O microambiente permite uma alta complexidade e dinâmica, incluindo citocinas em constante mudança, concentração e composição de ligantes. Criar um ambiente de cultura semelhante é crucial para estudos in vitro sobre máquinas de vida complexas, como diferenciação de células-tronco, respostas imunes e o desenvolvimento de órgãos em plataformas de chips. Mas gerar e fornecer sinais químicos de volume de nanoliter e precisão de milissegundos é difícil usando abordagens biomédicas convencionais como pipetação.
Para enfrentar os desafios, uma plataforma de cultura capaz de uma geração alternativa de aquisição de imagens de entradas dinâmicas de sinal combinatório e sequencial está em alta demanda. Neste protocolo, é apresentado o procedimento de design e fabricação de um dispositivo microfluido. O chip microfluido proposto consiste em 1500 unidades culturais, matriz de bombas peristálticas aprimoradas e módulo de mistura no local.
Demonstramos que a plataforma é adequada para estudos em células únicas populações de células bidimensionais e esferas neurais tridimensionais. As complexas e dinâmicas condições ambientais no chip têm grandes efeitos na diferenciação de células-tronco neurais e na auto-renovação. Os detalhes dos procedimentos de design e fabricação são os seguintes.
O design do chip foi realizado usando o software AutoCAD. Para se adequar ao tamanho do porta-placas no microscópio, o chip microfluido tem aproximadamente sete por cinco centímetros de tamanho e consiste em 1.500 câmaras de cultura. Uma das características importantes é que possui bomba peristáltica que consiste em oito canais de fluxo e canais de controle de 200 micrômetros de largura.
O aumento da área sobreposta entre o controle e o canal de fluxo aumenta 16 vezes em relação à bomba peristáltica, proposta por Stephen Quake em 2002, para cerca de 15 nanoliters líquidos e por ciclo de bombeamento e bastam as necessidades para manter 1.500 condições ambientais independentes paralelamente no chip. Outra parte importante do dispositivo é uma câmara de cultura de duas camadas, que pode manter o ambiente cultural livre de tesouras. O estresse de tesoura indesejado é evitado direcionando-o rapidamente através da camada superior.
As células, tecidos e meio condicional crucial permanecem intocados na camada inferior. A simulação numérica sugere que quando os líquidos são direcionados através de câmaras culturais, da esquerda para a direita. as forças de tesoura podem ser efetivamente evitadas.
Mesmo a uma taxa de fluxo de entrada de 10 milímetros por segundo célula ou tecido de tamanho de micrômetro permanecem intactos na parte inferior da unidade de cultura. Fabricamos a réplica de moldagem ou bolacha de silício usando litografia UV. Os canais fluidos de 25 micrômetros de altura e 100 micrômetros em peso são produzidos usando fotoresist negativo SU-8 3025.
As câmaras culturais de 75 micrômetros e 150 micrômetros de altura foram fabricadas utilizando-se fotoresist SU-8 3075. Fotoresist positivo AZ50X é usado para os recursos de poço em forma redonda que se sobrepõem aos canais de controle para garantir uma boa conexão. Para produzir o chip microfluido, os wafers de silício padronizados e em branco foram tratados em primeiro lugar com TMCS.
Diferentes quantidades de PDMS 10 para 1 de monômero para catalisador foram completamente misturadas e depuradas por uma a duas horas na câmara de vácuo a menos 0,85 megapascal. A camada de controle foi obtida pelo revestimento de spin PDMS a 2.200 RPM. Os wafers de silício foram então transferidos para a incubadora e incubados por 60 minutos a 80 centígrados.
Diferentes camadas foram alinhadas e unidas usando dispositivo óptico personalizado e máquina de gravura de plasma. Os buracos de entrada foram então perfurados após mais duas horas de ligação térmica a 80 centígrados. O chip foi ligado a um deslizamento de tampa revestido de PDMS, que é do mesmo tamanho de placa de 96 poços e curado por pelo menos 12 horas a 80 centrigrade antes de usar.
Para operação, os canais de controle foram conectados a válvulas solenoides pneumáticas em miniatura através de tubos plásticos. A transformação de todos os poços penumáticos foi controlada por um programa MATLAB personalizado através da interface gráfica do usuário. As pressões de fechamento ideais das válvulas de membrana PDMS de flexão foram determinadas individualmente para cada chip, que normalmente varia de 25 a 30 PSI.
Ao transformar todas as séries de poços dinamicamente combinatórios e sequenciais, podem ser gerados em chip. As células foram colhidas com 80% de confluência e resuspended com DMEM médio de cultura a uma densidade de cerca de 10 à potência de seis por mililitro, que foram então carregados no chip pressurizando a solução contendo células. Tanto para a cultura de aderente quanto para a cultura de suspensão das células-tronco neuro,células foram coletadas e as esferas foram diretamente carregadas no chip.
Para aquisição de imagens, foi utilizado um microscópio invertido com um estágio translacional automático e a câmera semicondutor de óxido de metal complementar digital. A aquisição de palco e imagem foi controlada através do software mostra o canto superior esquerdo e as câmaras inferiores do canto direito como pontos de seleção e movem o estágio translacional para os pontos ordenados para obter a imagem preliminar com lente objetiva 4x. Altere a lente objetiva 4x com a 20x 1 e ajuste os parâmetros de imagem, incluindo intensidade de luz, tempo de exposição, etc.
Em seguida, localize os pontos de seleção para que a posição de cada câmara deixe 13 por 15 matriz de câmara ou seja definida pelo programa automaticamente. Com a determinação das coordenadas das câmaras, o estágio translacional se move para cada câmara onde o plano focal X, Y, Z pode ser ajustado. Defina o intervalo e a duração do ciclo de imagem.
Salve o caminho e comece a fotografar. Este sistema está disponível para vários rastreamentos dinâmicos de alvo, como a diferenciação de células-tronco neurais em campo brilhante e o campo de fluorescência do processo de formação de células-tronco neurais. análise de dados.
Altere o formato em 22 para Tif usando o programa MATLAB personalizado. E divida os dados de acordo com os pontos. Selecionar objeto a ser analisado é célula ou tecido.
Digite o limiar, tamanho do objeto, tamanho do ruído para análise. Ou você pode escolher a análise passo a passo para parâmetros ideais. E então analisando todos os dados.
Depois de salvar o resultado no formato MAT, use o plot para desenhar os resultados ou traços. Neste artigo, descrevemos o protocolo da cultura do sistema de chips microfluido de alta produtividade baseado na tecnologia de fotolitografia para o controle dinâmico do microambiente de células vivas. Também descrevemos alguns parâmetros que se deve controlar cuidadosamente, como a pressão de fechamento das válvulas de membrana PDMS e o controle de giro do fluido em paralelo à câmara.
Na cultura in vitro celular tradicional o tratamento do ambiente de cultura celular é realizado manualmente, o que é demorado e trabalhoso e cheio de fluidos não é fácil de controlar. Particularmente minutos de solução. Existem alguns problemas como a geração de insumos, concentração de drogas imunológicas e grande consumo.
No entanto, usando nosso sistema microfluido, é possível repeti-lo como estimulador em uma dose fixa de fluido único igual quantidade de concentração uniforme, comparar diferentes culturas em diferentes câmaras culturais ao mesmo tempo. Diferente com alguma resolução temporal em miniatura de volta estímulo e com subsetação da resolução regulando o fluido. Além disso, nosso sistema pode obter um grande número de resultados experimentais comparativos por operações simples.
Nosso sistema é baseado no princípio da difusão, cria um mínimo distúrbio mecânico ao microambiente celular. Para chips de microambiente celular mais estáveis, você pode aumentar a lista da camada tampão como a profundidade da camada de cultura ou reduzir o fluido de entrada de troca média, ou seja, reduzir a pressão, que estará aqui para a pesquisa sobre o comportamento celular. Deve-se notar que este estudo examinou apenas a cultura das células 3T3 e NSC.
Para outras células ou linhas celulares, a cultura condições comparáveis com nossos parâmetros para ajustá-la.
