Medição do Tamanho dos Poros e Análise da Distribuição Celular de Scaffolds Derivados de Maçã Descelularizados por Microscopia Confocal de Varredura a Laser

Para começar, lave os andaimes de maçã decelularizados com solução salina tamponada com fosfato. Para medidas do tamanho dos poros, incubar os andaimes em um mililitro de solução branca de calcofluor a 10% por 25 minutos no escuro à temperatura ambiente. Depois de lavar os andaimes com PBS, use um microscópio de varredura a laser confocal ressonante de alta velocidade e defina a configuração do filtro de emissão a laser.

Ajuste a potência do laser e o detector manualmente para garantir a aquisição ideal da imagem. Adquira uma pilha Z de 20 imagens com um tamanho de passo de cinco micrômetros. Em seguida, no software ImageJ, use a função de intensidade máxima do projeto Z para criar uma imagem e aplique a função localizar bordas para destacar a borda dos poros.

Trace os poros manualmente usando a ferramenta de seleção à mão livre. Encaixe cada poro como uma elipse e meça o comprimento do eixo principal. Compile todas as medidas e calcule o comprimento médio.

Para a análise da distribuição celular, após lavar os scaffolds de sementes celulares cultivados no meio apropriado três vezes com PBS, fixá-los com paraformaldeído a 4% por 10 minutos. Em seguida, lave bem cada andaime com água deionizada, permeabilize as células com uma solução de Triton X-100 por cinco minutos e lave novamente com PBS. Incubar os andaimes em um mililitro de ácido periódico a 1% por 40 minutos e enxaguar com água deionizada.

Em seguida, incube os andaimes mergulhando-os completamente em um mililitro de solução de coloração. Lave os andaimes com PBS e manche os núcleos celulares incubando os andaimes em uma solução DAPI de cinco miligramas por mililitro por 10 minutos no escuro. Lave bem novamente e guarde os andaimes em PBS.

Obtenha imagens dos scaffolds com sementes de células com um microscópio de varredura a laser confocal ressonante de alta velocidade com aumento de 10X usando as configurações mostradas aqui. Ajuste a potência do laser e o detector manualmente para garantir a aquisição ideal de imagens e adquira uma pilha Z de 20 imagens com um tamanho de passo de cinco micrômetros. Em seguida, use o software ImageJ para processar as imagens confocais e use a função de intensidade máxima do projeto Z para criar uma projeção máxima no eixo z para análise de imagens.

A quantificação das imagens de microscopia confocal demonstrou uma distribuição de tamanho de poros entre 73 e 288 micrômetros, com uma média em torno de 154 micrômetros. A maioria dos poros variou entre 100 e 200 micrômetros. Após o cultivo no meio de diferenciação, foram observados depósitos minerais nos scaffolds.

Os scaffolds com sementes de células apresentaram coloração branca opaca, sugerindo mineralização, o que não foi observado nos scaffolds em branco. Além disso, a análise confocal de microscopia de varredura a laser revelou uma distribuição celular homogênea dentro dos scaffolds.