Este método permite o estudo sistemático da influência do tamanho dos poros e da taxa de fluxo no desenvolvimento do biofilme em meios porosos naturais e artificiais, assim, mecanismos fundamentais de bioentupimento de meios porosos podem ser desvendados. As principais vantagens das técnicas são a maior resolução espacial e temporal da alteração, e adaptabilidade da plataforma a uma gama de condições e requisitos experimentais. Comece ligando a incubadora da caixa do microscópio três horas antes do experimento para garantir uma temperatura estável de 25 graus Celsius.
Conecte a tubulação de entrada e saída ao dispositivo microfluídico. Fixe a ligação entre o tubo e a seringa inserindo uma agulha com um diâmetro exterior de 0,6 milímetros no tubo de entrada. Coloque o dispositivo microfluídico, 30 mililitros de água deionizada e 30 mililitros de meio de cultura em um exsicador a vácuo e desgaseifique-os por pelo menos uma hora.
Uma vez feito, puxe lentamente o meio de cultura e a água deionizada em duas seringas separadas de 30 mililitros. Em seguida, monte o dispositivo microfluídico no microscópio e coloque a tubulação de saída em um recipiente de resíduos. Conecte a seringa cheia de água deionizada ao canal microfluídico através da tubulação microfluídica e injete lentamente a água até que ela saia da saída do sensor de pressão.
Encha o sensor de pressão com água e lave todas as bolhas da tubulação que conecta o canal microfluídico e o sensor de pressão. Feche a saída do sensor de pressão com os parafusos dedicados ao sensor de pressão. Encha o restante do canal microfluídico com água deionizada.
Em seguida, coloque um filtro de 1,2 micrômetro na seringa do meio de cultura. Retire a seringa de água e conecte cuidadosamente a seringa à tubulação microfluídica de entrada. Depois de montar a seringa na bomba da seringa, lave o canal com o meio de cultura a uma taxa de fluxo de dois mililitros por hora durante uma hora.
Em seguida, ajuste a bomba de seringa para a vazão desejada durante o experimento e ajuste a leitura de pressão dos sensores de pressão para zero. Em seguida, pipetar um mililitro da cultura NCIB 3610 de Bacillus subtilis de uma densidade óptica de 0,1 a um comprimento de onda de 600 nanômetros em um frasco de centrífuga de 1,5 mililitro. Para carregar a cultura bacteriana no canal microfluídico, coloque o tubo de saída no frasco da centrífuga e aguarde cinco minutos para remover quaisquer bolhas de ar potenciais da saída do tubo.
Uma vez feito, retirar 150 microlitros de solução bacteriana a uma taxa de fluxo de um mililitro por hora até que o canal microfluídico seja preenchido com a cultura bacteriana. Em seguida, remova cuidadosamente o filtro da seringa do meio de cultura e coloque a saída no recipiente de resíduos. Deixar as células bacterianas em condições de fluxo zero no canal microfluídico por três horas para permitir sua fixação superficial no meio poroso.
Para iniciar o experimento, inicie o fluxo ajustando a bomba de seringa para a vazão desejada e inicie a leitura da pressão em um hertz antes de adquirir as imagens dos biofilmes em crescimento no intervalo de tempo, configuração óptica e ampliação desejados. O processo de formação do biofilme foi visualizado por microscopia de campo claro, onde as células bacterianas e o biofilme apareceram nas imagens como pixels mais escuros. Durante um experimento de 24 horas, o biofilme inicialmente de crescimento aleatório colonizou quase todo o meio poroso.
A cobertura superficial do biofilme ocorreu 10% mais rápida no menor tamanho de poro do que no maior tamanho de poro em 20 horas. A correlação da cobertura superficial do biofilme com o acúmulo de pressão mostrou que o entupimento no canal microfluídico de menor tamanho de poro levou a uma maior diferença de pressão entre a entrada e a saída do que no tamanho de poro maior. Os aspectos mais importantes a serem lembrados são executar o experimento em um ambiente estável à temperatura e desgaseificar bem o dispositivo microfluídico e as soluções, a fim de evitar a formação de bolhas.
Este método permite estudos sistemáticos para desvendar mecanismos fundamentais de crescimento de biofilme em meios porosos industriais e naturais no que diz respeito à influência da vazão e do tamanho dos poros.
