Atividade da fosfatase alcalina, deposição de cálcio e medidas do módulo de elasticidade em scaffolds derivados de maçã decelularizados

Para o ensaio de fosfatase alcalina e ensaios de deposição de cálcio, comece lavando os arcabouços de sementes de células, derivados de maçãs, cultivados no meio apropriado três vezes com PBS. Fixe os andaimes com formalina tamponada neutra a 10% durante 30 minutos. Para o ensaio de fosfatase alcalina, prepare a solução corante BCIP/NBT dissolvendo um comprimido de BCIP/NBT em 10 mililitros de água deionizada.

Em seguida, lavar os arcabouços fixos com uma solução de TWEEN a 0,05% e corar com a solução BCIP/NBT por 20 minutos à temperatura ambiente. Lave os suportes de manchas com uma solução de TWEEN a 0,05% e armazene-os em PBS. Em seguida, imagine os andaimes manchados com uma câmera digital de 12 megapixels.

Para o ensaio de deposição de cálcio, preparar 2% em peso em volume Alizarin Red S solução corante. Em seguida, lavar os andaimes fixos com água deionizada e corá-los com a solução de Alizarin Red S por uma hora à temperatura ambiente. Lave os andaimes corados com água deionizada e armazene-os em PBS antes da obtenção de imagens.

Imagem com uma câmera digital de 12 megapixels. Para realizar as medições do módulo de Young, remova os arcabouços de células semeadas de seus respectivos meios de incubação e teste imediatamente as amostras usando um aparelho de compressão uniaxial personalizado equipado com uma célula de carga de 1,5 newton. Comprimir os andaimes a uma taxa constante de três milímetros por minuto até uma deformação compressiva máxima de 10% da altura do andaime.

Determinar o módulo de Young a partir da inclinação da porção linear das curvas tensão/deformação. A coloração BCIP/NBT revelou um aumento substancial na atividade da fosfatase alcalina nos scaffolds de sementes celulares cultivados no meio de diferenciação em comparação com os scaffolds de cultura de células em branco ou sem diferenciação. Resultados semelhantes foram obtidos para a coloração S do Vermelho de Alizarina, indicando maior mineralização do cálcio nos scaffolds de sementes celulares cultivados em meio de diferenciação.

O módulo de Young dos scaffolds de células-semeados cultivados em meio de diferenciação foi em torno de 192,0 kilopascal, que foi significativamente maior do que os scaffolds de cultura de células-semeado em branco ou sem diferenciação, indicando maior rigidez.