Com este protocolo, podemos observar diretamente a clivagem do DNA específico do local por endonucleases de restrição no nível de uma única molécula. Nossa abordagem multiplexada nos permite medir o tempo que leva para centenas de REases individuais completarem o ciclo catalítico. A multiplexação nos permite gerar um tempo de permanência bem povoado para distribuições de clivagem que podemos ajustar com a distribuição de probabilidade gama para obter insights sobre o mecanismo de clivagem do DNA.
Comece preparando um novo tubo para cada oligonucleotídeo ressuspenso a 50 microlitros do oligonucleotídeo e 50 microlitros de solução de TDT recém-preparada para cada tubo, pipete para cima e para baixo para misturar e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Pipete todo o volume de cada sample mistura suavemente em uma coluna preparada e centrifugue a 750G por dois minutos. Após a centrifugação, armazene todas as amostras que não serão usadas imediatamente a 20 graus Celsius para evitar a oxidação dos grupos tióis e a formação de ligações dissulfeto.
Pipete uma alíquota de 50 microlitros do estoque de pontos quânticos em um dispositivo de diálise para cada construção a ser feita, tomando cuidado para não tocar na membrana com a ponta da pipeta. Dialisar contra um volume de tampão CHES que seja pelo menos 1.000 vezes o volume da amostra com agitação a 100 RPM por 15 minutos. Usando um pipetador, recupere cuidadosamente os pontos quânticos suspensos do dispositivo de diálise e transfira-os para um novo tubo contendo um volume igual de solução Sulfo-SMCC recém-preparada, pipetando para cima e para baixo para misturar.
Incubar por 1 hora em temperatura ambiente com agitação a 1.000 RPM para permitir que o Sulfo-SMCC reaja com as aminas primárias nos pontos quânticos. Em seguida, use um pipetador para transferir cuidadosamente cada amostra para um novo dispositivo de diálise. Para remover o excesso de Sulfo-SMCC, dialise contra um volume de tampão CHES que seja pelo menos 1.000 vezes o volume contido no dispositivo de diálise com agitação por 15 minutos.
Troque o tampão duas vezes e realize a diálise com tampão CHES novo três vezes no total, permitindo que a diálise prossiga por 15 minutos após cada troca de tampão. Em seguida, repita a diálise com PBS. Usando um pipetador, recupere cuidadosamente a solução contendo os pontos quânticos do dispositivo de diálise e transfira cada amostra para um novo tubo contendo uma quantidade equimolar de oligonucleotídeo dilatado diluído em PBS.
Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação a 1 000 RPM. Adicione BSA a cada amostra para uma concentração final de 0,5 miligramas por mililitro. Em seguida, use um pipetador para transferir cuidadosamente cada amostra para um novo dispositivo de diálise e dialisar contra o tampão de armazenamento.
Após a diálise, recupere cuidadosamente cada amostra e coloque-a em um novo tubo. Armazene as amostras a 4 graus Celsius. Combine uma amostra de oligonucleotídeos marcados com pontos quânticos com um excesso molar dez vezes maior de oligonucleotídeo biotinilado.
Aqueça a mistura em um bloco de calor a 75 graus Celsius e mantenha-a nessa temperatura por 5 minutos. Em seguida, desligue o bloco de calor e deixe a mistura esfriar lentamente. Armazene a construção concluída a 4 graus Celsius Usando uma multiferramenta rotativa portátil equipada com uma broca de roda de ponta de diamante cônica, faça dois furos em cantos opostos da corrediça de quartzo para servir como entrada e saída.
Certifique-se de prender a corrediça no lugar, lubrifique a broca e deslize constantemente com água durante a perfuração. Após cada experimento, recupere a lâmina de quartzo preparada embebendo o dispositivo usado em acetona para dissolver o adesivo e o epóxi. Descarte os componentes restantes.
Combine 25 microlitros de solução de estreptavidina com 80 microlitros de PBS e 20 microlitros de tampão de bloqueio. Cubra uma lamínula tratada com PEG com esta mistura e incube em um ambiente úmido por 30 minutos. Durante a incubação da lamínula, prepare o espaçador de imagem para criar um canal de fluxo.
Corte um pedaço quadrado de 1 polegada de material espaçador de imagem e, em seguida, marque um canal de 2 milímetros de largura alinhado às extremidades dos orifícios perfurados na lâmina de quartzo. Corte o canal do material espaçador com um bisturi. Limpe bem a lâmina de quartzo com acetona para remover quaisquer restos de adesivo de experimentos anteriores.
Retire um lado do suporte do espaçador de imagem e coloque-o cuidadosamente na lâmina de quartzo, tomando cuidado para não cobrir os orifícios de entrada e saída. Lave a lamínula com água e seque com ar comprimido. Remova o outro lado do suporte do espaçador de imagem e coloque-o entre a lâmina de quartzo e a lamínula revestida com estreptavidina funcionalizada usando uma pinça de plástico para pressionar o conjunto e remover as bolhas de ar do adesivo.
Corte a extremidade da tubulação em um ângulo para garantir o fluxo livre da solução. Em seguida, insira um tubo de polietileno de 30 centímetros de comprimento em cada orifício da lâmina de quartzo. Segure os tubos no lugar com um suporte para tubos e, em seguida, use epóxi para selar os tubos no lugar e as bordas do dispositivo montado.
Uma vez que o epóxi tenha sido definido, insira a agulha romba em uma seringa vazia no tubo de saída do dispositivo e mergulhe a extremidade do tubo de entrada em um recipiente cheio com o tampão de bloqueio. Puxe o êmbolo da seringa para trás para encher o dispositivo com tampão de bloqueio. Em seguida, deixe o dispositivo incubar por pelo menos 30 minutos antes de usar.
Prenda o dispositivo microfluídico à placa do microscópio com fita adesiva. Coloque a objetiva em contato com a parte inferior do dispositivo e posicione a objetiva de forma que o campo de view fique dentro do canal microfluídico. Depois de conectar o tubo de saída à bomba da seringa, lave o canal microfluídico com um novo tampão de bloqueio puxando o êmbolo da seringa para trás.
Verifique se não há bolhas presas na tubulação ou no canal. Dilua 1 microlitro do substrato de DNA preparado em 1 mililitro de tampão de bloqueio. Coloque o tubo de entrada no substrato de DNA diluído e flua 800 microlitros da solução de substrato através do canal a uma taxa de 200 microlitros por minuto.
Deixe a solução de DNA incubar no canal por 15 minutos após a interrupção do fluxo. Após a incubação, flua pelo menos 800 microlitros de tampão de bloqueio através do canal a uma taxa de 200 microlitros por minuto para enxaguar o DNA não ligado do canal. Ajuste o foco do microscópio para que os pontos quânticos conectados à superfície fiquem claramente visíveis.
Lave o dispositivo microfluídico com 800 microlitros de tampão experimental sem magnésio a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por minuto. Adicionar a REase a uma alíquota de tampão experimental sem magnésio e misturar delicadamente por pipetagem. Fluxo de 800 microlitros de 400 unidades por mililitro de EcoRV através do canal a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por minuto.
Inicie o experimento fluindo o tampão experimental contendo magnésio e fluoresceína a uma taxa de fluxo de 200 microlitros por minuto. Comece a capturar dados imediatamente após iniciar a bomba de seringa. Pare a aquisição de dados após fluir 800 microlitros de buffer.
Depois de introduzir o substrato de DNA na célula de fluxo e lavar o excesso de DNA e pontos quânticos, normalmente existem milhares de pontos quânticos individuais em um campo de visão. Eles são fixados de forma estável à superfície do vidro e não sofrem escurecimento perceptível ou branqueamento significativo durante o experimento. Quando a REase fluiu através do canal na ausência de magnésio, pelo menos 95% dos pontos quânticos presentes no início do experimento ainda podem ser vistos no final do período de observação.
No entanto, quando o tampão contendo magnésio flui imediatamente após o REase, até metade dos pontos quânticos desaparecem no final do período de observação, semelhante ao que é observado quando o REase e o magnésio fluem juntos pelo canal. O desaparecimento do ponto quântico acontece rapidamente e resulta em uma diminuição acentuada na trajetória de intensidade, fornecendo uma indicação clara do tempo em que uma determinada molécula de DNA é clivada. Este experimento foi realizado com o P REase EcoRV tipo II bem estudado.
Tanto o ajuste da curva de mínimos quadrados não linear quanto a estimativa do parâmetro de máxima verossimilhança foram usados para extrair os valores de n e beta dos dados. Os dois métodos de estimação de parâmetros estavam de acordo. Usando o ajuste de mínimos quadrados não lineares, n foi de 3,52 e beta foi de 5,78 segundos.
Usando a estimativa de máxima verossimilhança, n foi de 3,41 e beta foi de 6,06 segundos. Este ensaio pode fornecer evidências da presença de etapas intermediárias ao longo da via de clivagem. A realização deste ensaio sob condições de reação variáveis pode ajudar a estabelecer a natureza dos intermediários de reação que não podem ser observados diretamente.
