것은 작은 동작 전류가 제대로 headstage의 높은 저항으로 인해 대부분의 앰프와 보상 수 없습니다 피펫의 커패시턴스를 충전에 손실 가능성이 높습니다. 이러한 신호가 나오지 않을 때, 신경 세포의 명백한 해고 패턴은 진정한 발사 패턴을 반영하지 않습니다. 마찬가지로, uncompensated 피펫 및 인감 resistances는 동작 전류를 표현하는 경우로 변경 (13) 동안 측정에 큰 오류의 원인이됩니다. 어떤 앰프는 커패시턴스와 신호 손실을 제한 피펫 날인에 대한 저항 &quot;보상&quot;을 제공하고 있지만, 대부분의 앰프의 높은 저항 헤드 단계가 최적의 보상을 방해. 둘째, 인공 상황은 세포에 부과됩니다. 전압 클램프 모드에서 세포막 주변 이러한 연구, 0 뮤직 비디오에 고정 가능성에 개최됩니다. 이것은 세포막에 적용도 현재이 없다는 뜻은 아닙니다. 전압 클램프로 측정 신호는 실제로 고정 가능성을 유지하기 위해 막에 적용되는 현재의 금액입니다. 따라서이 적용된 현재는 세포 활동을 변경할 수 있습니다. GnRH 시스템에 듀얼 레코딩 특히 GnRH 뉴런과 확산 유통의 수는 제한되어 있기 때문에 도전하고 있습니다. 듀얼 레코딩이 성공하기 위해서는, 조작하는 사람은 매우 안정되어야합니다. 전극의도 약간의 움직임 신경 세포를 실수로 녹음을 종료하기 위해 피펫가 발생할 수 있습니다. 또한, 세포에 피펫의 움직임 (예를 들어, 움직임 보상에 다시 위치)는 발사 패턴을 변경할 수 있습니다. 일부 이온 채널과 같은 N - 타입 칼슘 채널은 기계식 구분 : 멤브레인 스트레치는 전체 세포와 세포에 연결된 모두 녹음 구성 (14) 반복적인 활동을 발생합니다. 마지막으로, 조작하는 사람의 시스템은 매우 좋은 부드러운 모션 수 있어야합니다. 듀얼 레코딩과 함께, 위에서 바와 같이, 하나는 같은 시간과 인감 시도에서 두 이전에 선택한 뉴런의 표면에 두 pipettes 걸립니다한 신경 세포. 성공한다면, 시도가 두 번째 세포를 밀봉합니다. 일반적으로, 하나는 모든 시도와 고품질 레코딩을 밀봉하고이 기​​대 수 없습니다. 이것은, 그러나, 듀얼 레코딩과 함께 특정 문제를 만듭니다. 하나는 최초의 신경 세포로 성공하지만 두 번째로 실패하면, 하나는 피펫을 변경하고 다른 세포를 시도해야합니다. 따라서, 하나는 성공적으로 밀봉 신경을 방해하지 않고 잘 재관류의 상단 (피펫을 변경할 수)에 현미경의 침지 목적과 피펫을 모두 이동시킬 수 있어야합니다. 듀얼 레코딩에 대한 느슨한 세포 부착 방식 우리의 개발 및 사용 GnRH 뉴런을 연구의 주요 기술 발전이다. 이 메커니즘은 조정 활동을 기초 어떤 중요한 질문의 맥락에서 앞으로 필드를 이동 타악기 호르몬의 분비로 이어지는. 도움이 될 것입니다 유용한 결과를 얻을 가능성이

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

생식 샘 자극 호르몬 - 방출 호르몬 (GnRH)는 luteinizing 호르몬 (LH)과 소낭 자극 호르몬 - (FSH)의 뇌하수체 릴리스를 조절 작은 neuropeptide입니다. 이러한 gonadotropins은 생식 기능의 조절에 필수입니다. 그들이 hypophysiotropic 포털 시스템 (1)에 자신의 축삭 터미널에서 GnRH을 해제 어디 GnRH 함유 뉴런은 평균 예하에 시상 하부 및 프로젝트 전반에 걸쳐 diffusely 배포됩니다. 포털 모세 혈관에서 GnRH은 조직의 순환에 gonadotropins의 릴리스를 자극하기 위해 앞쪽에 뇌하수체에 여행​​. GnRH 릴리스는 지속적인 것은 아니지만 오히려 에피소드 펄스에서 발생합니다. 그것은 잘 GnRH 릴리스의 간헐적인 방식으로 재생산 (2, 3)을 위해 필수적임을 ​​설정됩니다. 여러 아마도 GnRH 뉴런의 underlies의 GnRH 펄스의 활동을 조정. GnRH 뉴런의 총 펩타이드 내용은 약 1.0 PG / 30 % 가능성 releasable 수영장 구성되어있는 셀 (4).입니다 펄스 동안 GnRH (5, 6)의 수준은 여러 GnRH 뉴런은 아마도 neurosecretion에 참여하시기 바랍니다. 마찬가지로 하나의 단위 활동 여러 뉴런 (7)의 활동의 변화를 나타냅니다 LH 릴리스 중 hypothalamic 멀티 유닛 녹음에서 추출한. LH 펄스 동안에 기록된 활동 전극은 GnRH somata 또는 섬유 (8) 중 하나와 연결됩니다. 따라서, 적어도이 활동 중 일부는 GnRH 뉴런에서 발생한다. 메커니즘은 hypothalamic GnRH의 뉴런의 동기화 해고의 결과는 알 수있다. GnRH 뉴런의 해고 조정 메커니즘을 Elucidating하는 것은 복잡한 문제입니다. 첫째, GnRH 뉴런은 수가 상대적으로 적은 수 있습니다. 설치류에서 800-2500 GnRH 뉴런가 없습니다. 다 GnRH 뉴런이 에피소드 GnRH 릴리스에 관련된 것이 분명하지 않습니다. 또한, GnRH의 뉴런은 diffusely (1) 배포됩니다. 이것은 사격의 조정에 대한 우리의 이해를 복잡하고 많은 기술 접근​​이 어​​려운되었다. 우리는 행동 잠재력의 직접 검출을위한 전류 클램프 모드에서 느슨한 세포 연결된 녹음을 최적화하고 GnRH 뉴런의 쌍의 동시 녹음을 허용 녹음 방식을 개발했습니다.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

의 연결 시스템의 활동은 종종 특정 인구 내에서 뉴런에서 동기 조치 가능성 배출이 필요합니다. 예를 들어,의 펄스 호르몬 (GnRH)를 생식 샘 자극 호르몬은 - 발표하는 것은 가능성이 GnRH 뉴런 사이의 조정 활동을 필요로합니다. 우리는 안정 diffusely 배포 GnRH 뉴런에서 동시 electrophysiological 레코딩을 얻기위한 우리의 방법론 접근법을 제시한다.

에서 듀얼 레코딩 체세포 생식 샘 자극 호르몬 - 방출 Hypothalamic 조각에 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 확인된 호르몬 (GnRH) 신경을

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K 조회수.  University of Texas San Antonio - UTSA. 의 연결 시스템의 활동은 종종 특정 인구 내에서 뉴런에서 동기 조치 가능성 배출이 필요합니다. 예를 들어,의 펄스 호르몬 (GnRH)를 생식 샘 자극 호르몬은 - 발표하는 것은 가능성이 GnRH 뉴런 사이의 조정 활동을 필요로합니다. 우리는 안정 diffusely 배포 GnRH 뉴런에서 동시 electrophysiological 레코딩을 얻기위한 우리의 방법론 접근법을 제시한다.

비디오: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...