O desenvolvimento do DNA que se estende do ensaio foi auxiliado por Paulo Blainey, Lee Jong-Bong, e Hamdan Samir. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede a Charles Richardson (GM54397), e Antoine van Oijen (GM077248).

1. Modelo de replicação do DNA DNA para a reação é um DNA λ linearizada modificado por anelamento de oligonucleotídeos para formar uma forquilha de replicação. Além disso, biotina é anexado ao final de uma vertente do DNA λ, e uma porção digoxigenina está ligado à outra extremidade do fio mesmo 1. Materiais: Bacteriófago λ DNA, Oligonucleotídeos: braço garfo biotinilado (A: 5&#39;-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 &#39;), λ-complementares braço fork (B: 5&#39;-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3&#39;), primer fork (C: 5 &#39; -TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC-3 &#39;), fim digoxigenina λ-complementares (D: 5&#39;-AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA-digoxigenina-3&#39;), DNA Ligase T4, T4 polinucleotídeo quinase, bloco Heat. <ol><li> Fosforilar termina a 5 &#39;de oligonucleotídeos B e D utilizando Quinase Polinucleotídeo T4. </li><li> Recozer oligonucleotides A, B e C para o DNA λ em uma única etapa, adicionando um excesso de 10 vezes de oligonucleotídeos A e B, e um excesso de 100 vezes de oligonucleotídeo C em tampão T4 DNA ligase. </li><li> Aquecer a mistura a 65 ° C no bloco de calor. Uma vez aquecida, por sua vez o bloco de calor e deixe resfriamento lento corretamente anneal oligonucleotides. </li><li> Adicionar DNA ligase T4 à mistura e incubar à temperatura ambiente por 2 horas. Ligase T4 DNA vai catalisar a correta união de oligonucleotides A e B e DNA λ. </li><li> Finalmente, recozer a D oligonucleotídeo para o modelo de replicação do DNA pela adição de 100 vezes o excesso de oligonucleotídeo D com respeito ao DNA l em tampão T4 DNA ligase. </li><li> Incubar a mistura a 45 ° C por 30 min no bloco, calor e arrefecer à temperatura ambiente girando lentamente bloco calor fora. </li><li> O modelo de replicação final DNA está pronto para uso. Nós armazenar o modelo em uma concentração de 1,4 nM a 4 ° C por várias semanas. </li></ol> 2. Contas Contas são funcionalizados com um fragmento Fab, com especificidade para digoxigenina. Eles podem ser então anexado ao modelo de dois DNA de replicação. Materiais: Tosil contas ativado, α-digoxigenina fragmento Fab, tampão A: 0,1 M pH 9,5 H3BO3, tampão B: 0,1 M PBS pH 7,4, 0,1% w / v BSA, Buffer C: 0,2 M Tris-HCl pH 8.5 (25 ° C), 0,1% w / v BSA, separador magnético, Rotator. <ol><li> Ressuspender a solução estoque de contas e transferência de uma alíquota pequena dentro do tubo eppendorf. Colocar o tubo em um slot do separador magnético e incubar até que a solução limpa, em seguida, retire o sobrenadante por pipetagem. </li><li> Adicionar Um buffer, que irá ativar grupos tosila para acoplamento de anticorpos. Misture delicadamente por pipetagem e remover do buffer com o separador magnético. </li><li> Adicionar fragmento Fab e contas ressuspender novamente em tampão A, misture bem e incubar 16-24 horas a 37 ° C usando rotador. Após a incubação, contas separadas usando o separador magnético e remover buffer. </li><li> Lavar contas adicionando tampão B e incubar a 4 ° C por 5 min. Remover o buffer usando separador magnético. Repetir a lavagem duas vezes. </li><li> Adicionar tampão C e incubar a 37 ° C por 4 horas para bloquear grupos tosila livre. Contas separadas usando separador magnético e remover buffer. </li><li> Lavar duas vezes em tampão B e alíquotas para o uso. Contas podem ser armazenados a 4 ° C por 1 ano ou mais sem perda substancial de qualidade (nossa solução estoque contém 1 - 2x10 9 esferas / ml). </li></ol> 3. Lamelas funcionalizados Para permitir a ligação do DNA à lamela de vidro, o vidro é o primeiro funcionalizados com um aminosilane, que é acoplado a moléculas de PEG biotinilado. Este revestimento ajuda a reduzir as interações não específicas de DNA e proteínas de replicação com a superfície 3,4. Materiais: lamínulas de vidro, potes de coloração, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k NHS-éster, Biotina-PEG5k-NHSester, acetona, 1M KOH, Etanol, Forno sonicador Bath, <ol><li> Limpam-se as lamínulas de vidro, colocando-os na coloração frascos e encher os frascos com etanol. Sonicado por 30 minutos, enxaguar os frascos e encher com 1 M KOH. Repita os dois lavagens. </li><li> Para a reação de funcionalização em primeiro lugar, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Enchei as talhas de acetona e sonicate por 10 min. Vazio e encher novamente com acetona. </li><li> Prepare uma solução 2% v / v do reagente silano em acetona. Adicionar ao tinas de coloração e agitar por 2 minutos. Esta reação casais do grupo de alcóxi de aminosilane ao vidro, deixando uma amina reativos para a etapa seguinte de acoplamento. Saciar a reação com um grande excesso de água. </li><li> Seca as lamelas cozendo-los em 110 °; C no forno por 30 minutos. </li><li> Prepare um metoxi 50:1: biotina mistura PEG em 100 mM NaHCO 3 pH 8.2. Apontar para cerca de 0,2% PEG w / v biotinilado. </li><li> Pipetar 100 mL da mistura PEG em uma lamela seca silanizadas e colocar outra lamínula por cima. Incluindo um espaçador lamela de vidro vai permitir a separação das lamelas. </li><li> Incubar as lamelas na solução de PEG por 3 horas, em seguida, separe cada par de lamelas e lavar abundantemente com água. Tenha cuidado para manter as lamelas funcionalizados lateral-se como apenas o lado uma vez serão revestidas com PEG. </li><li> Seca as lamelas com o ar e armazenar sob vácuo em exsicador. As superfícies de permanecer estável por pelo menos um mês, assim que dezenas de lamelas podem ser feitas em um lote e usado quando necessário. </li></ol> 4. Preparação câmara de fluxo O experimento é realizado com uma câmara de fluxo simples construída com uma lamela funcionalizados, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubo. Uma câmara de fluxo está preparado para cada experimento uma única molécula de 2,4. Materiais: fita dupla face, lâmina de barbear, lâmina de quartzo com furos para tubos de epóxi, de secagem rápida, lamela funcionalizados, estreptavidina solução (25 mL de 1 mg / mL em PBS), tubulação, tampão de bloqueio (5X: 20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / mL BSA, 0,005% Tween-20), buffer de trabalho (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl). <ol><li> Comece por misturar e colocar 5 mL de tampão de bloqueio e 20 ml de tampão trabalhando em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. </li><li> Dê uma lamela PEG-funcionalizados e espalhar 125 de PBS-diluída solução de estreptavidina sobre a superfície. Deixar isso para incubar por 20 minutos em temperatura ambiente enquanto prepara outras partes da câmara, permitindo estreptavidina para ligar a Biotins superfície. </li><li> Corte um pedaço de fita dupla face para corresponder ao tamanho da lâmina de quartzo. Marcar a posição dos furos de tubos na fita para que um esboço da câmara de fluxo podem ser tiradas na fita. </li><li> Faça um canal central de 3 mm de largura e retângulos contendo dois buracos. Nós usamos câmaras de fluxo, com dois de entrada e duas de saída em forma de Y canais. </li><li> Corte ao longo do contorno desenhado, tornando reto, cortes limpos para garantir que nenhum sobressaia adesivo para o canal. </li><li> Limpe o quartzo, cuidadosamente, com acetona ou etanol para remover adesivo da construção anterior de fluxo de células. </li><li> Encontrar o melhor alinhamento do contorno do canal, remove um dos lados da camada adesiva e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina de quartzo. Tenha o cuidado de alinhar a fita corretamente, como os buracos de entrada e saída necessidade de permanecer desbloqueados. </li><li> Cortar comprimentos de tubulação para a entrada e saída da célula de fluxo. Isso ajuda a cortar a extremidade do tubo em cerca de um ângulo de 30 ° para que o tubo não vai pressionar plana contra o fundo de câmara. Colocar os tubos em algum tipo de apoio (suportes de tubos, por exemplo) para suspendê-las para fixação fácil a célula de fluxo nas próximas etapas. </li><li> Lavar a lamela estreptavidina revestida abundantemente com água e seque com ar comprimido. Lembre-se que apenas um lado é funcionalizada. Remover o outro lado do suporte de fita e colocar a lâmina de quartzo para a lamela. </li><li> Pressione levemente na lamela a empurrar para fora todo o ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar as bolhas de ar entrando no canal de fluxo. </li><li> Vedação dos lados da câmara com epóxi. Insira o tubo de corte nos orifícios do quartzo e foca no lugar com epóxi. Isso precisa secar por alguns minutos. </li><li> Depois de seco, comece a bloquear a superfície, puxando alguns dos desgaseificados tampão de bloqueio através de um dos tubos. A agulha calibre 21 se encaixa perfeitamente dentro do tubo de 0,76 milímetros. Lavar algumas vezes para remover bolhas de ar, e permitir que a câmara para incubar por pelo menos meia hora. </li></ol> 5. Única molécula Experiment Replicação Uma vez que o modelo de DNA e contas funcionalizados foram preparadas, ea câmara de fluxo está pronto, uma experiência única molécula pode ser realizada. Materiais: câmara de fluxo preparados, tampão de bloqueio (5X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg / mL BSA, 0,025% Tween-20) buffer, de trabalho (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl), buffers de replicação T7 com ou sem 10 mM MgCl 2 (1X: 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM K-glutamato, 2 mM EDTA, 100 mg / ml BSA, 10 mM TDT, 600 mM dNTPs), proteínas de replicação, microscópio óptico invertido com objetiva de 10X, câmera CCD, um ímã permanente de terras-raras, bomba de seringa, airspring, iluminador de fibra, computador com software de aquisição de imagem. <ol><li> Após a célula de fluxo foi bloqueado, ele está pronto para começar o experimento. </li><li> Pegue a célula de fluxo e colocá-lo no palco microscópio. Segure a câmara no lugar com clipes de estágioe certifique-se que o canal de fluxo é posicionado em alinhamento com a câmara CCD. </li><li> Conecte o fluxo de saída de tubos de célula para a airspring usando um tubo conector maior diâmetro ou uma agulha. O airspring é usado para estabilizar as irregularidades de fluxo. Um tubo de plástico de 50 ml é preenchida com 45ml de água. A tampa do tubo é selada com epóxi. Três buracos são perfurados na tampa, e três pedaços de tubos são inseridos no tubo. Usando epoxy, os tubos são, então, selados para a tampa, impedindo o ar de entrar ou escapar. O airspring está conectado à bomba de seringa, e os tubos de saída da célula de fluxo. </li><li> Coloque os tubos de entrada da célula de fluxo em tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover qualquer ar no tubo. Um filme suave do tubo de saída vai ajudar a limpar as bolhas de ar aprisionado na célula de fluxo. </li><li> Uma vez que todas as bolhas de ar foram removidos, a um quarteirão dos tubos de entrada com uma agulha, e um dos tubos de saída, dobrando-em 1800 e proteger o tubo com fita adesiva. </li><li> Diluir o modelo de DNA de ações para 22:00 em 1 ml de tampão de bloqueio desgaseificados. Fluxo para a câmara de fluxo moderado para permitir a cobertura boa superfície de DNA (0,01-0,05 ml / min por 20 minutos funciona bem). Isto pode ser variado com base em quantas moléculas de DNA estão na superfície para cada lote de lamelas ou quantos forem desejados para o experimento. </li><li> Diluir a solução estoque talão a 2 4x10-6 contas / ml em 1 ml de tampão de bloqueio desgaseificados. Fluxo para a câmara de 0,01-0,05 ml / min por 15 minutos. </li><li> Uma vez que contas são adicionados, por sua vez o fluxo e deixe câmara para alcançar o equilíbrio. Em seguida, fechar tubos tanto de saída. Quaisquer alterações aos tubos sem a câmara fechada vai causar flutuações de pressão que irá exercer uma força sobre as contas e corte as moléculas de DNA amarrados. </li><li> Bloquear o tubo de entrada que foi usado para carregar contas com uma agulha, e começar a lavar a célula de fluxo usando a entrada em segundo lugar com solução 1X desgaseificados de tampão de bloqueio em tampão de trabalho. Lavar exaustivamente a uma taxa de 0,01-0,05 ml / min. Agitar manualmente o palco tocando para remover quaisquer contas inespecificamente preso à superfície ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Tapping.avi">Tapping</a> ). </li><li> Uma vez que contas livres são suficientemente afastados, por sua vez o fluxo e deixe câmara para alcançar o equilíbrio. Fechar o tubo de saída aberta e mudar o reservatório de entrada para solução de proteína, lentamente abertura da tomada para evitar mudanças de pressão rápida </li><li> Você pode verificar se contas são amarrados ao DNA pela mudança de direção do fluxo ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/DNA.avi">DNA</a> ). </li><li> Agora, a reação enzimática pode ser realizada. Experimentos para a vertente levando-síntese de fazer a solução de 20nm de gp4 helicase e solução de 20nm GP5 polimerase (purificada como um complexo com o seu thioredoxin fator de processabilidade) em tampão desgaseificados replicação T7, que não contém MgCl 2. </li><li> Fluxo da solução de proteína na câmara a taxa de fluxo moderado para permitir a ligação eficiente de DNA. Usamos 0,037 ml / min durante 8 minutos, e depois 0,012 ml / min durante 7 minutos. </li><li> Lave a câmara com tampão desgaseificados replicação T7 sem MgCl 2 para remover proteínas livres. A taxa de 0,037 ml / min por 3-10 minutos funciona bem. </li><li> Após a lavagem, o fluxo de buffer de replicação T7 com MgCl 2 e começar a aquisição de dados. Use um fluxo de 0,012 ml / min, correspondendo a 3 força de arrasto sobre as amarras pN DNA em condições descritos neste protocolo. </li><li> Coloque um ímã permanente de terras-raras acima da célula de fluxo antes de imagem para evitar interações inespecíficas entre contas e de superfície. </li><li> Ver campo com uma objetiva de 10X e câmera CCD. Foco usando um cordão amarrado. </li><li> Posição de um iluminador de fibra em um ângulo de incidência entre 10 graus e paralelo ao estágio do microscópio perto do microscópio. Em campo escuro iluminação é usada para aumentar o contraste da imagem talão. </li><li> Aquisição de dados de 20 30 min em um frame rate lenta (tipicamente 2-4 Hz). </li></ol> 6. Resultados representante Em um experimento bem sucedido você deve ser capaz de observar mais de 100 contas simultaneamente ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Leading_strand_synthesis.avi">síntese vertente Leading</a> ). O experimento deve render numerosos vestígios exibindo a síntese de DNA levando vertente. Análise de dados: A fim de medir as taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização, as posições precisas de contas deve ser determinado. Você pode alcançá-lo pela montagem dessas posições com funções de 2-dimensional de Gauss. Trajetórias podem ser extraídas através do rastreamento posição grânulo em cada quadro usando software de rastreamento (DiaTrack por exemplo). Agora você está pronto para visualizar trajetórias traçando posição talão como uma função do tempo usando qualquer gráfico paraftware (Origin, por exemplo). Para obter dados de taxa, o ajuste das parcelas com uma regressão linear e calcular o declive. Para processabilidade, determinar o comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento (Figura 3). Ambos estes números terão de ser convertido em pares de bases. Para converter o movimento de contas para pares de bases, primeiro você precisa para medir o comprimento de uma molécula de DNA λ esticada na taxa de fluxo de reação. Uma vez que o comprimento do DNA λ é conhecido (48.502 bp), você pode calibrar o número de pares de base / pixel de força experimental. Para maior precisão, subtrair a partir de vestígios de interesse um traço fundamental de um corda do grânulo que não é enzimaticamente alterada. Combine todas as medições individuais e taxa de enredo e distribuições processabilidade. Ajustar os dados utilizando as funções de Gauss e single-exponencial, respectivamente (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Molécula única configuração experimental. (A) Duplex λ DNA (48,5 kb) está ligado à superfície da célula de fluxo através da extremidade 5 &#39;de uma fita usando uma interação biotina-estreptavidina, ea extremidade 3&#39; da fita mesmo é anexado a um cordão com um digoxigenina interação anti-digoxigenina. A forquilha de replicação está ferrado, formada na extremidade oposta o talão para permitir o carregamento da polimerase. (B) Bead-DNA conjuntos são distendidos com fluxo laminar de buffer e fotografada usando de campo amplo microscopia óptica. Ao rastrear as posições das contas ao longo do tempo, mantendo uma força constante de alongamento, os comprimentos das construções de DNA pode ser monitorado. (C) perfil de Extensão da ssDNA (círculo preenchido) e dsDNA (círculo aberto) sob forças baixo. A linha tracejada mostra duração cristalográfica da plena ds-DNA λ, 16,3 mM. A grande diferença de comprimento entre ssDNA e dsDNA em forças em torno de 3 pN permite uma observação direta de conversões entre ss-dsDNA e por acompanhar as alterações no comprimento do DNA. A visualização simultânea de um grande número de DNA-coupled contas permite o estudo de muitos replisomes individuais em um experimento. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 proteínas Bacteriófago T7 replicação:. DNA polimerase (complexo de GP5 e thioredoxin) e DNA helicase (gp4) sintetizar fita de DNA líder na presença de desoxirribonucleótidos e magnésio. Este processo é acompanhado pelo encurtamento da cadeia de DNA em atraso devido à enrolando. Conversão de dsDNA em ssDNA muda de posição do talão. Medir posição do talão permite a determinação precisa da velocidade e processabilidade de replicação do DNA. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Exemplo de dados típicos de uma única molécula-líder fio-experimento de síntese. Processabilidade da replicação do DNA é igual a um comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento. A taxa de replicação do DNA é obtido pela montagem do enredo com uma regressão linear e calcular o declive. A taxa mostra inset e distribuições processabilidade que foram obtidos pela combinação de dados de uma série de medições. Os dados foram equipados com funções de Gauss e single-exponencial, respectivamente.

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	<li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication.">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy.">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder.">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li></ol>

É importante assegurar que a força de arrasto exercida sobre contas pelo fluxo laminar não influencia atividades enzimáticas das proteínas de replicação. Por exemplo, uma força de 3 pN que corresponde a uma vazão de 0,012 ml / min não afetam a replicação do filamento de DNA de liderança. Isto, contudo, afetar as atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA coordenada, e, portanto, tem que ser reduzida para 1,5 pN. A força de arrasto pode ser facilmente controlado, alterando a taxa de fluxo...

<table><tbody><tr><td>Bacteriophage &amp;#955; DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-digoxigenin Fab</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Tosyl Activated Beads</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Separator</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces</td></tr><tr><td>Succinimidyl propionate PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.</td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>100 &amp;#x03BC;m thickness</td></tr><tr><td>Quartz slide</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)</td><td>Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>0.76 mm ID, 1.22 OD&lt;br/&gt;Other size tubing can be substituted.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>Make 1 mg/mL solution, 25 &amp;#x03BC;L aliquots in PBS pH 7.3</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Optical Microscope with 10X Objective</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>Permament rare-earth magnet</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>Operate in refill mode to facilitate solution changes</td></tr><tr><td>Fiber Illuminator</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

direct observation of enzymes replicating dna using a single-molecule dna stretching assay

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago. Linearizada λ DNA é modificada para ter um biotina na extremidade de um fio, e uma porção digoxigenina na outra extremidade do fio mesmo. O fim biotinilado é anexado a uma lamela de vidro funcionalizadas eo fim digoxigeninated para uma pequena pérola. A montagem destas amarras DNA-pérola sobre a superfície de uma célula de fluxo permite um fluxo laminar para ser aplicado a exercer uma força de arrasto na esfera. Como resultado, o DNA é esticada próximo e paralelo à superfície da lamínula, a uma força que é determinado pela taxa de fluxo (Figura 1). O comprimento do DNA é medida através do monitoramento da posição do talão. Diferenças de comprimento entre o DNA de um único e double-stranded são utilizados para obter informações em tempo real sobre a atividade das proteínas de replicação na bifurcação. Medir a posição do talão permite a determinação precisa das taxas e processivities de DNA descontrair e polimerização (Figura 2).

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Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

direct-observation-enzymes-replicating-dna-using-single-molecule-dna

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K visualizações.  Harvard Medical School. Nós descrevemos um método para observar a replicação em tempo real de moléculas de DNA individual mediada por proteínas do sistema de replicação bacteriófago.

Vídeo: Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Bioquímica

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have developed a simple non-labeled and non-radio-isotopic method using a matrix-assisted laser desorption ionization with time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analysis for a proofreading study. Here, a DNA polymerase [e.g., the Klenow fragment (KF) of Escherichia coli DNA polymerase I (pol I) in this study] in the presence of all four dideoxyribonucleotide triphosphates is used to process a mismatched primer-template duplex. The mismatched primer is then proofread/extended and subjected to MALDI-TOF MS. The products are distinguished by the mass change of the primer down to single nucleotide variations. Importantly, a proofreading can also be determined for internal single mismatches, albeit at different efficiencies. Mismatches located at 2-4-nucleotides (nt) from the 3' end were efficiently proofread by pol I, and a mismatch at 5 nt from the primer terminus showed only a partial correction. No proofreading occurred for internal mismatches located at 6 - 9 nt from the primer 3' end. This method can also be applied to DNA repair assays (e.g., assessing a base-lesion repair of substrates for the endo V repair pathway). Primers containing 3' penultimate deoxyinosine (dI) lesions could be corrected by pol I. Indeed, penultimate T-I, G-I, and A-I substrates had their last 2 dI-containing nucleotides excised by pol I before adding a correct ddN 5'-monophosphate (ddNMP) while penultimate C-I mismatches were tolerated by pol I, allowing the primer to be extended without repair, demonstrating the sensitivity and resolution of the MS assay to measure DNA repair.

A non-labeled, non-radio-isotopic method for DNA polymerase proofreading and a DNA repair assay was developed by using high-resolution MALDI-TOF mass spectrometry and a single nucleotide extension strategy. The assay proved to be very specific, simple, rapid, and easy to perform for proofreading and repair patches shorter than 9-nucleotides.

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genética

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Imagem do movimento de Cdc45 / MCM2-7 / GINS totalmente reconstituído (CMG)

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication forks. Obtaining a deep mechanistic understanding of the dynamics of CMG is critical to elucidating how cells achieve the enormous task of efficiently and accurately replicating their entire genome once per cell cycle. Single-molecule techniques are uniquely suited to quantify the dynamics of CMG due to their unparalleled temporal and spatial resolution. Nevertheless, single-molecule studies of CMG motion have thus far relied on pre-formed CMG purified from cells as a complex, which precludes the study of the steps leading up to its activation. Here, we describe a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed imaging at the single-molecule level of the motion of fluorescently labeled CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 different purified S. cerevisiae polypeptides. This assay relies on the double functionalization of the ends of a linear DNA substrate with two orthogonal attachment moieties, and can be adapted to study similarly complex DNA-processing mechanisms at the single-molecule level.

Autor em destaque: investigando a dinâmica de movimento dos componentes do replissoma eucariótico no nível de uma única molécula

We report a hybrid ensemble and single-molecule assay to directly image and quantify the motion of fluorescently labeled, fully reconstituted Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase on linear DNA molecules held in place in an optical trap.

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

<meta charset="utf8"></head><body>Desenrolamento de DNA mediado por CMG observado pelo crescimento do trato ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Desvendando a dinâmica da replicação do DNA eucariótico por meio da visualização de uma única molécula

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Visualização em tempo real de molécula única do desenrolamento do DNA por CMG helicase