אני אסיר תודה רונלד ל קלברזה, דיטר יגר (אוניברסיטת אמורי) וורד Yuhas (אקסון מכשירים) לדיונים טכניים שימושיים.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות המוח ההיפותלמוס מוכנים, מודגרות והועבר לתא הקלטה כמפורט לעיל (9) אצל בעלי חיים אשר נוירונים GnRH לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשליטת היזם את הפפטיד GnRH (10). לאחר הסרת המוח של החיה, המוח חסומה באמצעות סכין גילוח כדי למנוע אזורים שאינם בעלי עניין. על מנת לקבוע את האזורים להסיר, המוח הוא מונח על משטח הגב שלה, כך ההיפותלמוס ניתן דמיינו. במשך שתי אוריינטציות פרוסה העטרה ועל sagittal, במוח הקטן מוסר. להכנת פרוסה העטרה, חלק מקורי של קליפת מוסר. בכיוון זה פרוסה, האזורים לרוחב של קליפת לתמוך חותך את המוח לספק שטח מספיק של המוח עבור מיקום של חוטי כסף כדי להבטיח את המוח בחדר ההקלטה. להכנת פרוסה sagittal, אזורים הלטרלי של המוח יוסרו החלקים מקורי של קליפת לספק את התמיכה עבור המוח חיתוך ועל המיקום של חוטי כסף כדי להבטיח את המוח ההקלטה היטב. לאורך כל ההליך חוסם, המוח הוא ברציפות טבולה בנוזל השדרתי קר מלאכותי (ACSF) באמצעות פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות קטנה של הפלא מושם על מצע החיתוך. המוח הוא הרים במרית. ACSF עודף מוסר על ידי Kimwipe להביא אל פני השטח של המרית וציור ACSF עודף מן המוח. המוח הוא החליק בעדינות קדימה על הדבק. חשוב לא לגעת במוח או לדחוף אותו כלפי מטה על מנת לאבטח אותו. משקל המוח עצמו הוא בדרך כלל מספיק כדי להבטיח שהיא מאובטחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח ואת פלטפורמת חיתוך מאובטח אז microtome הרוטט ואת חיתוך טוב מלא ACSF קר. הפתרון קר הן חברות המוח עשוי להגן מפני נזק במהלך הליך החיתוך. אזורי מוח שונים נבדלים במידת קור אשר מייעל פרוסות איכות. הטמפרטורה של ACSF להכנת פרוסות ההיפותלמוס הוא בדרך כלל 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Slices צריך לחתוך לאט כל פרוסה צריך לצוף בחופשיות מן המוח. אם פרוסות מתחילים להסתלסל במהלך חיתוך, המהירות שבה הלהב מתקדמת יש האטה. ניתן להשתמש במברשת צבע קטנה פרוסות זזה אבל זה עושה את הסיכון לפגוע פרוסות ולכן, יש להימנע. לאט לאט למהירות מראש של הלהב הוא מועדף על פני שימוש במברשת צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כל פרוסה חותכים מהמוח, היא נסוגה מן החדר חיתוך והניח בתא פרוסה הדגירה באמבט מים חמים (כ 32 ° C). פרוסה האינקובטור מסופק ברציפות עם חמצן באמצעות תערובת של 95% O 2 ו - 5% CO 2. בדרך כלל, מראש הקלטה הדגירה פרוסה נע בין 30 דקות עד 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית pipettes (3-6 MΩ) מיוצרים כפי שתואר לעיל (9) באמצעות חולץ אנכי. הטמפרטורה ומשך משיכה משתנה בהתאם לסוג פיפטה חולץ אדם משתמש, סוג של כוס אחת משתמשת ואת חייו של נימה החימום של חולץ. צורת קצה פיפטה יכול גם להשתנות בהתאם להעדפה של המשתמש. השגנו הצלחה טוב עם קצה קוני אחיד עם פתח של 0.1 מ&quot;מ. פתחים גדולים בתוך פיפטה נוטים נזק הנוירונים בזמן פתחים קטנים מצליחים לגרום הקלטות משך זמן רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes מצופה Sylgard להפחית קיבול. טיפים פיפטה משך הם מצופים קלות Sylgard 184 באמצעות פיפטה השני. טיפים Sylgarded אז הם חום לרפא באמצעות אקדח חום. Pipettes אלה מתמלאים אז עם perfusate האמבטיה. כדי להגדיל את להדמיה של טיפים פיפטה, כמות קטנה של אלקסה-568 הוא הוסיף לחלק מהפתרון אמבטיה לשמש כפתרון פיפטה לפני מילוי pipettes. אנחנו לא שוקלים את אלקסה-568 אלא להשתמש מספיק כדי להפוך את ורוד פתרון על ידי העין. טיפים פיפטה לאחר מכן ניתן דמיינו תחת אדום טקסס הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתחנו גישה להשיג מהדק השוטף של הקלטות עבור איתור של פוטנציאל פעולה באמצעות חותמות התנגדות נמוכה (ראה דיון). הקלטות מתבצעות על פוטנציאל המנוחה אנדוגני של התא עם Axoclamp 2B אקסון לא מיושם כיום כלי של משתמש. עם זאת, בשל לאטום את התנגדות נמוכה, לא ניתן היה לזהות פוטנציאל פעולה עם המגבר רק 2B. כדי להגביר את האות, מגבר שני (AM מערכות 3000) משמש בסדרת עם 2B Axoclamp. גישה זו יש את הקלות של חותמות רופף השירות לטווח ארוך הקלטות. מבחינה טכנית, אפשר למדוד ישירות הפוטנציאלים לפעולה, ובכך לעקוף את הבעיות עם הגישה במצב מתח, מהדק את ההקלטה (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד לוקח שני pipettes אל פני השטח של שני נוירונים שנבחרו קודם לכן באותו זמן, באופן דומה כמו הגישה עבור תצורת תא שלם ההקלטה. שניהם מתקרבים neurons באותו הזמן הצליחה יותר להשיג את הקלטות כפול מאשר לנסות כל נוירון של הצמד באופן עצמאי. במהלך תקופה זו, פולסים הזרקה הנוכחיים הם עברו המגבר 2B כפי שנעשה במהלך הגישה עבור כל תא הקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ חיובי יש לשמור על pipettes הן כדי למנוע סתימת קצה. לחץ חיובי עבור הקלטות כפול מופק הטובה ביותר באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל ללא מילוי ריק מצורף לבעל פיפטה לפי אורך של חתיכת צינור. באמצעות מזרקים מאפשר לשמור על הלחץ על pipettes שניהם. לחץ חיובי צריך להיות מיושם ברגע פיפטה הושם בפתרון באמבטיה של החדר ההקלטה. אחת הגישות הנוירונים נבחרת עם pipettes ברצף. לאחר מיצוב פיפטה first ישירות על פני השטח הגדול ביותר של הנוירון, אחד שומר חיובית על ידי השארת את המזרק במקום והעלים פיפטה בעמדה זו. אחת מכן מחזיר לחלק העליון של חדר הקלטה מוריד את פיפטה הקלטה השני למזיגה. נוירונים נבחרים לעיתים קרובות ברמות שונות של הפרוסה. פיפטה הראשון צריך להיות ממוקם מעל הנוירון כי הוא העמוק ביותר הפרוסה ואת עמדת פיפטה השני הנוירון שטחית יותר. זה מונע את המיקום של פיפטה השני הסטה את המיקום של פיפטה השני כמו פרוסת ינוע מעט במישור האנכי כמו pipettes להיכנס פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותמות Loose (18-30 MΩ) ישמש. לחץ חיובי יניעו גומה קטנה על פני השטח של כל תא. אחת מנסה לאטום את נוירון לראשונה על ידי שחרור לחץ חיובי הפעלת לחץ שלילי קל מאוד. הלחץ החיובי הוא שוחרר על ידי הסרת מזרק. יניקה דרך הפה מוחל אז עד הסוף ללא צינורות. קרום תא עצב בריא יהיה להגיב במהירות כדי לשחרר את הלחץ החיובי לדבוק פיפטה. יניקה קלה יהוו חותמת עם התנגדות מתאימה נוירון בריא. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אחד מנסה חותם נוירון ונכשל, פיפטה לא ניתן שימוש חוזר מאז ממברנות רק חותם על זכוכית נקי מאוד. במקום אחד מעלה את פיפטה (ואובייקטיבי מיקרוסקופ) מהמשטח של הפרוסה לראש זלוף הבאר, מסיר את פיפטה מהאמבטיה, שינויים פיפטה נקייה ואז חוזר הפרוסה לנסות לאטום תא אחר . מסיבה אלה, חשוב לבחור נוירונים פוטנציאל מרובים עבור הקלטות. עבור פרוסות עם פחות מ 4-6 איכות הקלטה נוירונים לבחירה, ההצלחה בהשגת הקלטות כפול מוגבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקמת חותם רופף על בסיס ההתנגדות, קטניות הזריקה הנוכחית מן המגבר 2B הן הסתיים. Amplifer 2B ממוקם סדרה עם amplifer 3000 הסדרה. בתצורה זו, את הפלט של amplifer 2B משמש כקלט עבור amplifer 3000 הסדרה. Amplifer האחרון מספק אות לרכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החותם (שלב 4) ו תצורה של amplifers (שלב 5) חוזר על עצמו ואז הנוירון השני. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /> באיור 1. תקופה של עלייה בירי בשני נוירונים GnRH באמצעות חותם רופף מצורף תצורת הקלטה בהכנת פרוסה sagittal. פרוסה נגזר זכר מסורס. כל סטיה כלפי מעלה מצביע על פוטנציאל פעולה. שים לב כי אחד GnRH נוירון (עקבות למעלה) תערוכות ירי מתמשך כמעט ואילו השני GnRH נוירון תערוכות פרצי. דפוס זה של פעילות GnRH מתא עצב אחד דומה לזו של יחידות חילוץ מיחידת יחיד מרובה הקלטות במהלך הפרשת הורמון in vivo (7). אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

<ol>
	<li>Silverman, A. J., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neuronal+systems:+immunocytochemistry.">The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Freeman, M. E., Knobil, E., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroendocrine+control+of+the+ovarian+cycle+of+the+rat.+In:+The+physiology+of+reproduction.">The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat. In: The physiology of reproduction.</a> The Physiology of Reproduction. , (1994).</li><li>Belchetz, P. E., Plant, T. M., Nakai, Y., Keogh, E. J., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypophysial+responses+to+continuous+and+intermittent+delivery+of+hypopthalamic+gonadotropin-releasing+hormone.">Hypophysial responses to continuous and intermittent delivery of hypopthalamic gonadotropin-releasing hormone.</a> Science. 202, 631-633 (1978).</li><li>Maurer, J. A., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone-releasing+hormone+quantified+in+tissues+and+slice+explant+cultures+of+postnatal+rat+hypothalami.">Luteinizing hormone-releasing hormone quantified in tissues and slice explant cultures of postnatal rat hypothalami.</a> Endocrinology. 140, 791-799 (1999).</li><li>Harris, G. C., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pubertal+acceleration+of+pulsatile+gonadotropin-releasing+hormone+release+in+male+rats+as+revealed+by+microdialysis.">Pubertal acceleration of pulsatile gonadotropin-releasing hormone release in male rats as revealed by microdialysis.</a> Endocrinology. 14, 163-171 (2003).</li><li>Sisk, C. L., Richardson, H. N., Chappell, P. E., Levine, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gonadotropin-releasing+hormone+secretion+in+female+rats+during+peripubertal+development+and+on+proestrus.">In vivo gonadotropin-releasing hormone secretion in female rats during peripubertal development and on proestrus.</a> Endocrinology. 142, 2929-2936 (2001).</li><li>Cardenas, H., Ordog, T., O'Byrne, K. T., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+unit+components+of+the+hypothalamic+multiunit+electrical+activity+associated+with+the+central+signal+generator+that+directs+the+pulsatile+secretion+of+gonadotropic+hormones.">Single unit components of the hypothalamic multiunit electrical activity associated with the central signal generator that directs the pulsatile secretion of gonadotropic hormones.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 9630-9634 (1993).</li><li>Silverman, A. J., Wilson, R., Kesner, J. S., Knobil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+localization+of+multiunit+electrical+activity+associated+with+pulsatile+LH+release+in+the+rhesus+monkey.">Hypothalamic localization of multiunit electrical activity associated with pulsatile LH release in the rhesus monkey.</a> Neuroendocrinology. 44, 168-171 (1986).</li><li>Roberts, C. B., O'Boyle, M. P., Suter, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+determine+the+contribution+of+after+depolarization+potentials+(ADPs)+to+generation+of+repetitive+action+potentials+in+hypothalamic+gonadotropin+releasing-hormone+(GnRH)+neurons.">Dendrites determine the contribution of after depolarization potentials (ADPs) to generation of repetitive action potentials in hypothalamic gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neurons.</a> J Comput Neurosci. 26, 39-53 (2009).</li><li>Spergel, D. J., Kruth, U., Hanley, D. F., Sprengel, R., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-+and+glutamate-activated+channels+in+green+fluorescent+protein-tagged+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+transgenic+mice.">GABA- and glutamate-activated channels in green fluorescent protein-tagged gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice.</a> J Neurosci. 19, 2037-2050 (1999).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biol Reprod. 27, 327-339 (1982).</li><li>Gee, D. M., Flurkey, K., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+the+regulation+of+luteinizing+hormone+in+C57BL/6J+mice:+impaired+elevations+after+ovariectomy+and+spontaneous+elevations+at+advanced+ages.">Aging and the regulation of luteinizing hormone in C57BL/6J mice: impaired elevations after ovariectomy and spontaneous elevations at advanced ages.</a> Biol Reprod. 28, 598-607 (1983).</li><li>Anson, B. D., Roberts, W. M., Walz, W., Boulton, A. A., Baker, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch+voltage-clamp+technique.">Loose-patch voltage-clamp technique.</a> Neuromethods, Patch-clamp analysis: Advanced techniques. 35, 265-286 (2002).</li><li>Calabrese, B., Tabarean, T., Juranka, P., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitivity+of+N-type+calcium+channel+currents.">Mechanosensitivity of N-type calcium channel currents.</a> Biophys J. 83, 2560-2574 (2002).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+single+neurons+by+irradiation+of+intracellularly+injected+dye.">Rapid killing of single neurons by irradiation of intracellularly injected dye.</a> Science. 206, 702-704 (1979).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J Physiol. 550, 159-167 (2003).</li></ol>

הפעילות של עניין כמה נוירונים כולל נוירונים GnRH (מבוסס על הפרשת הורמון) מתרחשת על סולמות זמן של שעות (5-7). לכן, תצורת התא כולו אינה הבחירה הטובה ביותר עבור כמה מטרות הניסוי בשל דיאליזה של שליחים תאיים על מצב התא כולו ההקלטה. מטרה נוספת של כל תא הקלטות מוגבלות בדרך כלל בעלי חיים על פחות מ 120 ימים של גיל. עם הגיל, ממברנות עצביות להופיע להתקשות, מה שהופך חותמות עמידות גבוהה קשה להשיג. בנוסף, אם אחד מקבל חותם עמידות גבוהה, פקיעת התיקון משבש את החותם, והשאיר חור בין פיפטה לבין הממברנה. זה מוביל הקלטה שמיש ו נוירון כי ימות בתוך זמן קצר בשל חוסר האיזון היוני. מחזורי ביוץ רגיל, ולכן הפעילות יציבה של הגנרטור הדופק GnRH אינה מתרחשת עד מאוחר יותר בחיים (7-10 חודשים גיל C57Bl6 נקבות, 11, 12), מעבר לגיל שבו אפשר לצפות באופן סביר להשגת כל תא הקלטות אמין. לבסוף, כל תא הקלטות להרוס את יחסי אנדוגני של ריכוזי יון פנימיים וחיצוניים. עם הקלטות התא כולו, את הריכוז הפנימי של כל יון שווה את ריכוז היונים בתמיסה פיפטה. הסיבה לכך היא פתרון פיפטה של ​​נפח גדול יחסית במהירות מגיע לשיווי משקל עם / מחליפה את אנדוגני נפח קטן יחסית של התא. הגישה לתא רופף המצורף עוקף רבים המגבלות של כל תא הקלטות. ראשית, חותם התנגדות נמוכה (15-30 MΩ) יכול לשמש. אלה הם קלים יחסית טופס גם נוירונים מבעלי חיים מבוגרים. שנית, אחד לא קרע את התיקון של קרום אטום. לכן, תא הקלטות רופף מצורף מבחינה טכנית הרבה יותר קל מאשר כל תא הקלטות. בנוסף, מאז קרום התא לא נפגע, דיאליזה של רכיבים תאיים אינה מתרחשת ויחסים יוניים אנדוגני נשמרים. אי אפשר להשתמש בגישה תא רופף מצורף ללימוד זרמים סינפטיים אבל הוא אידיאלי עבור לטווח ארוך הקלטות מתא עצב בצורה יחסית לא פולשנית. תאים המצורפת הקלטות גם יכול להתבצע באמצעות כל פתרון תאיים סטנדרטי פיפטה. זה מציע יתרון נוסף של פקיעת תיקון קרום כאשר הקלטה ארוך טווח הושלם תיוג נוירון עם סמן תאיים. הגישה לתא רופף מצורף נעשה שימוש במצב מתח, מהדק את ההקלטה. עם זאת, מתח-clamp הקלטה בתצורת תא רופף המצורפת יש בעיות מתודולוגיות שונות. ראשית, את האות מוקלט הוא אמצעי עקיף של פעילות. האות כי נמדד (כמו הפעולה שנקרא הנוכחי) הוא זרם קיבולי כי ההאשמות קרום (13). זוהי בעיה מתודולוגית חשובה ביותר. קיבול והתנגדות של טפטפת ההקלטה ניתן לסנן את האות מוקלט. ייתכן מאוד כי פעולה זרמים קטנים הם איבדו לחייב את הקיבול של פיפטה, אשר לא יכול להיות מתוגמל כראוי עם רוב מגברים, בשל התנגדות גבוהה של headstage. כאשר האותות הללו ללכת מבלי שיבחינו, דפוס ירי לכאורה של הנוירון אינו משקף את דפוס ירי אמיתי. כמו כן, פיפטה פיצוי ואת ההתנגדויות לגרום לשגיאות חותם משמעותי במהלך המדידות שינויים כגון כאשר זרמי פעולה באים לידי ביטוי (13). מגברים מסוימים לספק קיבול והתנגדות &quot;פיצוי&quot; על פיפטה ואת החותם, אשר מגביל אובדן האות, אך בראש מורם התנגדות שלבי ביותר מגברי לעכב פיצוי אופטימלי. שנית, מצב מלאכותי מוטל על התא. במצב מתח-clamp, האזור סביב קרום התא מוחזק הפוטנציאל קבוע, בכל המחקרים הללו, 0 mV. זה לא אומר שאין הנוכחית להחיל קרום התא. האות הנמדד מהדק מתח הוא למעשה כמות הזרם להחיל הממברנה כדי לשמור על פוטנציאל קבוע. לכן, הזרם הזה מיושם יכול לשנות את פעילות התא. הקלטות כפול במערכת GnRH הם מאתגרת במיוחד בשל המספר המוגבל של נוירונים GnRH והפצה מפוזר שלהם. עבור הקלטות כפול כדי להצליח, מניפולטור חייב להיות יציב מאוד. אפילו תנועה קלה של האלקטרודה יכול לגרום פיפטה לחמוק מן הנוירון ולסיים את ההקלטה. יתר על כן, התנועה של פיפטה על התא (לדוגמא, מיצוב מחדש, כדי לפצות על התנועה) יכול לשנות את דפוסי הירי. כמה תעלות יונים כגון N-type ערוצי סידן רגישים מכנית: למתוח את הקרום גורמת פעילות חוזרת ונשנית בתצורות הקלטה הן כל תא ותא המצורפת (14). לבסוף, מערכת מניפולטור חייב להיות מסוגל תנועה יפה מאוד וחלק. כפי שצוין לעיל, עם הקלטות כפול, אחד לוקח שני pipettes אל פני השטח של שני נוירונים שנבחרו קודם לכן באותו זמן ומנסה לאטוםנוירון אחד. אם מצליחים, ואז אחד מנסה לאטום את התא השני. ככלל, לא ניתן לצפות לאטום ויש לי הקלטה באיכות גבוהה עם כל ניסיון. עם זאת, יוצרת בעיה מסוימת עם הקלטות כפול. אם הוא מוצלח עם הנוירון הראשון אך נכשל עם השני, יש לשנות את פיפטה ולנסות תא שונים. לכן, חייב להיות מסוגל להעביר גם את המטרה טבילה של המיקרוסקופ לבין פיפטה לראש זלוף היטב (כדי לשנות את פיפטה) מבלי לשבש את נוירון אטום בהצלחה. הפיתוח שלנו ולהשתמש הגישה לתא מצורף רופף להקלטות כפול היא לקדם הטכניים העיקריים בלימוד נוירונים GnRH. זה עשוי להניב תוצאות שימושיות אשר יעזרו להזיז את השדה קדימה בהקשר של השאלה הקריטית של מה המנגנונים בבסיס פעילות מתואמת כי התוצאות הפרשת הורמון pulsatile.

dual somatic recordings from gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neurons identified by green fluorescent protein (gfp) in hypothalamic slices

גונדוטרופין, הורמון משחרר (GnRH) הוא neuropeptide קטן המווסת את בלוטת יותרת המוח לשחרר את הורמון luteinizing (LH) הורמון מגרה זקיק (FSH). Gonadotropins אלו הם חיוניים להסדרת פונקציית הרבייה. GnRH המכילים הנוירונים מופצים ברחבי diffusely ההיפותלמוס פרויקט לגדולה החציוני שם שחרור GnRH מ מסופי האקסון שלהם לתוך מערכת הפורטל hypophysiotropic (1). ב הנימים הפורטל, GnRH נוסע בלוטת יותרת המוח הקדמית כדי לעורר שחרור של gonadotropins למחזור מערכתית. שחרור GnRH אינו רציף אלא מופיע פולסים אפיזודי. היא מבוססת היטב כי בצורה מקוטעת של שחרור GnRH חיונית רבייה (2, 3). תיאום פעילות של נוירונים GnRH מרובים כנראה בבסיס פולסים GnRH. תוכן הפפטיד GnRH סך נוירונים הוא כ 1.0 pg / התא (4), מתוכם 30% סביר כוללת את בריכת releasable. רמות של GnRH במהלך דופק (5, 6), מציע נוירונים GnRH מספר מעורבים כנראה neurosecretion. כמו כן, פעילות יחידה אחת מופק רב יחידת הקלטות ההיפותלמוס במהלך LH לשחרר מציין שינויים בפעילות של נוירונים מרובים (7). אלקטרודות עם פעילות שנרשמו במהלך פולסים LH המשויכים somata או GnRH או סיבים (8). לכן, לפחות חלק בפעילות זו נובעת נוירונים GnRH. מנגנונים כי התוצאה ירי מסונכרן בנוירונים GnRH ההיפותלמוס אינם ידועים. הבהרת המנגנונים לתאם הירי בנוירונים GnRH היא בעיה מורכבת. ראשית, הנוירונים GnRH הם מעטים יחסית במספר. במכרסמים, יש 800-2500 נוירונים GnRH. אין זה ברור כי כל הנוירונים GnRH מעורבים שחרור GnRH אפיזודי. יתר על כן, הנוירונים GnRH מופצים diffusely (1). זה מסובך הבנתנו תיאום הירי עשה גישות טכניים רבים סורר. יש לנו אופטימיזציה רופף תאים המצורפת הקלטות במצב מהדק הנוכחי לאיתור ישיר של הפוטנציאלים לפעולה פיתחו גישה הקלטה המאפשר הקלטה בו זמנית של זוגות נוירונים GnRH.

Watch this Scientific Journal Video about Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices at JoVE.com

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

פעילות עצבית במערכות לעתים קרובות מחייב הפרשות סינכרוני פוטנציאל פעולה מתא עצב בתוך אוכלוסייה מסוימת. לדוגמה, פולסים של הורמון גונדוטרופין משחררים (GnRH) סביר לדרוש פעילות מתואמת בין הנוירונים GnRH. אנו מציגים גישה מתודולוגית שלנו אמין קבלת הקלטות אלקטרו סימולטני של נוירונים GnRH מופץ diffusely.

Dual סומטיים הקלטות מ-שחרור גונדוטרופין (GnRH) הורמון נוירונים מזוהה על ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב Slices ההיפותלמוס

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

dual-somatic-recordings-from-gonadotropin-releasing-hormone-gnrh

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

22.1K Views.  University of Texas San Antonio - UTSA. פעילות עצבית במערכות לעתים קרובות מחייב הפרשות סינכרוני פוטנציאל פעולה מתא עצב בתוך אוכלוסייה מסוימת. לדוגמה, פולסים של הורמון גונדוטרופין משחררים (GnRH) סביר לדרוש פעילות מתואמת בין הנוירונים GnRH. אנו מציגים גישה מתודולוגית שלנו אמין קבלת הקלטות אלקטרו סימולטני ...

Video: Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

תגובות סידן הדמיה בנוירונים GFP-tagged של פרוסות מוח עכבר ההיפותלמוס

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...