Este estudo foi apoiado pela concessão # 0649883 da National Science Foundation, pelo Instituto Vanderbilt para Integrativa Biosystems Pesquisa e Educação (VIIBRE), e pela Biologia de Sistemas de Bioengenharia Searle e Experiência de Pesquisa de Graduação (Searle SyBBURE).

I. fabricação de dispositivos microfluídicos <ol><li> O primeiro passo para criar um dispositivo micro é para desenhar um layout de duas dimensões do dispositivo em um programa de desenho assistido computador (CAD). Temos usado o AutoCAD, mas outros programas de desenho também estão disponíveis, tais como CleWin, ou CorelDRAW. </li><li> O próximo passo é fabricar uma máscara de fotolitografia. Dependendo das dimensões do dispositivo, necessário resolução e orçamento, essas máscaras podem ser fabricadas em cromo (a mais alta resolução, alto custo), criado em filme fotográfico, ou mesmo impresso diretamente sobre uma transparência usando uma impressora de alta resolução. Aqui, nós usamos máscaras Cr fabricados pela Advance reproduções Corp, North Andover, MA. </li><li> O próximo passo é transferir o padrão da máscara para um epóxi fotossensíveis para criar um molde levantou-relevo. <ol><li> Primeiro, uma camada de fotorresiste SU8 negativo é girada sobre uma bolacha de silicone com a espessura desejada, e cozido para volatilizar o excesso de solvente. Velocidades fotorresiste formulação e spin controlar a espessura da camada depositada. </li><li> Então, o padrão é exposto a uma dose pré-determinada de luz UV através da máscara. A exposição pós bake ligações cruzadas nas regiões expostas à luz do revestimento fotorresiste, tornando-os insolúveis. </li><li> Em seguida é a etapa de desenvolvimento, onde não exposto resistir é removido com um desenvolvedor de produtos químicos, deixando uma estrutura levantou-relevo positivo chamado de mestre. </li><li> A etapa de cozimento terceira chamada um passo bake rígido é opcional para acertar as estruturas. </li></ol></li><li> Moldagem PDMS <ol><li> Nós usamos o silicone elastômero poli (dimetil siloxano) para moldagem réplica de dispositivos microfluídicos 1. Primeiro, o material base é misturado em uma proporção de peso 10:01 com o agente de cura, derramado sobre o molde em um recipiente raso como uma placa de Petri, e desgaseificado sob vácuo até que todas as bolhas visíveis são ido. </li><li> O mestre não curado com o PDMS é então colocada em um forno cuidadosamente nivelado por pelo menos 4h a 65 ° C para cross-linking do polímero para ocorrer. </li><li> Depois de PDMS é solidificado, a seção moldado é cortado da placa de Petri. Buracos são perfurados através do topo do dispositivo de acesso a espaços microfluídicos no dispositivo final. </li></ol></li><li> Fixação ao vidro <ol><li> Limpa PDMS é irreversivelmente ligado a limpar o vidro pela exposição ao plasma de oxigênio. Primeiro, o PDMS moldado e um soco e uma lâmina de vidro limpa são colocados superfície de ligação acima em um aspirador de plasma. Usamos um PDC-32G Harrick limpo plasma. </li><li> Após a câmara é fechada, o operador liga uma bomba de vácuo e então a frequência de rádio ou fonte rf. Plasma auto-ignição na câmara, evidenciada por um brilho ligeiramente roxo na câmara. </li><li> Após a exposição ao plasma por 30 segundos, a fonte de rf e depois a bomba de vácuo estão desligados. </li><li> Rapidamente, a lâmina de vidro e um dispositivo de PDMS são removidos da câmara e entra em contacto directo (lado da superfície moldado PDMS para baixo). Isto irá formar uma ligação irreversível, e também fará as propriedades da superfície hidrofílica. </li><li> Se desejar, química de superfície diferentes podem ser alcançados com PDMS através da imobilização de proteínas na superfície por adsorção ou ligação covalente. </li><li> O dispositivo pode ser preenchido com líquido, como água deionizada, meio de crescimento, ou artificial de águas subterrâneas por forças capilares ou uso de uma leve pressão com uma seringa. </li></ol></li></ol> II. Quantificação do fluxo de dispositivo micro por Análise Gravimétrica <ol><li> Para calibrar a pressão-driven fluxo no dispositivo, as células micro-estruturadas fluxo foram os primeiros pré-carregado com água DI. </li><li> Um reservatório de líquido que contém, como uma seringa de plástico ou o módulo de fluxo (mostrado na Figura 1) é conectado à entrada de upstream bem, ea altura de fluido no reservatório é mantido acima da altura na jusante bem. </li><li> As amostras são recolhidas no lixo bem em intervalos regulares e pesados ​​em balança analítica. </li><li> A inclinação da curva de plotagem volume total em função do tempo total dá a vazão média volumétrica (Figura 2). Foram encontradas reprodutível, linear velocidades médias para uma ampla gama de cabeças de pressão e de pressão diferentes manutenção de sistemas. </li></ol> III. Visualização de fluxo, mapeamento de velocidade, e hidrofílico / hidrofóbico de Interação <ol><li> Para calibração do modelo, 3 mm esferas de látex em ambas as fluorescentes Carboxy YG YG e Plain superfícies foram adquiridos a partir Polysciences, Inc. e foram diluídas em água DI para a concentração de sólidos de 0,01%. </li><li> Contas que flui através do habitats foram visualizadas em um Axiovert Zeiss 25 microscópio de fluorescência equipado com uma câmera Mightex BCE-B013-U monocromática. </li><li> Quadros individuais foram capturados em rápida sucessão e montados em filmes com o pacote de software ImageJ (Figura 3). </li></ol> IV. Dispositivo microfluídicos (EcoChip) para modelagem do crescimento de bactérias e Transportes <ol><li> Vibrio sp. GFP Kan, um não-patogênico verde organismo proteína fluorescente expressando foi cultivado por 14 horas em Luria-Bertani meio a uma concentração de aproximadamente 10 9 células / ml. </li><li> Bactérias no meio de crescimento foram introduzidos dispositivos EcoChip e permitiu a colonizar o dispositivo e estabelecer flocos e filmes durante a noite por 19 horas. </li><li> Em seguida, o meio de crescimento foi retirado dos poços e todos os habitats foram lavados com água do mar artificial (veja Wang et al. 2 para receita ASW), de modo que diferentes densidades de bactérias foram restantes em diferentes habitats. </li><li> Um habitat foi mantido selado com ausência de fluxo, enquanto as condições de fluxo lento foram mantidos nos 3 outros habitats. </li><li> Imagens de luz fluorescente e branco do crescimento bacteriano foram realizadas a cada 15-20 horas por um período de vários dias (Figura 4). </li></ol> Representante Resultados V. O módulo de fluxo fornece meios simples para regular e distribuir flui através de habitats múltiplos. Análise gravimétrica provou ser uma maneira fácil e simples para determinar as taxas de fluxo através das estruturas de habitat, que dependem da resistência hidráulica dos habitats e as diferenças de pressão entre a entrada ea saída dos poços. Para os experimentos de fluxo de talão temos observado muito maior acúmulo de talão nas superfícies do dispositivo para as contas uncarboxylated (Figura 2). Além disso, os grânulos de maior diâmetro, 6 e 10 mm, eram muito mais provável que se torne arrastado nas aberturas menores poros e começar a acumular-se no dispositivo. Taxas de fluxo mais rápido reduzida retenção de partículas e arrastamento. Durante os experimentos de crescimento de bactérias, a influência das condições de fluxo é claramente evidente. Forças de cisalhamento contínua às bactérias agregados juntos e flocos forma, e para não ser encontrado como células individuais. Transporte de grandes flocos bacteriana é um importante processo ambiental, que é extremamente difícil de estudar em um sistema macroscópico. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquemático mostrando características e funcionamento do módulo de fluxo. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Taxa de fluxo através do habitat estruturado conforme determinado pela análise gravimétrica para alturas de coluna diferente. Relação de altura de coluna: 60/40 = 1,5, relação de fluxo de taxa determinada: 1,04 / 0,71 = 1,46. Taxas de fluxo resultou para H = 40 mm é V = 0,71 mL / min e para H = 60 mm é V = 1,04 L μ / min. Média estimada velocidades lineares são 3.1 mm / s e 4,6 mm / s, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Transporte de contas 3um de látex com e sem carboxilação flui através do habitats estruturado. <img src="/files/ftp_upload/1741/1741fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Variação do crescimento de bactérias e formação de biofilme em função da densidade de sementes na presença de fluxo lento.

<ol>
	<li>Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+protozoa+through+narrow+channels.">Mobility of protozoa through narrow channels.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).</li></ol>

O sistema EcoChip é adaptável às necessidades de uma experiência individual. Novos mestres podem ser criados de forma relativamente fácil, e uma vez um mestre é fabricado, dispositivos adicionais exatamente replicado pode ser escalado como necessário. O módulo de fluxo é simples de usar, não requer nenhum equipamento especial ou conexões complexas, e pode ser modelado como uma cabeça simples queda de pressão-driven sistema de fluxo. Extensões adicionais para este trabalho estão em andamento, e incluem a c...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SU8-2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

window on a microworld: simple microfluidic systems for studying microbial transport in porous media

Crescimento microbiano e transporte em meios porosos têm implicações importantes para a qualidade das águas subterrâneas e de superfície de água, a reciclagem de nutrientes no meio ambiente, bem como diretamente para a transmissão de patógenos para abastecimento de água potável. Natural meios porosos é composto de uma topologia complexa física, química de superfície variada, dinâmica gradientes de nutrientes e receptores de elétrons, e uma distribuição irregular de micróbios. Estas características variam substancialmente ao longo de um escala de comprimento de mícrons, tornando os resultados de macro-escala investigações de transporte microbiana difícil de interpretar, e à validação de modelos mecanicistas desafiador. Aqui demonstramos como simples dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar interações microbianas com micro-estruturadas habitats, para identificar os processos-chave que influenciam os fenômenos observados, e de forma sistemática validar modelos preditivos. Simples, as células easy-to-use fluxo foram construídos a partir dos transparente, biocompatível e oxigênio-permeável de material de poli (dimetil siloxano). Métodos de fotolitografia padrão foram usados ​​para fazer micro-estruturadas mestres, e moldagem réplica foi usada para lançar células micro-estruturado de fluxo com os mestres. O projeto físico da câmara de célula de fluxo é adaptável às exigências experimental: microcanais podem variar de simples conexões lineares para topologias complexas com tamanhos recurso tão pequenas quanto 2 micra. Nosso modular EcoChip matriz de célula de fluxo possui dezenas de câmaras idênticas e controle de fluxo por um módulo de fluxo de gravidade-driven. Nós demonstramos que através do uso de dispositivos EcoChip, estruturas físicas e as cabeças de pressão pode ser mantida constante ou variada sistematicamente, enquanto a influência da química de superfície, propriedades dos fluidos, ou as características da população microbiana é investigado. Através de experimentos de transporte utilizando um não-patogênico, proteína fluorescente verde-expressando<em&gt; Vibrio</em&gt; Estirpe bacteriana, que ilustram a importância da estrutura do habitat, condições de fluxo e tamanho inóculo em fenômenos de transporte fundamental, e em tempo real de partículas em escala observações, demonstrar que a microfluídica oferecer uma visão convincente de um mundo oculto.

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Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar os complexos processos naturais em tempo real e nas escalas físico apropriado. Temos desenvolvido um dispositivo simples microfluídicos que imita características-chave de meios porosos naturais para o estudo de crescimento e de transporte de bactérias no subsolo.

Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.7K visualizações.  Vanderbilt University. Dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar os complexos processos naturais em tempo real e nas escalas físico apropriado. Temos desenvolvido um dispositivo simples microfluídicos que imita características-chave de meios porosos naturais para o estudo de crescimento e de transporte de bactérias no subsolo.

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biologia

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Usando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desenvolver ferramentas de diagnóstico

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Realizando lavado vaginal, Crystal coloração violeta, e avaliação citológica vaginal para Rato Identificação ciclo estral Staging

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.