Preparação e semeadura celular de andaimes derivados de maçã decelularizados

Para começar, use um cortador de bandolim para cortar maçãs McIntosh em fatias de oito milímetros de espessura. Corte o tecido do hipântio das fatias de maçã em quadrados de cinco por cinco milímetros. Colocar as amostras quadradas em SDS 0,1% por dois dias para descelularizá-las.

Após a incubação, lavar as amostras com água deionizada e incubá-las durante a noite em cloreto de cálcio 100 milimolares à temperatura ambiente. Em seguida, esterilize esses arcabouços em etanol 70% por 30 minutos. Lave-os com água deionizada e coloque-os em uma placa de cultura de 24 poços.

Para a semeadura celular, utilizar células MC3T3-E1 subclone 4 mantidas em placas de cultura celular tratadas com 10 centímetros de diâmetro em condições de cultura celular. Preparar também um meio de cultura celular composto de alfa MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino ou FBS e 1% de penicilina em estreptomicina. Quando as células atingirem 80% de confluência, desvincule-as das placas de cultura por tripsinização.

Centrifugar a suspensão celular a 200g por três minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meme alfa. Em seguida, pipetar alíquota de 40 microlitros da suspensão celular na superfície dos scaffolds, e deixar as células aderirem por uma hora em condições de cultura celular.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio de cultura a cada cultura. Reabastecer o meio de cultura a cada dois ou três dias por 14 dias. Após 14 dias, preparar o meio de diferenciação adicionando 50 microgramas por mililitro de ácido ascórbico e quatro milimolares de fosfato de sódio ao meio de cultura celular.

Adicione este meio à placa de cultura. Incubar os scaffolds por quatro semanas para induzir a diferenciação das células MC3T3-E1 e reabastecer o meio a cada três a quatro dias.